技术丨PCR技术总汇!.docx
技术I PC R技术总汇!一、温度与时间的设置基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中 采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060z 引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075 ,在Taq DNA聚合 酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，除变性温 度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94乙变性，65左右退火与延 伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。1、变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要 原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性,若低于93则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能 使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。2、退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。 变性后温度快速冷却至40 60 ,可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链 之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列 的长度。对于20个核昔酸，G + C含量约50%的引物，55为选择最适退火 温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm 值(解链温度)=4(G + C) + 2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的 非特异性结合,提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec ,足以 使引物与模板之间完全结合。3、延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70 80 150核甘酸/S/酶分子70 60核昔酸/S/酶分子55 24核甘酸/S/酶分子高于9(TC时，DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在70 75(之间，常用温度为72,过高 的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片 段的长度而定，一般1 Kb以内的DNA片段，延伸时间1 min是足够的。34kb的靶序列需3 4min才广增10Kb需延伸至15mm.延伸进间过长 会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。二、循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓 度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量 亦随之增多。PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2 +一）、引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计 互补的寡核昔酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。1、设计引物应遵循以下原则：1 ）引物长度：1 5-30bp ,常用为20bp左右。2 ）引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的 片段。3 ）引物碱基：G + C含量以40-60%为宜，G + C太少扩增效果不佳，G + C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的瞟吟或口密陡 核甘酸的成串排列。4 ）避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互 补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。5 ）引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对， 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。6 ）引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶 切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。7 ）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。2、引物量：每条引物的浓度0.11umol或10100pmol ,以最低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增 加引物之间形成二聚体的机会。二）、酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天 然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100ul时）,浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则 合成产物量减少。三）、dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状，如 保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性 使用时应配成高浓度后， 以1 M NaOH或1 M Tris.HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5小量分装，-2（TC冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50200umol/L ,尤其是注意4种dNTP的 浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏 低）,就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2 + 结合，使游离的Mg2+浓度降低。四）、模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一传统的DNA 纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的 核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶 剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的 核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化 除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般 采用异硫氨酸肌或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA.五）、Mg2 +浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中， 各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5 2.0mmol/L为宜。 Mg2 +浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
