土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸).docx
土壤微生物生物量的测定方法 (氯仿熏蒸)土壤微生物生物量的测定方法1 土壤微生物碳的测定方法熏蒸提取仪器分析法1.1 根本原理颖土样经氯仿熏蒸后 24h，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用肯定体积的 0.5mol/LK2SO4 溶液提取土壤，借用有机碳自动测定微生物生物量碳含量。依据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数K EC，从而计算土壤微生物生物量碳。1.2 试验仪器自动总有机碳TOCShimadzu Model TOC500,JANPAN、真空枯燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。1.3 试验试剂1无乙醇氯仿CHCL3；20.5mol/L 硫酸钾溶液：称取 87g K2SO4 溶于 1L 蒸馏水中3工作曲线的配制：用 0.5mol/L 硫酸钾溶液配制 10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、下，1.4 操作步骤70ugC/L、100ugC/L 系列标准碳溶液。其实一般状况仪器会自带的标曲，一般不用自己做的1.4.1 土壤的前处理过筛和水分调整略1.4.2 熏蒸称取颖相当于干土 10.0g，这个可以依据自己土样的状况而定 3份分别放入 25ml 小烧杯中。将烧杯放入真空枯燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿约 2/3的 15ml 烧杯 2 或 3 只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有 NaOH 溶液的小烧杯，以吸取熏蒸过程中释放出来的 CO2，枯燥器底部参加少量水以保持容器湿度。盖上真空枯燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾 5 分钟。关闭真空枯燥器阀门，于 25黑暗条件下培育 24 小时。1.4.2 抽真空处理熏蒸完毕后，翻开真空枯燥器阀门应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做，取出盛有氯仿可重复利用和稀NaOH 溶液的小烧杯，清洁枯燥器，反复抽真空5 或 6 次，每次 3min，每次抽真空后最好完全翻开枯燥器盖子，直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的 3 份土壤，置于另一枯燥器中为不熏蒸比照处理。留意：熏蒸后不行久放，应当快速浸提 1.4.4 浸提过滤从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到 80ml 聚乙烯离心管中，参加 40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液土水比为 1:4，考虑到土样的缘由，此局部熏蒸和不熏蒸土均为 4g，即，4g 土：16ml 的硫酸钾溶液，固然这个参加量要依据 TOC 仪器的进入量打算300r/min 振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好马上分析，或 20冷冻保存但使用前需解冻摇匀留意这局部很重要，有争论结果说明：提取液假设不马上分析，请保存在 20，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用一般的定性或定量滤纸，以免长期杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个 0.2um 的滤头，一个才 1 元。1.4.5 TOC 仪器测定吸取上述土壤提取液 10ul这个要依据仪器自己的性能打算，但是一般状况下，在测定土壤滤液时候，要对其进展稀释，假设不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。注入自动总有机碳TOC 上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本试验室使用的有机碳 Shimadzu Model TOC-500,JAPAN为例。1.5 计算SMBC=(ECCHCL3ECCK)*TOC 仪器的稀释倍数*原来的水土比/0.452 土壤微生物生物量氮茚三酮比色法土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的 2%7%，是土壤中有机无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下2.1 根本原理茚三酮比色法Amato 和 Ladd1988争论说明颖土样熏蒸过程所释放出的氮，主要成分为 -氨基酸态氮和铵态氮，这两种氮形态可以用茚三酮反响定量测定，并觉察熏蒸与未熏蒸土壤提取的茚三酮反响态氮的增量，与其土壤微生物生物量碳之间存在显著的相关性。因此，人们承受熏蒸提取茚三酮比色法来测定土壤微生物生物量氮FE-Nnin。2.2 试验仪器分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空枯燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑 料管、离心管、漏斗等2.3 试验试剂1无乙醇氯仿CH3Cl；20.5mol/L (K2SO4)溶液：称取硫酸钾K2SO487g，溶于去离子水中，稀释至 1000ml；3） pH5.2 的乙酸锂LiOHH2O溶液：称取氢氧化锂LiOHH2O168g，加入冰乙酸优级纯279ml，加水稀释到 1000ml，用浓盐酸或 50%氢氧化钠溶液调整 pH 至 5.2。4） 茚三酮溶液：取 150ml 二甲基亚砜C2H6OS和乙酸锂溶液 50ml 参加4g 水合茚三酮C9H4O3H2O和 0.12g 复原茚三酮C18H10O62H2O搅拌至完全溶解；550%乙醇水溶液：吸取 50ml 99%乙醇于 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容；61mol/L 的硫酸铵(NH4)2SO4标准储存液：称取 4.7167g 分析纯硫酸铵称前 105烘 2h溶于 0.5mol/L 硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000ml，摇匀，于 4冰箱中保存。70.1mol/L 的硫酸铵(NH4)2SO4标准液：吸取 10ml 1mol/L 的硫酸铵标准储存液于 100ml 容量瓶中，用 0.5mol/L 硫酸钾溶液定容至 100ml，摇匀。此溶液最好现配现用。8工作曲线的制备：分别吸取 0.00ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml 0.1mol/L 的硫酸铵标准液于 100ml 容量瓶中，用 0.5mol/L 硫酸钾溶液定容至 100ml，摇匀，其浓度分别为 0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L 硫酸铵标准氮的系列溶液。2.4 操作步骤2 .4.1 土壤的前处理和 1.4.1 一样2.4.2 熏蒸和 1.4.2 一样2.4.3 抽真空处理和 1.4.3 一样2.4.4 浸提过滤从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到 80ml 聚乙烯离心管中，参加 40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液土水比为 1:4，考虑到土样的缘由，此局部熏蒸和不熏蒸土均为 2g，即，2g 土：8ml 的硫酸钾溶液300r/min 振荡 30min， 用中速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好马上分析， 或20冷冻保存但使用前需解冻摇匀留意这局部很重要，有争论结果表明：提取液假设不马上分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用一般的定性或定量滤纸，以免长期杂质会堵塞仪器的管路， 建议使用那种一次性塑料注射器，配一个 0.2um 的滤头，一个才 1 元。2.4.5 分光光度计比色测定此处沸水浴不好掌握吸取 0.5ml 样品提取液和标准工作液，分别置于 10ml 的塑料离心管中，参加 2ml 茚三酮显色剂，涡旋搅拌充分混匀，置于试管架上，在沸水中水浴 15min， 快速冷却冰浴约 2min，参加 5ml 稀释液50%乙醇水溶液，摇匀于 570nm下比色。2.5 结果计算SMBN=(ECCHCL3ECCK)*稀释倍数*原来的水土比*5土壤微生物生物量氮的测定全氮测定法,建议使用此法留意：所配的试剂和全自动凯氏定氮仪的试剂一样，具体见农化分析课本2 .4.1 土壤的前处理和 1.4.1 一样2.4.2 熏蒸和 1.4.2 一样2.4.3 抽真空处理和 1.4.3 一样2.4.4 浸提过滤从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到 80ml 聚乙烯离心管中，参加 40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液土水比为 1:4，考虑到土样的缘由，此局部熏蒸和不熏蒸土均为 4g，即，2g 土：16ml 的硫酸钾溶液300r/min 振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好马上分析，或20冷冻保存但使用前需解冻摇匀留意这局部很重要，有争论结果表明：提取液假设不马上分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用一般的定性或定量滤纸，以免长期杂质会堵塞仪器的管路， 建议使用那种一次性塑料注射器，配一个 0.2um 的滤头，一个才 1 元。2.4.5 全自动凯氏定氮仪的测定吸取 10ml 滤液与消煮管中，参加 K2SO4CuSO4Se 混合催化剂 1.08g， 参加 4ml 浓硫酸；同时设置 23 空白10ml 的 0.5mol/l 的 K2SO4，参加 K2SO4CuSO4Se 混合催化剂 1.08g，参加 4ml 浓硫酸；在高温消化340消煮 3个小时至澄清后放置 2-3h。然后用全自动凯氏定氮仪测定浸提液中的全氮含量。2.5 结果计算EN=(VS-VO)*CH2SO4*14*1000*(16/10)÷WS式中：EN 为全氮，VO 为滴定空白比照所消耗的标准硫酸体积留意：消煮一批土样至少需要 3 个比照，VS 为滴定土样所消耗的标准硫酸体积，CH2SO4 为硫酸浓度这个浓度要进展标定的，具体见农化分析课本，14 为氮的摩尔质量，1000 为千克转化成克，16/10 为从 16ml 的提取液中吸取 10ml，WS 为干土重所以： 土壤微生物生物量氮 Bn=(ENCHCL3ENCK)/0,54见土壤微生物争论原理与方法，主编：林先贵 中科院南京土壤争论所3 土壤微生物生物量磷无机磷测定法Brookes 等1982报道土壤熏蒸处理所释放出来的磷大局部为无机磷酸盐， 可被 0.5mol/LNaHCO3 等提取剂提取，而且熏蒸和未熏蒸土壤之间无机磷的差异，能够反映土壤微生物生物量磷的凹凸。于是，Brookes 等建立了土壤微生物生物量磷的熏蒸提取-无机磷测定法。3.1 根本原理颖土壤经氯仿熏蒸后24h，承受 0.5mol/LNaHCO3 溶液提取被杀死的土壤微生物生物量磷，在锑钼抗混合试剂作用下提取液中正磷酸与钼酸络合形成磷钼杂多酸在肯定酸度条件下，可用磷钼比色法测定提取液最好全磷含量。 依据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机磷量的差值和转换系数 kp，这个系数很重要，由于假设没有这个系数，所测定的结果就是土壤的速效磷，但是土壤微生物熏蒸后释放的磷大多数是无机磷，而速效磷包括全部水溶性磷、局部吸附态磷及有机态磷，有的土壤中还包括某些沉淀态磷，因此速效磷和无机磷的范畴不一样，不要搞混以及外加无机磷的回收率 Rpi作为校正系数，从而估算土壤微生物生物量磷。3.2 试验设备分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空枯燥器、离心机、烧杯、三角瓶、聚乙 烯塑料管、离心管、漏斗等3.3 试验试剂1无乙醇氯仿CH3Cl；20.5mol/L 碳酸氢钠NaHCO3浸提液：溶解 NaHCO342.0g 于 800ml水中，以 0.5mol/LNaOH 溶液调整浸提液的 pH 至 8.5，再用蒸馏水稀释至1000ml。此溶液曝于空气中可因失去 CO2 而使 pH 增高，可于液面加一层矿物油保存。检查此溶液储存于塑料瓶中比在玻璃瓶中简洁保存，假设储存超过一个月，应pH 是否转变；3） 磷酸二氢钾溶液【pKH2PO4=250 ug p /ml】：称取 1.0984g 分析纯磷酸二氢钾称量前 105烘 23h，溶于去离子水并定容至 1000ml；4） 钼锑抗试剂：间鲍士旦的土壤农化分析课本5） 磷标准液：准确称取在105烘箱中烘干的 KH2PO4分析纯0.2195g，溶解在 400ml 水中，加浓硫酸 5ml加硫酸放置霉菌，可是溶液长期保存，转入 1000ml 容量瓶中，加水定容至刻度。此溶液为 50ug/ml 磷标准液。吸取上述磷标准液 25ml，定容至 250ml，即得 5ug/mL 磷标准液此溶液不行久存6） 工作曲线：准确吸取 5ug/ml 磷标准液 0、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml 、 5ml 分别放入 25ml 容量瓶中，加水至约 20ml，然后加钼锑抗试剂 4ml，最终用水定容至 25ml。30min 后开头进展比色。各瓶比色液磷的浓度分别为 0ug/ml 、0.1 ug/ml、0.2 ug/ml、0.4 ug/ml、0.6 ug/ml、0.8 ug/ml、1.0 ug/ml 磷。3.4 操作步骤3.4.1 土壤的前处理和 1.4.1 一样3.4.2 熏蒸和 1.4.2 一样3.4.3 抽真空处理和 1.4.3 一样3.4.4 浸提过滤从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到 250ml 聚乙烯提取瓶中，参加 200ml 0.5mol/L NaHCO3 浸提液土水比为 1:20，考虑到土样的缺乏，这个局部称取 2g 土，比值为 2g 土：40ml NaHCO3，300r/min 振荡 30min，用慢速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好马上分析，或20冷冻保存但使用前需解冻摇匀。3.4.5 无机磷的回收率很重要另称取经前处理相当于干土 2.0g 土样 2 份，分别放入三个 50ml 聚乙烯提取瓶，参加 0.2ml 250 ug p/ml 磷酸二氢钾溶液，再参加 40ml 0.5mol/L 碳酸氢钠NaHCO3浸提液，同上进展提取。用于测定外加正磷酸盐态无机磷的回收率Rpi，以校正土壤对熏蒸处理所释放出来的微生物生物量磷的吸附和固定。土壤提取液也马上分析，或20冷冻保存但使用前需解冻摇匀。3.4.6 分光光度计比色测定吸取 10ml 提取液依样品的含磷而定于 25ml 容量瓶中，参加适量的 1.0mol/LHCl 溶液进展中和，HCl 溶液的参加量通常为提取液体积的 1/2，放置 4h 并间隙振荡，以排解溶液中的 CO2。补充去离子水至 20ml，参加 4ml 混合显色剂，再加水定容，摇匀。显色完全约 30min后，在 882nm 波特进步行比色。3.5 结果计算土壤微生物生物量磷 BP= Ept/Kp*Rpi单位为 mg/kg式中 Ept 为熏蒸和未熏蒸的土壤差值，即： (EPCHCL3EPCK),EPCHCL3EPCK=W1(分光光度计的值 )*2.5(容量瓶的稀释倍数 )*440nl 浸提液中取10ml*20水土比，Rpi=(外加 KH2PO4 溶液土壤的测定值未熏蒸土壤的差值)/25*100%,其测定和算法也是和 EPCHCL3EPCK一样；Kp 为转化系数，取值为 0.4
