发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定技术规程(DB15-T 2554—2022).pdf

ICS 67.080.01 CCS X10 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 25542022 发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定技术规程 Technical regulation for the isolation and identification of probiotic lactic acid bacteria derived from fermented tomato pomace 2022-04-25 发布 2022-05-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 25542022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。本文件主要起草人：杜瑞平、王潇、特日格勒、张兴夫、武晶晶、宋利文、云伏雨、张春华、羿静、康长清。DB15/T 25542022 1 发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了发酵番茄渣中益生性乳酸菌分离与鉴定的规范性引用文件、术语与定义、材料及操作规程等技术要求与规范。本文件适用于发酵番茄渣中益生性乳酸菌的分离与鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.35 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。益生性乳酸菌 lactic acid bacteria(LAB）能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸、无芽孢且具有益生性能的革兰氏染色阳性细菌的总称。发酵番茄渣 tomato pomace 生产番茄酱(汁)后的番茄渣（主要由果皮、种子和少量的残余果肉组成）经微生物发酵后的产物。序列比对 sequence alignment 为确定两个或多个序列之间的相似性或同源性，而将它们按照一定的规律排列，检测序列之间的相似性，从而发现生物序列中的功能、结构和进化信息的一种生物信息学方法。进化树 evolutionary trees 通过系统发育分析所推断出来的进化关系一般用分枝图表即进化树来描述，这个进化树就描述了同一谱系的进化关系，包括了分子进化、物种进化以及分子进化和物种进化的综合。4 材料 DB15/T 25542022 2 番茄渣来源 来自工厂的新鲜番茄渣。发酵番茄渣的制备与保存 每个聚乙烯塑料袋中称取100 g番茄渣，用真空包装机抽成真空并封口。每个处理设3个重复，于户外进行为期30 d、60 d和90 d的厌氧发酵，在第30 d、60 d和90 d分别取样，将样品装在无菌袋中，放入冰盒带回实验室尽快进行乳酸菌的分离。5 操作规程 菌株和细胞 5.1.1 菌株 指示菌：致病性的大肠杆菌（Escherichia coli ATCC25922），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。试验菌：从发酵番茄渣中分离出的乳酸菌。5.1.2 细胞 Caco-2细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。仪器设备 电子天平（感量0.01 g），超纯水系统，高压蒸汽灭菌锅（137，0.25 MPa），超低温冰箱（-50-86），恒温摇床，恒温培养箱，厌氧培养箱，普通离心机，紫外分光光度计，涡旋振荡仪，倒置荧光显微镜（40 x640 x），pH计，PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪，低温高速离心机（20000 g，8 10）。试剂与耗材 5.3.1 试剂 MRS琼脂培养基，MRS肉汤，MEM培养液，脑心浸出液培养基，细菌基因组DNA提取试剂盒，Agarose Gel DNA Extraction Kit，EcoT14 digest DNA Marker，DL2000 DNA Marker，Taq DNA聚合酶，琼脂糖，胎牛血清，青链霉素双抗，PBS缓冲液，胃蛋白酶，胰蛋白酶，胆盐，甘油、过氧化氢、氯化钠、浓盐酸、巯基乙酸钠、丙酮酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、甲醇等均为分析纯。5.3.2 耗材 T25细胞培养瓶，6孔细胞培养板，90 mm培养皿，15 mL/50 mL离心管，500 mL/250 mL锥形瓶，0.22 M滤膜，牛津杯，加样器，棉拭子等。5.3.3 溶液配制 见附录A。乳酸菌的分离、纯化和保藏 5.4.1 乳酸菌的分离 DB15/T 25542022 3 称取10.0 g发酵番茄渣加入放有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，置于恒温摇床中震荡30 min制备菌悬液并进行十倍梯度稀释，稀释液涂布于MRS平板上，37 厌氧条件下培养48 h。根据菌落的大小、颜色、形状及边缘特征将不同的菌在MRS平板上进行分离。5.4.2 纯化与保藏 将已经分离的菌株在 MRS平板上反复划线纯化。将纯化的单菌落接种于MRS肉汤中，37 厌氧条件下培养24 h，将菌液与60%的无菌甘油以7：3的比例混匀，密封后放置在涡旋震荡仪上震荡混匀，-80 保存。乳酸菌鉴定 5.5.1 形态学鉴定 按GB 4789.35的规定操作。5.5.2 分子学鉴定 5.5.2.1 DNA 提取 取出-80 冻存的乳酸菌菌株，室温融化后用接种环挑取适量菌液，采用三区划线法在MRS平板上划线进行活化。用接种环挑取单菌落到MRS肉汤中进行扩大培养，37 厌氧培养18 h用于DNA的提取，方法参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书。5.5.2.2 扩增 提取出的 DNA 用于 16S rDNA 序列的扩增。扩增引物为细菌 16S rDNA 基因序列通用引物，上游引物：27F 5-GAGTTTGAT CCTGGCTCA-3；下游引物：1492R 5-TACCTTGTTACGACTT-3。PCR 反应体系如下（50 L）：Template DNA，2 L；dNTP mixture，4 L；Taq(5 U L-1)，0.25 L；10PCR buffer(Mg2+-free)，5 L；MgCl2 (25 mol L-1)，3 L；27F(10 mol L-1)，1 L；1492R(10 mol L-1)，1 L；ddH2O，33.75 L。PCR反应条件：94 预变性5 min；94 变性1 min，53 退火1 min，72 延伸2 min，共30个循环；72 10 min。5.5.2.3 测序 PCR扩增产物电泳后，凝胶成像仪下观察，可以看到1500 bp左右的条带。PCR产物回收参照Agarose Gel DNA Extraction Kit说明书，回收产物送商业公司测序。5.5.2.4 序列比对 利用Blast(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将待测菌株的16S rDNA 序列与Genbank中已知细菌16S rDNA 序列进行比对。将测序结果与标准菌株的序列导入到ClustalX1.83中进行校准对齐，通过MEGA5.05将待测菌与标准菌的序列进行对比，计算出进化距离并用neighbor-joining 法建树，Bacillus subtilis NCDO 1769作为外群，采用Bootstrap法，重复次数为1000。益生性乳酸菌的筛选 5.6.1 耐酸性测定 将冻存乳酸菌活化后接种于MRS肉汤中。取5 mL菌液，1000 g 离心10 min，弃上清。加入5 mL无菌生理盐水混匀制成菌悬液。分别取1 mL菌悬液与9 mL人工胃液混匀，37 培养，在0 h、3 h取样，梯DB15/T 25542022 4 度稀释涂板计数计算存活率，每种菌3个重复。存活率=3 h的菌落数/0 h的菌落数100%，存活率大于10%即认定为可以耐受胃酸的环境。5.6.2 胆盐耐受性测定 将冻存乳酸菌活化后挑单菌落接种于MRS肉汤中。将菌液按5%的接种量接种于含0.0%、0.3%、0.5%和1.0%胆盐的MRS-THIO培养基中。37 厌氧培养24 h，分别测定不同胆盐浓度培养基的OD值来计算菌株对胆盐的耐受性。胆盐的耐受性=含有不同浓度胆盐的培养基的OD值/不含胆盐培养基的OD值100%，存活率大于10%即认定为具有胆盐耐受性。5.6.3 乳酸菌对 Caco-2 细胞粘附能力的测定 5.6.3.1 Caco-2 细胞培养 5.6.3.1.1 复苏培养 从液氮中取出Caco-2细胞冻存管，立即放入40 的水浴中摇晃融化。将细胞悬液吸入装有8 mL培养液的离心管中，300 g离心8 min，弃上清后加入12 mL的新鲜培养液，用移液枪吹打均匀后加到培养瓶中，于37、5%CO2培养箱中培养。5.6.3.1.2 传代消化 待细胞长到80%90%的时候进行传代。吸掉旧的培养液，用加了双抗的PBS洗两次，然后加入1 mL2 mL的胰酶，于37 放置2 min。显微镜观察，大部分细胞变为圆形后加血清终止消化，反复吹打直到细胞完全脱落。300 g离心8 min，弃上清后将细胞分装到培养瓶中培养。培养好后消化制成细胞悬液，加到放有盖玻片的6孔板中(2 mL/well)，待细胞贴壁后，吸掉旧的培养液，用不加双抗的PBS洗2次后用于粘附实验。5.6.3.2 粘附能力的测定 将冻存的乳酸菌活化，挑取单菌落接入 MRS 肉汤中厌氧培养 24 h。1000 g 离心 10 min，用无菌的PBS 洗 3 次后，用 MEM 培养液悬浮至 1.0108 CFU/mL，用于后续的粘附实验。分别取1 mL的菌液加入5.6.3.1.2所述6孔板中37 培养3 h后终止，用无菌PBS洗5次，洗掉未粘附的乳酸菌，室温晾干后加甲醇固定30 min，将盖玻片进行革兰氏染色，油镜下观察。每张盖玻片随机计数50个细胞上粘附的乳酸菌数量，每组3个平行。每个细胞上粘附3个以上乳酸菌即认定为具有粘附能力。5.6.4 抑菌能力的检测 5.6.4.1 菌株活化培养 5.6.4.1.1 乳酸菌活化培养 将冻存乳酸菌活化后挑取单菌落接种于MRS肉汤中。37 厌氧培养24 h后，1000 g离心10 min后取上清。5.6.4.1.2 致病菌活化培养 将冻存于-80 的Escherichia coli和Staphylococcus aureus分别在固体LB培养基和脑心浸出液培养基上划线。37 过夜后，挑取单菌落分别接种于相应的液体培养基中，37 培养24 h后备用。5.6.4.2 抑菌能力检测 DB15/T 25542022 5 分别取100 L Escherichia coli和Staphylococcus aureus菌液涂布于固体LB培养基和脑心浸出液培养基上，然后将牛津杯放于平板中央，每种乳酸菌做3个平行实验。在牛津杯的中央加100 L乳酸菌液，37 培养24 h后测定每种菌抑菌圈的直径（mm），结果用平均差标准差表示。对大肠杆菌的抑菌圈直径大于等于5.400.20即可认定为具有抑菌能力，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大于等于15.500.10即可认定为具有抑菌能力。DB15/T 25542022 6 A A 附录A （规范性）溶液配制 表A.1规定了溶液配制方法。表A.1 溶液配制 溶液名称 成分 制备 人工胃液 氯化钠 2 g 胃蛋白酶 3.5 g 超纯水 1000 mL 1N 盐酸调 pH 至 3.0，过滤除菌，4 保存。MRS-THIO 培养基 100mL MRS 培养基 0.2 g 巯基乙酸钠 121 高压灭菌 15 min。LB 培养基 酵母提取物 5 g 胰蛋白胨 10 g 氯化钠 10 g 超纯水 1000 mL 氢氧化钠调 pH 至 7.07.4，121 高压灭菌 15 min。Caco-2 细胞培养液 MEM 培养液 156 mL 丙酮酸钠 2 mL 青链霉素双抗 2 mL 碳酸氢钠 0.3 g 胎牛血清 40 mL 过滤除菌，4 保存。