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第 十 三 章 生 物 实 验 的 基 本 技 术 第 一 节 细 胞 学 实 验 技 术【知 识 概 要】一、玻 片 标 本 的 制 作 技 术 制 作 玻 片 标 本 对 认 识 生 物 体 的 形 态 结 构 具 有 重 要 意 义。玻 片 标 本 有 临 时 玻 片 标 本（如 涂 片、压 片、临 时 装 片）和 永 久 玻 片 标 本（如 永 久 装 片、切 片）。1.涂 片 法 涂 片 法 是 将 材 料 均 匀 地 涂 布 在 载 玻 片 上 的 种 制 片 方 法。涂 片 材 料 有 单 细 胞 生 物、小 型 藻 类、血 液、细 菌 培 养 液、动 植 物 的 疏 松 组 织、精 巢、花 药 等。涂 片 时 应 注 意：（1）载 玻 片 必 须 清 洁。（2）载 玻 片 要 持 平。（3）涂 层 须 均 匀。涂 抹 液 滴 在 载 玻 片 中 间 偏 右，用 解 剖 刀 刃 或 牙 签 等 涂 匀。（4）涂 层 要 薄。用 另 一 载 玻 片 作 推 片，沿 滴 有 涂 抹 液 的 载 玻 片 面（二 载 玻 片 夹 角 应 为 30。45）由 右 向 左 轻 轻 推 动，涂 成 均 匀 一 薄 层。（5）固 定。如 需 固 定 可 用 化 学 固 定 剂 或 干 燥 法（细 菌）固 定。（6）染 色。细 菌 用 亚 甲 基 蓝，血 液 用 瑞 氏 染 液。染 色 液 要 盖 住 全 部 涂 面。（7）冲 洗。用 吸 水 纸 吸 干 或 烤 干。（8）封 片。长 期 保 存 用 加 拿 大 的 树 胶 片 片。2.压 片 法 压 片 法 是 将 生 物 材 料 置 于 载 玻 片 和 盖 片 之 间，施 加 一 定 压 力，将 组 织 细 胞 压 散 的 一 种 制 片 方 法。压 片 法 的 一 般 过 程：（1）取 材。观 察 细 胞 分 裂，应 选 取 细 胞 分 裂 旺 盛、新 鲜 的 组 织 细 胞 为 材 料。如 根 尖、茎 尖 分 生 组 织、骨 髓 细 胞、花 药（花 粉 母 细 胞）。精 巢（精 母 细 胞）等。（2）固 定。材 料 固 定 可 根 据 需 要 而 定，取 材 后 立 即 压 片 观 察，可 不 作 单 独 固 定 处 理（与 染 色 同 步 进 行）；取 材 后 不 立 即 视 察，可 将 材 料 用 固 定 液（一 般 用 醋 酸 酒 精 固 定 液）固 定。固 定 2 24小 时（因 材 料 而 异）后 用 95%乙 醇 清 洗，保 存 于 70%乙 醉 中，备 用。（3）离 析。对 细 胞 不 易 散 开 材 料 用 水 解 分 离 液（如 IN HC1或 盐 酸 一 酒 精 液）处 理，一 般 处 理 6 20m in,解 离 后 经 水 漂 洗 后 方 能 染 色。（4）染 色。染 色 剂 种 类 很 多。观 察 染 色 体 常 用 醋 酸 洋 红 染 色 液 染 色。（5）压 片。将 材 料 放 在 载 玻 片 上，加 一 滴 清 水 或 染 液，盖 上 盖 玻 片 用 拇 指 轻 轻 压 片。（6）观 察。压 片 后，即 可 在 显 微 镜 下 观 察。3.装 片 法 装 片 法 是 将 生 物 材 料 采 取 整 体 封 固 制 成 玻 片 标 本 的 方 法，用 此 法 可 制 成 临 时 或 永 久 装 片。装 片 材 料 有：微 小 生 物 如 衣 藻、水 绵、变 形 虫、水 娘，植 物 的 叶 表 皮；昆 虫 的 翅、足、口 器，人 的 口 腔 上 皮 细 胞 等。装 片 法 制 作 时 应 注 意：（I）手 持 载 破 片 时，应 注 意 持 平，或 放 在 平 台 上。滴 水 时 水 量 要 适 当，以 恰 好 被 盖 玻 片 盖 满 为 度。（2）应 将 材 料 用 解 剖 针 或 镜 子 展 开 不 使 重 叠，展 平 在 同 一 平 面 上。（3）放 盖 玻 片 时，从 一 侧 慢 慢 盖 在 水 滴 上，防 止 出 现 气 泡。（4）染 色 时，将 一 滴 染 色 液 滴 在 盖 玻 片 的 一 侧，用 吸 水 纸 从 另 一 侧 吸 引，使 盖 玻 片 下 的 标 本 均 匀着 色。着 色 后，用 同 样 的 方 法，滴 一 滴 清 水，把 染 色 液 吸 出 后，在 显 微 镜 下 观 察。二、显 微 镜 基 本 实 验 技 术 1.低 倍 镜（4X 10X）的 使 用 方 法 显 微 镜 操 作 主 要 包 括 两 个 方 面：（1）光 度 调 节。正 确 对 光 是 能 否 成 功 地 观 察 到 物 象 的 首 要 条 件。对 光 时，先 把 聚 光 器 上 提，打 开 可 变 阑，转 动 反 光 镜，这 时 一 边 看 镜 内 视 野，一 边 调 节 聚 光 器 螺 旋，直 至 视 野 内 得 到 均 匀 而 明 亮 的 光 线。（2）焦 距 的 调 节。调 焦 时，先 把 观 察 的 切 片，用 推 进 器 对 正 通 光 孔 中 央。然 后 分 两 步 调 焦。先 用 粗 调 器 定 焦，用 左 眼 看 目 镜，使 粗 调 器 慢 慢 上 升，直 到 能 清 楚 地 看 到 标 本 为 止。随 后 调 节 细 调 器，使 镜 筒 微 微 升 降，至 物 象 更 清 晰 为 止。2.高 倍 镜（40X）的 使 用 方 法（1）将 在 低 倍 镜 中 找 到 的 物 象 欲 放 大 部 分 移 到 视 野 中 央。（2）转 动 物 镜 转 换 器，使 4 0X物 镜 对 准 通 光 孔，转 动 时 从 侧 面 注 视 物 镜，以 防 镜 头 紧 压 玻 片。（3）调 节 细 调 螺 旋，使 物 象 清 晰。3.油 镜（100X）的 使 用 方 法（1）先 用 低 倍 镜 找 到 欲 观 察 细 微 结 构，将 其 结 构 移 至 视 野 中 央 换 高 倍 镜。（2）下 降 镜 台，在 玻 片 标 本 上 滴 一 滴 香 柏 油，转 换 油 镜。从 侧 面 注 视 油 镜，把 镜 台 上 升，使 油 镜 头 浸 在 香 柏 油 滴 中。（3）转 动 细 调 螺 旋，使 物 象 清 晰，进 行 观 察。（4）观 察 完 毕，用 镜 头 纸 擦 去 油 镜 头 和 破 片 上 的 香 柏 油，再 用 少 许 二 甲 苯 或 乙 酸/无 水 乙 醇 把 镜 头 擦 干 净。4.安 装 指 针 的 简 易 方 法 将 目 镜 的 上 盖（一 片 透 镜）旋 下，剪 取 一 小 段 头 发（其 长 度 约 等 于 目 镜 的 半 径），用 镒 子 夹 住 一 端，将 另 一 端 蘸 少 许 中 性 胶，将 其 粘 在 目 镜 内 壁 的 金 属 光 栏（一 铁 圈）上。稍 干 后，旋 紧 上 盖，即 可 使 用.三、单 细 胞 的 计 数 方 法 在 细 菌 培 养 和 体 外 细 胞 培 养，以 及 环 境 监 测 血 液 检 查 中 常 常 需 要 统 计 细 菌、细 胞、单 细 胞 藻 类、原 生 动 物、血 细 胞、花 粉 等 数 量。细 胞 计 数 方 法 的 原 理 是 把 一 定 体 枳 的 细 胞 液 体，在 显 微 镜 下 直 接 计 算 其 个 数，利 用 所 得 结 果 推 算 出 每 毫 升 水 体 中 的 单 细 胞 数。具 体 方 法 如 下：1.水 滴 计 数 法 用 管 口 圆 而 平 滑、大 小 适 宜 的 吸 管，吸 取 1m L水，然 后 测 定 这 一 吸 管 1m L水 可 滴 出 多 少 滴 水（反 复 测 定，直 到 准 确 为 止）。这 样 可 以 计 算 出 该 吸 管 滴 出 的 每 一 滴 水 的 体 积。用 吸 管 取 样 时.，如 果 单 细 胞 是 活 动 的 要 用 碘 杀 死 后，再 计 数；如 果 样 品 浓 度 太 大，计 数 困 难，按 倍 数 稀 释 到 适 宜 的 浓 度；另 外，取 样 前 必 须 搅 拌，搅 拌 后，立 即 取 样。取 样 后，在 显 微 镜 下 计 数，得 到 一 滴 水 中 细 胞 数 的 平 均 值 后，可 依 下 列 公 式 求 出 1 m L水 体 中 所 含 细 胞 的 数 目。1mL水 体 中 含 细 胞 数=计 数 平 均 值 X 定 量 吸 管 每 毫 升 的 滴 数 X 稀 释 倍 数 2.血 球 计 数 板 计 数 法 血 球 计 数 板 是 由 一 块 厚 玻 片 特 制 而 成，其 中 央 有 两 个 计 数 室。每 个 计 数 室 划 分 出 9个 大 方 格（见 下 图），每 格 面 积 1mm2,加 盖 玻 片 后 的 深 度 为 0.1mm。因 此，每 大 方 格 容 积 为 0.1mm。另 外，中 央 大 方 格 以 双 线 等 分 为 2 5个 中 方 格。每 个 中 方 格 又 分 16个 小 方格，供 细 胞 计 数 用。-p计 数 板 计 数 室 盖 玻 片 N Q“(VSSM IM SB!8(M Me B Y H”，X 嫉 3 4血 球 计 数 板 的 构 造 1.顶 面 观 2.侧 面 观 3.放 大 后 的 网 格 4.放 大 后 的 计 数 室 计 数 方 法：首 先 用 吸 管 吸 取 少 许 稀 释 倍 数 的 单 细 胞 悬 液，从 盖 片 端 滴 一 小 滴（不 宜 过 多），液 体 自 行 向 内 渗 入，静 置 数 分 钟 后，再 放 在 微 镜 下 观 察 计 数。一 般 选 取 计 数 室 内 四 个 角 及 中 央 五 个 中 方 格（80小 方 格）计 数，若 细 胞 位 于 小 方 格 的 线 上，应 遵 循“数 上 线 不 数 下 线，数 左 线 不 数 右 线”的 原 则，以 减 少 误 差。计 数 应 重 复 3 次，取 其 平 均 值。数 完 毕 后，依 下 式 计 算：每 1mL悬 液 细 胞 数 或 每 克 细 胞 数=8 0 个 小 方 格 细 胞 总 数/80 X 400X 10000X稀 释 倍 数 四、显 微 测 微 尺 的 应 用 方 法 显 微 测 微 尺 是 在 显 微 镜 下 测 量 生 物 细 微 结 构 的 测 微 工 具，用 它 测 量 细 胞 各 部 分 的 厚 薄 和 大 小。显 微 测 微 尺（见 下 图）包 括 目 镜 测 微 尺（目 尺）和 物 镜 测 微 尺（台 尺），测 量 时 须 将 其 配 合 使 用 方 可 达 到 测 量 目 的。目 镜 测 微 尺 为 一 圆 形 玻 片，玻 片 中 央 有 一 横 线 刻 有 大 小 格 的 等 距 离 线。物 镜 测 微 尺 有 一 特 制 的 玻 片，中 央 圆 圈 内 有 一 1 m m 长 分 为 100个 等 距 小 格 的 刻 线，每 一 小 格 即 lOumo显 微 测 微 尺 测 量 方 法：首 先 须 算 出 目 镜 测 微 尺 的 每 一 格 在 不 同 倍 物 镜 下 各 为 多 少 u m。即 取 下 接 目 镜 卸 下 透 镜，装 上 目 镜 测 微 尺。然 后 将 物 镜 测 微 尺 放 在 镜 台 中 央，眼 观 目 镜，调 好 焦 距，使 两 种 测 微 尺 上 的 刻 度 平 行 并 重 叠 在 一 起。按 下 面 公 式 计 算 出 目 镜 测 微 尺 每 格 的 实 际 长 度。目 镜 测 微 尺 每 格 的 长 度（Um）=物 镜 测 微 尺 的 格 数/目 镜 测 微 尺 的 格 数 X 10计 算 出 目 镜 测 微 尺 每 格 的 实 际 长 度 后，再 在 镜 台 上 放 上 需 要 测 量 的 物 体 标 本 或 玻 片 标 本，即 可 用 目 镜 测 微 尺 测 出 它 们 的 长 度。五、显 微 结 构 图 的 绘 制 技 巧 生 物 绘 图 是 科 学 记 录 的 一 种 方 法。绘 图 时 应 注 意：（1）绘 科 学 图 以 精 确 为 主，不 能 艺 术 加 工 渲 染。（2）只 在 纸 的 一 面 绘 图。绘 图 时 要 用 2 H 以 上 绘 图 铅 笔，纸 面 力 求 整 洁。（3）绘 图 大 小 适 宜，布 局 合 理。一 般 要 求 图 画 在 纸 的 稍 偏 左 侧，留 出 图 注 的 位 置。（4）图 的 各 部 分 的 位 置 和 比 例，应 与 显 微 镜 中 实 际 观 察 的 一 致，而 要 注 意 突 出 显 微 结 构 的 每 个 特 征。（5）显 微 构 造 图 的 点 线 不 要 重 复 描 绘。以 实 线 表 示 轮 廓，虚 线 表 示 被 遮 蔽 但 需 表 现 的 轮 廓，用 圆 点 的 疏 密 来 表 示 明 喑、凹 凸 等 层 次。点 点 时 笔 尖 直 立。点 的 大 小、疏 密 要 均 匀、整 齐、浑 圆。（6）绘 图 时，一 般 先 草 拟 轮 廓 图，经 检 查 无 误 后，再 以 准 确、清 晰 的 线 作 最 后 的 描 绘。【解 题 指 导】例 1 用 显 微 镜 观 察 洋 葱 根 尖 细 胞 的 有 丝 分 裂，要 看 清 各 时 期 细 胞 内 染 色 体 的 变 化 情 况，日 镜、物 镜 的 合 理 搭 配 应 该 是 ABCD目 镜（24X）、目 镜（5X）、目 镜（10X）、目 镜（24X）、物 镜（10X,物 镜（40X,物 镜（40X,N A0.25)N A0.65)N A0.65)物 镜(40X,N-A0.65)析 此 题 属 镜 像 亮 度 问 题。镜 像 亮 度 与 物 镜 镜 口 率（N A）平 方 成 正 比，与 总 放 大 倍 数 成 反 比。由 此，在 总 放 大 倍 数 相 同 情 况 下，要 使 物 像 亮 度 增 加，应 该 使 用 高 镜 口 率（N A）的 物 镜 与 低 倍 目 镜 配 合，根 据 这 一 原 理 应 选 择 C。例 2 在 观 察 显 微 镜 时，经 常 遇 到 以 下 5 种 现 象：（1）视 野 亮 度 晃 眼；（2）视 野 不 圆（3）对 光 时 视 野 中 出 现 窗 根、树 影 等 物 现 象；（4）只 见 视 野 不 见 图 像；（5）图 像 结 构 不 完 整，试 分 析 出 现 这 些 现 象 的 可 能 原 因，并 提 出 排 除 方 法。析（1）视 野 亮 度 晃 眼，可 能 原 因：反 光 镜 直 射 强 光 源；光 照 到 通 光 孔 上 缘。排 除 方 法：用 平 面 镜 斜 对 光 源；挪 镜。（2）视 野 不 圆 的 可 能 原 因：遮 光 器 或 转 换 器 没 有 转 到 头；遮 光 器 或 转 换 器 螺 丝 动。排 除 方 法：把 两 者 转 到 头（弹 簧 片 入 槽）;拧 紧 螺 丝。（3）对 光 时 视 野 中 出 现 其 他 物 象，其 可 能 原 因 是 镜 筒 太 高 或 太 低，调 节 一 下 镜 筒 即 可 消 除。（4）只 见 视 野 不 见 图 像，可 能 是 操 作 不 仔 细，低 倍 镜 头 偏 于 一 旁。排 除 方 法：将 低 倍 镜 头 对 准 通 光 孔。（5）图 像 结 构 不 完 整 的 可 能 原 因 是 未 根 据 材 料 的 不 同 折 光 性 用 光，应 调 节 光 圈 使 透 明 度 一 致。例 3 某 架 显 微 镜 由 于 磨 损，低 倍 镜 上 的 放 大 倍 数 看 不 清，而 高 倍 物 镜 尚 看 得 出 是 4 0倍，借 助 实 验 台 上 的 哪 些 材 料 可 帮 你 测 出 低 信 镜 的 放 大 倍 数？说 明 测 定 方 法。（实 验 台 上 有 显 微 镜、目 镜 测 微 尺、物 镜 测 微 尺、刻 度 尺、放 大 镜）析 此 题 可 利 用 显 微 测 量 技 术 测 定。利 用 实 验 台 上 的 显 微 镜 和 测 微 尺 进 行 测 量。由 丁 目 镜 测 微 尺 每 格 的 实 际 长 度 因 不 同 物 镜 的 放 大 倍 数 有 所 不 同，因 此 可 以 在 相 同 目 镜 下，测 量 变 换 高（40X）、低 倍 物 镜 下 的 视 野 直 径，由 于 放 大 倍 数 与 视 野 直 径 成 反 比，按 下 式 计 算 即 可 求 出 低 倍 镜 的 放 大 倍 数。高 倍 镜 放 大 倍 数/低 倍 镜 放 大 倍 数=低 倍 镜 视 野 直 径/高 倍 镜 视 野 直 径 例 4 在 一 黄 粉 岬 幼 虫 尾 部 4 5节 的 节 间 刺 一 针，用 毛 细 吸 管 取 1 4m L血 淋 巴，再 用 毛 细 吸 管 取 15 20m L生 理 盐 水，用 血 球 计 数 板 计 细 胞 数（区 别 脂 类 颗 粒、组 织 碎 片 与 细 胞），计 算 血 淋 巴 细 胞 浓 度 填 入 下 表。30min重 复 一 次（针 刺 部 位 前 移 一 体 节），60min：重 复 一 次（针 刺 部 位 再 前 移 一 体 节）。（1）将 有 关 数 据 填 入 下 表:时 间 间 隔（min）血 淋 巴 长 度（a）mL生 理 盐 水（b）mL细 胞 数（数 2 5个 中 方 格）细 胞 密 度（个/m L）03060（2）将 细 胞 下 告 度 变 化 绘 成 1 由 线，并 回 答 下 列 问 题：计 数 时 怎 样 处 理 压 线 细 胞？用 一 句 话 回 答。给 出 计 算 细 胞 密 度 的 公 式。用 一 句 话 回 答 为 什 么 血 盖 片 较 一 般 盖 玻 片 厚。（注 意：针 刺 幼 虫 时，食 指 与 中 指 夹 住 头 部，拇 指 按 住 尾 部，使 其 不 动。针 刺 不 要 过 深，不 要 挑 动，以 免 虫 死 亡 或 使 头 部 器 官 的 细 胞 或 杂 物 进 入 血 淋 巴。虫 不 可 死。）析 此 题 按 血 球 计 数 极 计 数 的 方 法 操 作，所 得 数 据 镇 入 表 中。根 据 绘 制 函 数 曲 线 原 理，以 时 间 间 隔 为 横 坐 标，细 胞 密 度（个/m L）为 纵 坐 标，绘 制 曲 线。在 计 数 时，对 压 线 细 胞 采 取“数 上 线 不 数 下 线，数 左 线 不 数 右 线”的 原 则 处 理。计 算 细 胞 数 方 法：每 m L悬 液 细 胞 数=8 0个 小 方 格 细 胞 总 数/80 X 400X 10000 X 稀 释 倍 数 血 盖 片 比 普 通 盖 玻 片 厚 是 因 为 要 盖 住 计 数 板 上 的 计 数 室 沟 槽。【巩 固 练 习】1.某 同 学 在 做 观 察 洋 葱 根 尖 细 胞 有 丝 分 裂 装 片 时，有 两 次 出 了 差 错。第 一 次 是 解 离 时 间 为 2min,第 二 次 是 60min。请 你 推 出 实 验 结 果 并 说 明 原 因。第 一 次 是 因,所 以 观 察 到 的 是。第 二 次，则 因,所 以。2.在 照 明 充 分 的 情 况 下，在 显 微 镜 视 野 内 可 看 清 洋 葱 鳞 茎 表 皮 细 胞 无 色 的 细 胞 壁,但 看 不 清 液 泡，为 了 能 显 示 细 胞 质 与 液 泡 的 界 面，此 时 应 _A 改 用 凹 面 反 光 镜，放 大 光 圈 B 改 用 凹 面 反 光 镜，缩 小 光 圈 C 改 用 平 面 反 光 镜，放 大 光 圈 D 改 用 平 面 反 光 镜，缩 小 光 圈 3.在 显 微 镜 视 野 中 观 察 玻 片 标 本，物 镜 测 微 尺 和 目 镜（5X）测 微 尺 在 0 点 处 重 合 时，物 境 测 微 尺 的 80格 与 目 镜 测 微 尺 的 55格 处 也 相 重 叠 时，试 问 目 镜 测 微 尺 一 格 的 长 度 是 u m；如 观 察 测 量 某 种 植 物 的 细 胞 大 小 时，测 量 其 长 为 7 个 小 格，那 么 此 细 胞 的 实 际 长 度 是 M m。4.撕 取 所 给 叶 片 的 下 表 皮，放 在 显 微 镜 下 观 察，绘 出 保 卫 细 胞 及 表 皮 细 胞 的 特 征。随 机 取 五 个 视 野 计 算 气 孔 数，取 其 平 均 值，计 算 气 孔 密 度（个/cm?）。（低 倍 物 镜 视 野 直 径 为 1.5mm,目 镜 统 一 用 10倍）第 二 节 物 理 学 和 化 学 分 析 技 术【知 识 概 要】、分 离 技 术 分 离 技 术 主 要 是 利 用 物 理 学 和 化 学 的 原 理 建 立 起 来 的 各 种 分 离、纯 化 方 法。常 用 的 分 离 技 术 有 以 下 几 种：1.纸 层 析 法 层 析 技 术 是 从 一 个 混 合 物 中 分 离 和 纯 化 一 种 或 几 种 生 物 化 合 物 的 最 简 便 的 方 法，用 滤 纸 为 支 持 物 的 层 析 法，叫 纸 层 析 法。纸 层 析 用 的 展 层 溶 剂 大 多 由 水 和 有 机 溶 剂 组 成。滤 纸 纤 维 与 水 的 亲 和 力 强，与 有 机 溶 剂 的 亲 和 力 弱，因 此 在 展 层 时，水 是 静 止 相，纸 是 静 止 相 的 支 持 物，有 机 溶 剂 是 流 动 相，它 沿 着 滤 纸 流 动。若 将 生 物 样 品（提 取 液）点 在 滤 纸 上（此 点 称 为 原 点）进 行 展 层，样 品 中 的 各 种 溶 质（如 叶 绿 体 中 的 四 种 色 素，各 种 氨 基 酸 等）即 在 两 相 溶 剂 中 不 断 进 行 分 配。由 于 它 们 的 分 配 系 数 不 同，不 同 溶 质 随 流 动 相 移 动 的 速 率 不 等，于 是 就 将 这 些 溶 质 分 离 开 来，形 成 距 原 点 不 等 的 层 析 点。纸 层 析 的 具 体 方 法：（1）制 样。将 样 品 经 研 磨、过 滤 制 备 成 提 取 液；（2）制 备 滤 纸 条。将 滤 纸 剪 成 长 10cm、宽 1cm的 纸 条。在 一 端 用 铅 笔 画 一 横 线（点 样 线）；（3）点 样。用 毛 细 吸 管 将 滤 液 沿 点 样 线 画 一 直 的 滤 液 细 线；（4）层 析：将 层 析 液（石 油 酸、丙 酮、苯 的 混 合 液）倒 入 烧 杯，然 后 将 滤 纸 条 靠 烧 杯 内 壁 轻 轻 插 入 层 析 液 中。（5）结 果。儿 分 钟 后，出 现 层 析 现 象。2.电 泳 法 电 泳 技 术 主 要 是 根 据 不 同 物 质 所 带 的 电 荷 的 数 量 和 性 质 不 同，因 而 在 电 场 移 动 中 的 速 度 和 方 向 就 不 同。生 物 分 子 如 氨 基 酸、多 肽、蛋 白 质、酶 和 核 酸 等 都 具 有 可 电 离 的 集 团，在 溶 剂 中 能 形 成 带 电 荷 的 分 子，由 于 在 不 同 的 溶 剂 介 质 中 所 带 的 电 荷 的 数 量 和 性 质 的 差 别，在 电 场 中 泳 动 的 速 度（迁 移 率）不 同，由 此 可 以 分 离 各 种 物 质 成 分。电 泳 的 方 法 很 多，有 纸 电 泳、琼 脂 平 板 电 泳、聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 等，其 中 较 简 单 的 是 纸 上 电 泳 法，它 是 用 滤 纸 作 为 电 泳 载 体 的 一 种 电 泳 方 法。纸 上 电 泳 一 般 操 作 过 程（以 分 离 血 清 蛋 白 为 例）：（1）仪 器 准 备。电 泳 设 备 主 要 是电 泳 仪 和 电 泳 槽（见 下 图）。电 泳 槽 是 供 两 极 电 泳 分 离 和 盛 装 缓 冲 液 之 用。电 泳 仪 提 供 可 控 电 源。般 采 用 电 压 在 100 5 0 0 V,电 流 在 0mA 50m A或 100mA。（2）配 制 缓 冲 液。缓 冲 液 的 种 类 很 多，可 用 0.5M、pH 5.6巴 比 妥 缓 冲 液 或 Ph8.6硼 酸 缓 冲 液。缓 冲 液 配 好 后 直 接 加 入 两 侧 电 泳 槽 中。（3）裁 剪 滤 纸。取 电 泳 滤 纸，按 2X 20cm剪 裁，于 一 端 约 1/3处 用 铅 笔 划 点 样 线，将 纸 用 缓 冲 液 浸 湿。（4）点 样。在 点 样 线 上，用 5 0 u L 微 量 注 射 器 点 样，一 般 为 10m Lo点 样 后，将 滤 纸 放 在 电 泳 槽 两 极 隔 板 上，两 端 浸 入 缓 冲 液 由（5）电 泳。接 上 电 源，按 滤 纸 长 和 宽 选 用 电 压（8 V/c m）和 电 流（0.4m A/cm）,以 点 样 线 一 侧 为 负 极，向 正 极 泳 行。（6）烘 干。取 下 电 泳 纸 条 在 烤 箱（9 0 C 105）迅 速 烘 干。（7）染 色。将 烘 干 滤 纸 条 浸 入 溟 酚 兰 染 液 lO m in,取 出 以 0.5%醋 酸 溶 液 脱 色，逐 渐 显 出 电 泳 带（8）比 色。将 各 条 区 带 滤 纸 剪 下，以 电 泳 空 白 滤 纸 为 对 照，在 分 光 光 比 色 计 上 比 色。（9）计 算。按 光 密 度 值 计 算 出 各 部 分 蛋 白 质 的 百 分 数。水 平 电 泳 槽 装 置 3.离 心 法 离 心 法 是 一 种 利 用 物 质 在 溶 液 中 的 密 度、大 小 和 形 状 的 不 同，以 及 它 们 沉 降 系 数、质 量、浮 力 因 子 等 方 面 的 差 别，通 过 强 离 心 力 的 作 用 使 其 分 离、浓 缩、提 纯 的 技 术，并 可 用 于 分 子 量 的 测 定。在 生 物 学 研 究 中，常 用 离 心 方 法 从 组 织 匀 浆 中 分 离 各 种 细 胞 器 及 各 种 蛋 白 质、核 酸 等 生 物 大 分 子。离 心 的 设 备 主 要 是 离 心 机，它 是 利 用 离 心 力 对 混 合 液 进 行 分 离 和 沉 淀 的 专 门 仪 器。离 心 机 的 种 类 很 多，有 低 速 离 心 机（4000/m in以 下）、高 速 离 心 机（4000 Y/m in以 上，20000 Y/m in以 下）和 超 速 高 心 机（20000 Y/m in以 h）。离 心 分 离 方 法 很 多，常 用 的 是 差 速 离 心 机，是 指 低 速 和 高 速 离 心 交 替 进 行，用 不 同 强 度 的 离 心 力 使 不 同 质 量 的 物 质 分 批 分 离 的 方 法。例 如，利 用 离 心 机 的 不 同 转 数（rpm,即 Y/m in）和 时 间，从 鼠 肝 匀 浆 中 分 离 各 种 亚 细 胞 组 分 的 过 程（下 图）：细 胞 核 沉 淀 在 O.25M蔗 澹 中 的 肝 匀 浆 13700rfXn 离 心 10 min沉 淀 I-0.25M蔗 糖 洗 3700rpm 离 心 lOtnin上 清 液 合 并 上 清 液 沉 淀+绒 毛 层 线 苞 体+绒 毛 层 沉 淀-溶 醉 体 沉 淀 0.25M蔗 糖 洗 6800rpm 离 心 Qnin沉 淀 6800tpn 离 心 IQnin-上 清 液 合 并-上 清 液 0.25M蔗 糖 洗 15000rpm 离 心 20nin1500Qpm 离 心 2(kninJ-上 清 液+绒 毛 层 I 合 并 上 清 液+绒 毛 层 微 粒 体 沉 淀 34000rpm 离 心 3Gmin-最 后 的 上 清 液 大 白 鼠 肝 脏 匀 装 分 级 分 离 各 种 亚 细 胞 组 分 图 解 二、测 定 技 术 1.定 性 测 定 比 色 法 生 物 材 料 化 学 成 分 的 测 定 技 术 很 多，在 生 物 学 实 验 中 最 常 用 的 简 便 方 法 是 比 色 法。比 色 法 是 利 用 生 物 组 织 中 的 有 机 物 与 某 些 化 学 试 剂 相 互 作 用，能 产 生 颜 色 反 应 的 原 理，可 以 根 据 颜 色 反 应 鉴 定 生 物 组 织 中 某 种 有 机 物 的 存 在。从 细 胞 组 织 中，鉴 定 有 机 物 的 常 用 比 色 法，参 见 下 表。成 分 试 剂 作 用 颜 色 反 应 还 原 糖 斐 林(F e h lin g)试 剂 使 自 由 醛 或 酮 基 的 糖 氧 化 产 生 棕 红 色 CU2。沉 淀 蛋 白 质 双 缩 胭 试 剂 肽 锭 在 碱 性 环 境 中 与 CuS04结 合 产 生 红 紫 色 的 络 合 物 淀 粉 碘 液 淀 粉 与 碘 结 合 蓝 色 反 应 脂 肪 苏 丹 HI酒 精 溶 液 脂 肪 与 苏 丹 HI结 合 红 色 反 应 维 牛 素 A 三 氯 化 睇 氯 仿 溶 液 与 SbCl3作 用 蓝 色 反 应 维 生 素&重 氮 化 氨 基 苯 磺 酸 溶 液 在 碱 性 溶 液 中 发 生 作 用 红 色 反 应 核 酸 亚 硫 酸 复 红 溶 液 与 DN A发 生 作 用 呈 红 色 或 紫 色 2.定 有 t测 定 滴 定 法 滴 定 法 是 将 一 定 浓 度 的 标 准 溶 液 滴 入 被 测 物 质 溶 液 中，当 反 应 到 终 点 后，根 据 所 用 标 准 溶 液 的 体 积 计 算 被 测 物 质 的 含 量，这 是 一 种 常 用 的 容 量 分 析 法。滴 定 法 常 用 的 仪 器 是 滴 定 管。它 是 带 有 刻 度 和 活 栓 的 玻 璃 管，用 它 放 送 已 知 体 积 的 溶 液。滴 定 法 的 一 般 操 作 技 术（以 维 生 素 C 定 量 测 定 为 例）：（1）样 品 制 备。将 样 品（洗 净 蔬 菜）2 0 g,加 2%草 酸 1 0 0 g,置 组 织 搅 拌 机 中 打 成 浆 状。称 取 5 g浆 状 物 倒 入 50mL容 量 瓶 中 以 2%草 酸 溶 液 稀 释 至 刻 度。静 置 lO m in,过 滤 备 用。（2）滴 定。标 准 液 滴 定：准 确 吸 取 标 准 抗 坏 血 酸（V c锻 1mL（含 O.lmgVc）置 100mL锥 形 瓶 中，加 9M1 1%草 酸，微 量 滴 定 管 以 0.1%2,6-二 氯 酚 靛 酚 滴 至 淡 红 色，并 保 持 15sec即 为 终 点。由 所 用 染 料 的 体 积 计 算 出 1mL染 料 相 当 于 多 少 m g抗 坏 血 酸。样 液 滴 定：准 确 吸 取 滤 液 两 份，每 份 10mL分 别 放 入 两 个 100mL锥 形 瓶 内，测 定 方 法 同 前。计 算：丫*丁/亚 义 100=10（）8 样 品 中 含 抗 坏 血 酸（V c）m g数 式 中：V=滴 定 时 所 用 去 染 料 毫 升 数。T=1m L染 料 能 氧 化 V c毫 克 数。W=10mL样 液 相 当 于 含 样 品 之 克 数。【解 题 指 导】例 1 叶 绿 体 中 色 素 的 提 取 和 分 离：（1）提 取 和 分 离 叶 绿 体 的 色 素，可 采 用 方 法。（2）用 毛 细 吸 管 在 滤 纸 上 划 出 滤 液 细 线 时，线 条 越 细 越 好，这 样 可 以 避 免,以 便 取 得 较 好 的。（3）叶 绿 体 b 为 黄 绿 色，层 折 后 的 位 置 是 在 滤 纸 条 的。（4）实 验 应 尽 量 在 通 风 处 进 行，实 验 后 一 定 要 将 手 洗 净，这 是 因 为。析 提 取 和 分 离 叶 绿 体 中 的 色 素 可 采 用 纸 层 析 法。在 点 样 划 线 时，越 细 越 好，这 样 可 避 免 色 素 带 之 间 部 分 重 叠，以 便 取 得 较 好 的 分 离 效 果。层 析 后，滤 纸 条 上 自 上 而 下 有 4 条 色 素 带。因 为 该 实 验 使 用 了 苯、丙 酮 等 有 毒 化 学 药 品，实 验 时 应 通 风，实 验 后 要 洗 手，确 保 安 全。例 2 在 鸡 血 D N A的 粗 提 取 与 鉴 定 实 验 中，请 回 答：（1）为 什 么 使 用 N aCl溶 液 离 析 DNA?（2）为 什 么 使 用 乙 醇 纯 化 DNA?（3）为 什 么 甲 基 绿 能 鉴 定 DNA?析 D N A在 N aC l溶 液 中 有 一 定 的 溶 解 度，并 随 着 N aC l溶 液 的 溶 度 变 化 而 改 变。当 N aC l的 质 量 浓 度 为 0.1 4 M/L时，D N A的 溶 解 度 最 低。利 用 这 一 原 理，可 促 使 溶 解 在 N aC l溶 液 中 的 D N A析 出。D N A不 溶 于 乙 醇，但 细 胞 中 的 某 些 物 质 可 以 溶 于 乙 醇。利 用 这 一 原 理，可 以 进 一 步 取 出 较 纯 净 的 DNA。D N A遇 甲 基 绿 会 被 染 成 蓝 绿 色。因 此,甲 基 绿 可 用 作 鉴 定 D N A的 特 定 试 剂。例 3 利 用 纸 电 泳 法 分 离 血 清 蛋 白。已 知 血 清 蛋 白 中 含 有 5 种 蛋 白 质，依 分 子 量 由 小 到 大 排 列 为 清 蛋 白 A、a a 2、B、Y球 蛋 白。试 问：（1）电 泳 后，滤 纸 上 出 现 几 条 区 带？离 点 样 线 最 远 者 是 什 么 蛋 白 质？说 明 其 原 因。（2）欲 计 算 各 部 分 蛋 白 质 的 百 分 数，请 说 明 计 算 方 法。析：电 泳 后，在 滤 纸 上 应 出 现 5 条 区 带，因 为 分 子 量 小 的 蛋 白 质，电 场 中 泳 动 的 速 度 快，也 就 是 迁 移 率 大。因 此，离 点 样 线 最 远 者 为 清 蛋 白 A,依 次 是 a2 B、y球 蛋 白。计 算 各 蛋 白 质 的 百 分 数，可 通 过 比 色 法 测 定，在 分 光 光 电 比 色 计 上 对 各 条 区 带 进 行 比 色，波 长 在 580nm 6 0 0 n m,记 录 各 自 的 光 密 度。然 后 按 光 密 度 总 利 T=A+a 1+a 2+B+Y的 各 光 密 度 值，计 算 出 各 部 分 蛋 白 质 的 百 分 数：清 蛋 白 A%=A/TX100；球 蛋 白 a 1%=a|/TX100其 他 蛋 白 质 依 次 类 推。【巩 固 练 习】5.在 实 验 台 上 有 天 平、100mL烧 杯、培 养 皿（6 个）、红 墨 水、I2-KI溶 液、苏 丹 IH溶 液、双 缩 胭 试 剂、显 微 镜、刀 片、镣 子、小 麦 种 子、菜 豆 种 子、翅 麻 种 子（将 以 上 种 子 分 出 一 半 浸 泡 使 部 分 种 子 刚 好 发 芽，然 后 将 每 种 种 子 浸 泡 过 的 和 干 燥 的 分 别 装 于 培 养 皿 中）。试 问：（1）绘 图 说 明 培 养 皿 中 各 种 材 料 各 部 分 的 结 构 名 称。（2）测 定 各 类 种 子 萌 发 所 需 的 吸 水 量（g 水/g种 子），并 写 明 实 验 过 程。（3）测 定 各 类 种 子 潜 在 的 萌 发 率（%）,并 写 明 实 验 过 程。（4）各 类 种 子 贮 存 有 机 物 有 何 特 点？依 据 是 什 么？6.研 磨 叶 肉 细 胞 后 放 入 离 心 管 中 离 心，细 胞 壁 和 核 物 质 沉 淀 在 管 底，这 些 沉 淀 物 为 Pl，上 清 液 为 S”将$倒 入 另 一 管 离 心，分 离 出 椭 球 或 球 形 颗 粒 P?和 上 清 液 S2。将 S2再 倒 入 另 一 离 心 管 离 心，分 离 出 棒 状 的 颗 粒 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