基因工程复习讲义.docx

第35讲基因工程内容比较知考向核心素养一提考能内容要求1 .概述基因工程的诞生2 .阐明基因工程的原理及技术(含PCR技术)3 .举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的应用4 .概述蛋白质工程的原理及应用5 .活动：DNA的粗提取与鉴定6 .活动：利用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验生命观念基因结构决定其功能；掌握目的基因的筛选与获取方法；理解蛋白质工程的原理科学思维建立基因工程的操作流程模型，掌握目的基因的检测与鉴定方法科学探究探究基因工程在生产上的应用和蛋白质工程的应用，掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法社会责任基因工程和蛋白质工程在生产实践上的应用与旧教材对比增：DNA的粗提取与鉴定；DNA片段的扩增及电泳鉴定；基因工程在食品工业中的应用。册基因文库的构建；基因枪法；基因治疗。改：PCR技术内容更充实；DNA重组技术改为重组DNA技术；限制性核酸内切酶改为限制性内切核酸酶。淡化：从基因文库中获取目的基因精减为一句话；农杆菌转化法变为资料卡。考点一重组DNA技术的基本工具考点自主梳理预习教材夯基础1 .基因工程的概念原理是基因重组(1)手段：按照人们的愿望,通过转基因等技术,赋予生物新的遗传特性。(2)目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(3)水平：分子水平。与杂交育种相比与诱变育种相比(4)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍,定向改造生物的遗传性状。2 .基因工程的基本工具3种工具，其中有2种工具酶(1)限制性内切核酸酶限制酶是一类酶，而不是一种酶鱼砂一主要存在于原核生物中4A/识别双链DNA分子的特定脱氧核定酸序列,并业”一使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开4品口一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核甘酸序列,也戋:"I并且能在特定的位点上切割DNA分子a息洵专一性"末端的喳"黏性末端和平末端提醒限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核昔酸组成,少数由4个、8个或其他数量的核普酸组成：后者是双链序列。判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°,同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不能是氢键。在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样，才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。(2)DNA连接酶Eco/iDNA连接式每(种类)T4DNA连接百年大肠杆菌(来源).T4噬菌体只缝合黏性末端(特点)黏性末端和平末端都可缝合将双链DNA片段缝合迎来，恢复被限制酶切开的两个脱氧核甘酸之间的遵矍二蹴一"rTGTAATTCI|/"I-1-1-1-InI/IICT亍A帮川(3)载体圾噬菌体、动植物病毒等i能在受体细胞中复制并稳定保存'具有一个或多个限制酶切割位点,便于外源DNA插入卜具有特殊的标记基因，便于DNA的鉴定和筛选II对受体细胞无害再山携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞内也曳尸对目的基因进行大量复制提醒与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。易错辨析(DDNA连接酶能将两碱基间的氢键连接起来(X)(2)EcoliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(X)(3)限制酶也可以识别和切割RNA(X)(4)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体(J)(5)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(J)(6)外源DNA必在位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制(义)深挖教材1 .DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？选择性必修3P72"旁栏思考题”提示不是。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核甘酸连接到已有的DNA片段上。2 .想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？选择性必修3P74“练习与应用”提示细菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA,是因为细菌在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。3 .天然的DNA分子是否可以直接用做基因工程载体？为什么？选择性必修3P72“内文信息拓展”提示不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。重点疑难突破突破疑难提考能1 .基因工程的理论基础外源基因在受体细胞内表达；基因是控制生物性状的遗传理论；物质的结构和功能单位上遗传信息的传递都遵循中心基础，法则；生物界共用一套遗传密码aII复（重组DNA：、转叠4=71翻造蛋白质制（载体+目的基切飞丝J：状）：DNA的基本组成单位都是四：种脱氧核甘酸基因拼接理论，DNA分子都遵循碱基互补配基础；对原则：双链DNA分子的空间结构都；是规则的双螺旋结构I2 .限制酶的选择方法根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。PstISma1PstIt抗病基因tSmaIEcoRI甲（1）应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PsrI；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SwI。（2）为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因所在片段和质粒（双酶切），如图甲可选择用PstI和EcoRI两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因,以用于重组DNA的鉴定和筛选，如图乙中的质粒不能使用SmaI切割。3 .标记基因的作用标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：目的基因Amp'进入受 体细胞在含有 氨不青 霉素的_ 培养基 上培养、含有抗氨芋 青霉素基因 的质粒有的大肠杆菌中 有载体进入，有 的没有载体进入只有含有载体, 并且载体上的 抗性基因表达 的大肠杆菌才 能存活并增殖4 .与DNA有关的几种酶的比较与DNAH作用底物：4乍用部位；，作用结果；有关的髀；1一一一一一一一WVVV|m2E|IDNA磷酸将DNA切成两个或限制酶J分子二酯键多个片段dna连DNA分磷酸将两个DNA片段连接1接酶子片段二酯键为一个DNA分子1以DNA单链为模板，DNA聚脱氧核磷酸将单个脱氧核甘酸依|合酶甘酸二酯键次连接到另一条短的单链末端DNA碱基对中将双链DNA分子局部怖耻臼母分子的氢键解旋为单链，形成两I条长链DNA水DNA磷酸将DNA片段水解为单解醐分子二酯键个脱氧核甘酸命题规律探究感悟高考找规律考向1结合基因工程所需工具酶，考查科学实践中的探究能力1.(2021福建三明质检)限制酶MunI和限制酶EcoR【的识别序列及切割位点分别是CITTAAG和一GAATTCo如下图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是目的基因CTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTC含目的基因的DNA片段答案A解析用限制酶M“I切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体，A正确；质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体，B错误；C、D质粒含有标记基因，但用限制酶切割后，标记基因会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体，C、D两项错误。2.(2016全国卷HI,40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EeRI.BamHI和Sau3AI三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRI、Sau3AI的切点是唯一的)。IIIGAATTC一GGATCCGATCCTTAAGCCTAGGCTAGt冈tt图(a)启动子EcoRI0s皿3AI终止子抗生素抗性基因图(b)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经I酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接，理由是(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有,不能表达的原因是图(c)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是答案（l）Sa“3Al两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录（3）E-coDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶解析（1）由于限制酶Sa"3AI与BamHI切割DNA后形成的黏性末端相同，所以经1酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3Al酶切后的产物连接。（2）在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因的产物。（3）常见的DNA连接酶有EcHiDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。考向2结合载体的作用及特点，考查科学思维的能力3.（2020南昌高三一模节选）质粒A和质粒B各自有一个限制酶EcoRI和限制酶I的识别位点，两种酶切割DNA产生的黏性末端不同。限制酶EeRI剪切位置旁边的数字表示其与限制酶BamHI剪切部位之间的碱基对数（bp）。在含有质粒A和B的混合溶液中加入限制酶EcoRI和7HI,令其反应充分；然后，向剪切产物中加入DNA连接酶进行反应，再将其产物导入大肠杆菌中。（实验中不考虑无”，的质粒、拥有两个或两个以上“i的质粒、两个或两个以上质粒同时进入大肠杆菌、三个或三个以上DNA片段发生连接）请回答下列问题：BainH IBa mH 1EcoR Iori：质粒复制原点；招f：四环素抗性基因；amp：氨年青霉素抗性基因；诙：基因产物在紫外线照射下可发出绿色荧光；lac：基因控制合成的半乳糖首酶可以水解乳糖(1)只拥有质粒A的大肠杆菌(填“可以”或“不可以”)在含有氨茶青霉素及乳糖作为唯一碳元素来源的培养基中生存。说明理由:(2)DNA连接酶进行反应后，存在种大小不同的质粒，有种质粒使大肠杆菌能够在含有氨羊青霉素及乳糖作为唯一碳源的培养基中生存。(3)绿色荧光蛋白基因是标记基因的一种，标记基因的功能是»答案(1)可以质粒A含有氨羊青霉素抗性基因，使大肠杆菌能够在含有氨茶青霉素的培养基中生存，还含有半乳糖昔醐基因，使大肠杆菌合成半乳糖甘酶，并水解乳糖获得能量和碳源(2)42(3)供重组DNA的选择和鉴定解析由题图可知，质粒A含有氨羊青霉素抗性基因和半乳糖甘酶基因，用EcoRI和酶切后，形成2000bp(含4叩)和1000bp(含/ac)两段；质粒B含氨节青霉素抗性基因、四环素抗性基因和绿色荧光蛋白基因，用EcoR【和I酶切后,形成3000bp(含amp、购)和2500bp(含fef)两段。由题干“两种酶切割DNA产生的黏性末端不同”可知，酶切后质粒自身两端不能连接。DNA连接酶进行反应后，由于实验中不考虑无。”的质粒、拥有两个或两个以上。的质粒、两个或两个以上质粒同时进入大肠杆菌及三个或三个以上DNA片段发生连接，因此可存在4种大小不同的质粒，即:质粒A两个片段连接3000bp(2000bp+lOOObp),质粒A含“i的片段和质粒B不含ori的片段连接4500bp(2000bp+2500bp)、质粒A不含ori的片段和质粒B含“i的片段连接4000bp(000bp+3000bp),质粒B两个片段连接5500bp(3000bp+2500bp)。有2种质粒使大肠杆菌能够在含有氨节青霉素及乳糖作为唯一碳源的培养基中生存，即考点二基因工程的基本操作程序考点自主梳理预习教材夯基础1 .目的基因的筛选与获取(1)筛选目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。(2)利用PCR获取和扩增目的基因原理：DNA半保留复制条件：参与的组分在DNA复制中的作用解旋甑(体外用高温代替)打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核甘酸合成DNA子链的原料耐高温的DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3,端开始连接脱氧核甘酸缓冲液维持反应体系pH稳定过程：PCR过程包括变性、复性和延伸三步温度上升到72t左右,在耐高温的DNA聚合醐作用下合成子链5'二3'e，, 3 '» JJ第一个循环合成 两个DNA分子>5：L3'需要扩增的 DNA序歹I5,3-3'"5'延伸PCR扩增仪士温度上升到，)七*以上，双链DNAV解聚为单链温度下降到5()七左右 !时复性,两种引物与 两条单链DN A结合5 uuuuuuuuuuu 3'3' nnnnnnnnnnn -，变性二5'Trri¥nrn|3复性PCR过程中不由字海我就*年寸高温皮才能打寸氮铺，但比叶的温质不会破坏腐敌二时铺.国此,双铳伪VA加热，变性育变为卓铳，并未分伸成卑林.结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2",其中为扩增循环次数)提醒在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg?+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+o2 .基因表达载体的构建一核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。组成提醒启动子N起始密码子终止子片终止密码子启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。起始密码子和终止密码子均位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。(3)构建过程限制酶切割位点启动子标记基因终止子复制原点质粒1$'）原点美配林以A复制的起始点，为<1$'）原点被破坏,«'1我秣将不能1料.目的基因限制施切割位点限制髓5D连接酶重组F胃7展取目的蠢因戊推人为涉子尹外止子之间为老虑两两和比则伪VAj!法的隹建。"A片帔金艺现三种而兄:S的基国与§的基因的隹桂、S的基国与良粒的连接、质粒与加粒的连接，,年法匕W但发拉3.将目的基因导入受体细胞只有该步骤没涉及到碱基互补配对现象（常用方法I（受体细胞，植而疝庖V农杆菌转化法迂用于双子叶植r秒行裸子植物体细胞含目的基因的重组Ti质粒能够转抄到被侵里细胞内,T-DNA公构建点达载体含重组Ti质粒的农杆菌并整合到果色林DVA上将目的基因插入染色体DNA中目的基因转入农杆菌表现出新性状的植株植物细胞、浮入植物细胞攵林绅胞可以美攵籽狐也可以美林细胞,袜相肥培成完整的植株里用植物俎织培系技术目的基因目标 性状组表达载体与感 受态细胞混合一 感受态细胞吸收 DNA分子同庙同雨！：布足石痴麻V3全能V-显微注射法性岛，可感受态细胞转化法以使外流受精卵塞国左梅应原核细胞一'二俎卯，细胞中表达重组:J质鲁Ca?+处理细胞一感受态细胞一重I显微o注射代孕受精卵动物提醒农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。导入目的基因，可能存在于细胞质中，也可能集合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。4.目的基因的检测与鉴定同潼的戚基互升配打原则并使用基因探杆，探奸先及豺性同位3或火光标记的令8的泰因的卑铳MA片段t方法PCR检测技术（或3、.目的基因是否插入DNA分子杂交）'转基因生物的DNA|依据是否得到目的基因（或是否出现杂交带）分子 水平 的检 测方法,'目的基因是否转录 出了 mRNA利用抗原与抗林特RT-PCR（即逆转录PCR）检测技术（或分子杂交）是否得到目的基因目的基因是否翻译初生结令的原理或是否出现杂交带）卢抗原一抗体杂交出蛋白质是否出现杂交带（举如抗虫、抗病接种实验个体水平的检测一依据匹图是否表现出相应特性易错辨析（1）用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列（J）（2）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体（义）（3）抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达（J）（4）检测目的基因是否成功表达可用抗原一抗体杂交技术（J）（5）应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达（X）深挖教材1 .PCR可以扩增mRNA吗？选择性必修3P79"旁栏思考贮"提示不可以，因为PCR是用DNA双链做模板的，不能直接用单链RNA做PCR,必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。2 .利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？选择性必修3P83"到社会中去”拓展提示有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。3 .为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？选择性必修3P81“内文信息资料卡”拓展提示游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。4 .你知道新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测原理吗？选择性必修3P82“内文信息”拓展提示新型冠状病毒核酸检测试剂盒是用于快速进行体外定性检测新型冠状病毒的医疗检测用品，它的工作原理是通过提取病人样本中的RNA,进行反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）,通过扩增反应将样本中微量的病毒信息进行放大，最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性，那么就可以认为样本中存在病毒（已经感染），反之表明样本中没有病毒（未感染）。重点疑难突破突破疑难提考能c1 .PCR技术的过程旋为单链A3；町价温复性 3-r-rr:PCR技术：项目：V体外（PCR扩增仪中）（场所）DNA在题&下变性解旋 !耐高温的DNA聚合酶* 酶）在较高温度下进行 需控制温度DNA片段温度条件.合成对象相同点：DNA复制；V细胞内（主要是细胞核内）解旋酶催化解旋酶、DNA聚合酶细胞内温和条件 DNA分子当温度上升到9（）七以上时.双链DNA解IIIIIIII3：|力口热至9095tt5，5)iiiiiiiii113r温度下降到50七左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合Qf一,U，少，3，山中”"""./ILLLLI.y弓I物I''引物n'当温度上升到72tt左右时，耐高温的DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成（从5'端向3,端延伸）LuJJIIIIIILyr111111LLUJ4>b引物I引物IT关于引物:引物是一小段单链的DNA或RNA,作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3,端;只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。2 .PCR技术和DNA复制的比较均需要模板（DNA双链）、原料（四种脱氧核昔酸）、能量3 .目的基因的筛选与获取（1）目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。（2）目的基因的获取方法利用PCR获取和扩增目的基因。人工合成目的基因a.反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核甘酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA,其过程如下：目的基因的mR而曳缕同链DNA（目的基因）b.化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：从基因文库中获取目的基因根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苜酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物一mRNA,以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。命题规律探究感悟高考找规律考向1结合PCR技术的应用，考查科学思维能力1.（2021北京东城区期末）PCR是一种体外扩增DNA的技术，模拟了体内的DNA复制过程。下图为PCR技术原理示意图，对于图中物质和过程的说明，错误的是（）A.物质a：游离的脱氧核甘酸B.过程：氢键断裂C.过程：边解旋边复制D.过程：遵循碱基互补配对原则答案C解析PCR模拟了体内的DNA复制，所以a是DNA复制的原料脱氧核甘酸，A正确;在94高温条件下，DNA分子双螺旋解开，形成单链，此时氢键断裂，B正确；体外模拟DNA的复制依据了DNA的热变性原理，该过程DNA分子不是边解旋边复制，C错误；DNA复制需要遵循碱基互补配对原则，D正确。2.(2019.全国卷I,38节选)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。(2)目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是答案(1)解旋酶加热至90以上氢键(2)耐高温的DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活解析(1)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至9095进行解旋的，二者都破坏了碱基对中的氢键。(2)在PCR过程中，要加热至90以上，所以使用耐高温的DNA聚合酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。3.(2020江苏卷，33改编)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRI酶切为例):EcoR 1I酹切七混合的DNA片段已知序列未知序列染色体DNA GAATg CTT A A；Q|1未知序列环状DNAII连接| DNA连接酹 已知序列EcoR IHI扩增耐高温的DNA聚合醐丫IPCR产物N测序、分析3,片段F的完整序列请据图回答问题:(1)步骤I用的EcoRI是一种酶，它通过识别特定的切割特定位点。（2）步骤H用的DNA连接酶催化相邻核甘酸之间的3，一羟基与5,一磷酸间形成:PCR循环中，升温到95是为了获得:耐高温的DNA聚合酶的作用是催化（3）若如表所列为己知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤III选用的PCR引物必须是（从引物中选择，填编号）。DNA序列（虚线处省略了部分核甘酸序列）已知序列5-AACTATGCGCTCATGAGCAATGCGTAGCCTCT-3'iliumiliumiiimuiiiiiiii3-TTGATACGCGAGTACTCGTTACGCATCGGAGA-5'PCR引物5'AACTATGCGCTCATGA3'5'-GCAATGCGTAGCCTCT一3'5r-AGAGGCTACGCATTGC-3'5,-TCATGAGCGCATAGTT-3,（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核甘酸序列），结果正确的是oA5AACTATGCGAGCCCTT3，B.5r-AATTCCATG<TGAATT-3'C.5GCAATGCGT-TCGGGAA-3'D5-TTGATACGCCGAGTAC一3'答案（1）限制性内切核酸（或限制）核甘酸序列（2）磷酸二酯键DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸（3）（4）B解析（1）根据题图可知，步骤I是获取目的DNA片段，所用的酶EcoRI是一种限制酶，其能识别特定的核甘酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核甘酸之间的磷酸二酯键断开。（2）步骤H是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核甘酸之间的丁一羟基和夕一磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95°C是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，耐高温的DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核甘酸连接到引物3,端，合成DNA子链。（3）引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3,端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5,端向3,端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5'-TCATGAGCGCATAGTT-3,（引物）和5'-GCAATGCGTAGCCTCT3,（引物）。（4）分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoRI切割后产生的黏性末端，因此其5,端序列应为AATT-,3,端序列应为一TTAA,B正确。题后反思>获取目的基因方法的选择（1）如果不知道目的基因的核甘酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。（2）如果知道目的基因的核甘酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法直接人工合成。（3）如果知道要扩增的目的基因及两端的核甘酸序列，而且基因又比较大，可以通过PCR技术扩增目的基因。考向2结合基因工程的操作程序，考查科学实践能力4.（2018全国卷I,38）回答下列问题：（1）博耶（H.Boyer）和科恩（S.Cohen）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了（答出两点即可）。（2）体外重组的质粒可通过Ca2+参与的方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是o（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加的抑制剂。答案（1）体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达（2）转化外壳蛋白（或答噬菌体蛋白）细菌（3）蛋白酶缺陷型蛋白酶解析（1）两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达，因此，该研究可以证明：质粒可以作为载体，真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达（不同生物共用一套密码子）、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。（2）目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是首先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态细胞。噬菌体DNA没有侵染能力，体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。噬菌体多寄生在细菌中，但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。(3)若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。5.(2021中原名校联盟)某质粒上有SHI、HindIII,BarnHI三种限制酶切割位点,同时还含有抗四环素基因和抗氨茉青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：Hind III B«mH I sal I含抗盐基* *因的dna.3抗1基因抗氨节育质粒】毒素基因飞/抗四环素基因IHind III(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为o该方法中农杆菌的作用是(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindHI和SalI两种酶的好处是_(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苇青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？(填“是”或“否”)。为什么？。(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苇青霉素)和C(含四环素和氨羊青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。o o o O o o OQ。 /( 落 菌含四环素和含氨羊青霉素氨芳青霉素答案(l)Ti质粒T-DNA感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上(2)防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率(3)否含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏(4)含四环素和含氨苇青霉素 氨节青霉素题后反思>如何筛选出含有目的基因的受体细胞(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨节青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨节青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。四环素抗性基因载体素的培养基的培养基考点三DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定考点自主梳理预习教材夯基础1.DNA的粗提取与鉴定原理DNA不溶于酒精,某些一初步分离DNA蛋白质溶于酒精一和蛋白质DNA能溶于物质的量浓浓施dna度为工迦生的NaCl溶液一一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 鉴定DNA(2)方法步骤研磨材料一新鲜洋葱，加酶液充分研磨获取含DNA 的滤液渡渔中可能啥有伪VARNA以及香白庆、小余、物美过滤（纱布）、提取滤液;？或离心取上清液、一，在上清液中加入体积分数为步邑的冷酒DNA的析出-精,静置后用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起白色丝状物，或离心取沉淀物溶解DNA将丝状物或沉淀物溶解在红侬生的NaCl溶液中DNA的鉴定'在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂.混合均匀后将试管在沸水中加热"皿,溶液变成蓝色、提醒提取植物细胞的DNA时，加入的研磨液成分中含有洗涤剂和食盐（NaCI）,洗涤剂能瓦解细胞膜，有利于DNA的释放：加入食盐的目的是溶解DNA。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。本实脸不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实脸材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA）。可选用鸣血细胞作为材料。鉴定DNA时，一支试管为对照组，另一支试管为实脸组。两支试管中都先加物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液；在实验组试管中加DNA丝状物，对照组不加：加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色，对照组无色。如果实验组蓝色较浅，说明提取出的DNA量太少。2.DNA片段的扩增及电泳鉴定原理PCR原理：DNA热变性原理。加热,双螺DNA链又重新结合、 每次循环可分为史性、 ',复性和也伸三九电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程电泳归纳|在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的福画J可解离基团会带上正电或负电,在电场的作上，用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相|反的电极移动保亩年带电性质差异产不同的实各种分1%H为分子本身大小不同生，迁移速现子的分匚I子分子本身形状不同率离I常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯历法H酰胺凝