基因工程考试试卷试题.docx

名词讲解基因工程精选文档1、限制与修饰系统 ：限制酶的生物学功能一般被以为是用来保护宿主细胞不受外源DNA 的感染，可讲解外来DNA，进而阻挡其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或许说是甲基化酶，能保护自己的 DNA 不被讲解。限制酶和甲基转移酶构成限制与修饰系统。2、各样限制与修饰系统的比较区分位点切割位点简答型46bp ，大多为回文序列在区分位点中或凑近区分位点型二分非对称无特异性，起码在区分位点外 100bp型57bp 非对称区分位点下游 2426bp1. 何谓 Star activity？简述 Star activity的影响要素及战胜方法？答： 在极端非标准条件下，限制酶能切割与区分序列相像的序列，这个转变的特色称为星星活性。惹起星星活性的的要素：高甘油浓度 >5% ；酶过度 >100U/ l ；低离子强度 <25mmol/L ；高 pH(>8.0)；有机溶剂如 DMSO 二甲基亚砜 、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；用其余二价阳离子 Mn2+、 Cu2+ 、 Co2+ 或 Zn2+取代 Mg2+ 。星星活性的抑制举措：削减酶的用量，防止过度酶切，削减甘油浓度；保证反响系统中无有机溶剂或乙醇；提升离子强度到 100 150mM 在不抑制酶活性的前提下 ；降低反响 pH 至 7.0 ；使用 Mg2+ 作为二价阳离子。2. 试答复影响限制性内切核酸酶切割效率的要素？影响酶活性的要素？答： 外因：反响条件、底物纯度能否有杂质、能否有盐离子和苯酚的污染 的选择、反响时间的长短内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象3、 DNA 尾端长度对酶切割的影响、何时加酶、操作能否适合，反响系统答：限制酶切割 DNA 时，对区分序列两头的非区分序列有长度要求，也就是说在区分序列两头肯定要有必定数目的核苷酸，不然限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR 引物时，假设要在尾端引入一个酶切位点，为保证能够顺当切割扩增的 PCR 产物，应在设计的引物尾端加上能够知足要求的碱基数目。一般需加4、何为载体？一个抱负的载体应具备那些特色？3 4 个碱基对。答： 将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：在宿主细胞内肯定能够自主复制具备复制原点；肯定具备适合的酶切位点，供外源选择；其余：有必定的拷贝数，便于制备。DNA 片段插入，同时不影响其复制；有必定的选择标志，用于5 抗性基因 Resistantgene 是当前使用的最广泛的选择标志，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？答：氨苄青霉素抗性基因 ampr 、四环素抗性基因 tetr 、氯霉素抗性基因 Cmr、卡那霉素和霉素抗性基因 kanr ,neor 以及琥珀突变抑制基因supF。青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与相关的酶联合，抑制转肽反响并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化 - 内酰胺环水解，进而排解氨苄青霉素的毒性。四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质联合 ，进而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸构成的膜联合蛋白， 可阻挡四环素进入细胞。6. 何为 - 互补？怎样利用 - 互补 来选择插入了外源 DNA 的重组质粒？答： - 互补 指 lacZ基因上缺失近操控基因区段的突变体与带有完好的近操控基因区段的 - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。 - 互补是鉴于在两个不一样的缺点半乳糖苷酶之间可实现功能互补而成立的。实现- 互补主要有两局部构成：LacZ M15 ，放在 F质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ”，放在载体上，作为选择标志，当在 LacZ”中插入一个片断后，将不行防止地以致产生无- 互补力量的 半乳糖苷酶片断。在引诱物IPTG和底物 X-gal 同时可作为生色剂 的作用下，含重组质粒的菌落不行以产生有活性的gal，表达白色，而含非重组质粒的菌落则表达兰色。以此到达选择的目的。半乳糖苷酶， 不行以分解X-1 / 6.2 / 6精选文档7、试简述 噬菌体的裂解生长状态Lytic growth和溶原状态 Lysogenic state两种循环的分化及其调理过程？答：裂解生长状态 是 噬菌体在宿主中大批复制并组装成子代 噬菌体颗粒，以致宿主细胞裂解。菌溶原状态 为 噬体基因组 DNA 经过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的生殖传到子代细胞。调理过程：由感染复数和细胞的养分状态打算的，感染复数越高，养分状态越差，则溶源化的频次就越高。溶源现象的生化媒介可能是3”-5”cAMP，它在细胞内的浓度会随养分条件的变化而转变，当细胞在富养分培育基中生长时，有益于裂解生长； 在缺乏 cAMP 的突变细胞中， 更有益于裂解生长此外一个重要的调理要素是噬菌体的cAMP 的浓度较低，C蛋白， 它是噬菌体基因转录的激活子， 抑制裂解功能基因的表达， 催化噬菌体 DNA 整合到细菌的染色体中去。 高浓度的 C蛋白促使溶源化，而低浓度的 C蛋白促使裂解生长。当 C蛋白浓度足够时，激活 C蛋白和基因 int 的表达，以致噬菌体 DNA 与染色体整合，朝着溶源态生长。9、 cDNA 文库的建立：将来自真核生物的细胞总 RNA 的提取和 mRNA 的分别mRNA 体外反转录成 cDNA，与载体连结并转变大肠杆菌的过程。第一链合成：由mRNA 到 cDNA 的过程为反转录，由反转录酶催化。其次链合成：自己引物合成法置换合成法指引合成法引物连接头合成法双链 cDNA 里连结到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中生殖10 、文库质量检测答：文库质量是由文库所含克隆的数目、均匀插入片段的长度、插入效率、基因组掩盖度和掩盖倍数等要素打算。克隆数越多、均匀插入片段的长度越长、插入效率和基因组掩盖度越高，文库质量越好。克隆数目能够经过屡次转变累加，但并不是越多越好，只需到达必定数目的基因组掩盖倍数和掩盖度就行，一般要求到达 4 6 倍掩盖率。11 、基因掩盖倍数的估量方法答：有两种，一：用公式计算基因组掩盖倍数 =均匀插入片段的长度克隆数/ 基因组 DNA 长度二：联合 基因掩盖度检测来估量。基因组掩盖度是指问苦处克隆掩盖基因组的范围。即选择必定数目的单拷贝基因作探针来选择文库。每个探针选择的克隆数目，即为该基因位点的掩盖倍数。12 、讲解并计算 N=ln(1-P)/ln(1-f)式中 N：代表一个基因组文库所包括重组克隆个数f：表示重组克隆均匀插入片段的长度和基因组P ：代表所期望的目的基因在文库中消灭的概率DNA 长度的比值计算：大肠杆菌基因组大小约4.6 mb ，假设 P=99% ，均匀插入片段大小为20kb ， f=20kb/4600kb,则 N=1057. 即当期望从一个均匀插入片段为 20kb 的大肠杆菌基因组文库中选择到随便一个感兴趣的基因的概率达99% ，该基因文库起码应包括 1057 个重组克隆。 选择适合的载系统统和挑去必定的阳性克隆是建立基因组文库时第一考虑的问题。1、 cDNA 文库的均一化办理阐述题两条门路：基因组 DNA 饱和杂交法和基因组 DNA 饱和杂交法基因组 DNA 饱和杂交法原理： 利用不一样表达水平的基因对应的基因组拷贝数相对全都的特色，能够对cDNA 文库进展均一化办理步骤 将基因组 DNA 用限制性内切酶消化固定， 消化后的基因组 DNA 扁形为相对较短的单链且最大可能的掩盖基因组。分别纯化独立 cDNA 文库的混淆质粒文库 cDNA 与固定的基因组 DNA 充分饱和杂交，固定住相应的特长： 应用简洁、没有一仪器上的限制cDNA，并将它洗脱从头转变受体菌。弊端 ：由于基因组 DNA 相对很简单，很难猎取掩盖基因组的单链DNA 片段，以致基因丢掉；在基因组 DNA 与文库 DNA 杂交的过程中，文库 DNA 自己杂交的速度会很快，以致基因丢掉。基因组 DNA 饱和杂交法原理： 双链 DNA 在加热变后再复性形成双链DNA 的速度依据二次复性动力学原理。即与组分中的单链DNA 浓度相关，浓度越小，复性所需时间越长。cDNA 文库中高丰度的 cDNA 复性所需要的时间短，低丰度的cDNA 复性所需的时.3 / 6间长。经过对复性时间的掌握，能够使高丰度的精选文档cDNA 复性成双链状态，低丰度的cDNA 保持单链状态。利用羟基磷灰石柱很简洁将单链和双链cDNA 分开，再用猎取的单链cDNA 转变宿主细菌，即可猎取均一化cDNA 文库。特长： 几乎不会以致文库中cDNA 的丢掉；均一化成效明显弊端： 基因组 DNA 饱和杂交法成功率高，而基因组DNA 饱和杂交法在参数掌握上存在着比很多的要素。2、扣除杂交 cDNA 文库原理： 利用分子杂交原理，去除非差异表达基因的cDNA，保存差异表达的基因的cDNA 用于制备文库。待测样本 tester:待测样本的总 cDNA。 比较样本 driver:表达谱背景全都但不含目的基因的总cDNA。tester与过度的 driver杂交，用特定方法将两者共同表达的cDNA 去除。如：抑制性扣除杂交 (suppression subtractive hybridization, SSH)原理： 含目的基因的 cDNA 称为供体 tester，不含目的基因的 cDNA 称为驱动 driver。它们是由对应的 mDNA 组分在体外独立反转录成的。 同时利用区分 4 个碱基的限制性内切酶为二，分别接上二种不一样的接头。Rsa 将这些 cDNA 消化成平尾端小片段。 将供体一分第一轮杂交 ：过度的驱动 cDNA 分别与带有 2 中不一样接头的供体 cDNA 杂交，在 2 个独立的杂交系统中，供体与驱动cDNA 会形成 4 种种类的 cDNA 片段 ：a、供体中既没有与供体杂交，也没有与驱动杂交的b、供体中自己杂交的cDNA 分子。c、供体与驱动中共同表达的基因杂交形成的双链d、驱动中自己杂交和不行以自己或与供体杂交的cDNA 分子。cDNA 分子。cDNA 分子。其次轮杂交： 将第一轮杂交的两个系统混淆，再参加过度的驱动cDNA，进入其次轮杂交。杂交结果进一步形成了a、b、 c、 d。也形成了 e带不一样接头a 形成的。将其次轮杂交的产物进展尾端补齐，再进展两轮PCR 扩增。在扩增过程中，由于 a、d 两头没有引物联合位点而不行以再扩增。 b 两头带有同样的接头序列，形成蜗柄构造，不行以进展指数扩增。 c只有一个引物接头，只好被线性扩增。只有e 是均一化的，差异表达的基因。用巢式引物进展其次轮建扣除杂交 cDNA 文库PCR ，降低 PCA 产物的背景，富集差异的基因。最终将PCR 产物用 T/A 克隆载体进展克隆构3、烟草酸性焦磷酸酶法建立全长原理：烟草酸性焦磷酸酶cDNA 文库TAP，能特异性地区分真核生物 mRNA 的 5 端帽子构造并将其去除。暴露出切口5端的磷酸基团，可在该切口处连结一段特异的接头来指引cDNA 其次链的合成。在反转录合成第一链前对mRNA 进展去磷酸化办理，使不完好的mRNA 分子暴露的 5磷酸基团被去掉。在反响中参加TAP，特地的去掉完好 mRNA 分子 5 尾端的帽子构造，暴露出5磷酸基团。在 T4 RNA 连结酶的作用下，能够在5端连结上一段特异的RNA 接头，不完好的 mRNA 分子中，由于缺乏磷酸基团而不行以接上接头。所以，只有增加了接头的全长合成的 cDNA 都是全长的 cDNA。mRNA 分子才能在接头指引下合成其次链cDNA。理论上讲，用此法4、酵母双杂交系统绘图 P207简称双杂交系统 two-hybricl system 也叫相互作用圈套 interaction trap 是依据真核生物转录调控的特色，创立的一种体内判定基因的方法。其选择的基因不是“探针”的直接编码产物，而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因，即选择与始终基因产物发生相互作用的蛋白的编码基因。很多真核生物转录激活因子有两个功能地区，一是 DNA 联合构造域 DNAbinding domain,BD ，可与 DNA 序列的特定位点即上游激活序列联合；二是转录激活构造域activation domain,AD , 关心 RNA 聚合酶复合体激活上游激活序列下游基因的转录。将X 与 BD 交融，蛋白 Y 与 AD 交融，将它们导入酵母细胞中表达，假设X 和 Y 相互作用，则会以致 BD 和 AD 在空间上凑近，形成一个有功能的转录激活因子，激活下游报告基因的表达。.4 / 65、根癌农杆菌介导法绘图精选文档原理： 根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒tumor inducing plasmid , 简称 Ti质粒，当根癌农杆菌感染植物时，菌体自己并无进入植物细胞内， 而仅是 Ti 质粒中一局部称之为 “ T-DNA”的 DNA 片段进入宿主细胞并插入基因组中，T- DNA 中的基因利用植物的酶系统进展转录和翻译，其表达产物可引发植物产生肿瘤。根癌农杆菌 Ti 质粒的基因构造主要分为 virulence regionT-DNA 区 transferred DNA region、 Vir区Con 区 region encoding conjugation和 Ori 区 origin of replication4 个区段。 T-DNA 区称为转移 DNA 区。即根癌农杆菌侵染植物时转移到植物基因族中的一段DNA 序列，该序列上的基因与肿瘤的形成相关。Vir区与 T-DNA区相邻，该基因可激活T-DNA 的专一，使植物致瘤， 故称毒性区 。Con区段上存在与细菌联合转移相关的基因，调控Ti 质粒在根癌农杆菌中的转移，故称为过程： 农杆菌对受体的区分农杆菌附着到受体细胞引诱和启动毒性区基因表达联合转移编码区。 Ori 区主要调控 Ti 质粒的自我复制，故称之为复制开端区。近似联合孔复合物的合成和装置 T-DNA 的加工和转运6、一元载体的建立的基根源理将 Ti 质粒上 T-DNA 中的致瘤基因全部去掉，使其丧失对植物的致瘤性。仅保存其双侧界限与T-DNA 正确转移所必须的 25 个碱基序列，故这类载体又称为卸甲载体 。由于 根癌农杆菌的 Ti 质粒比较大， 难以进展体外遗传操作，需要引入 一个较小的中间载体，将欲转变的目的基因建立于中间载体上。在卸甲载体 T-DNA 区中删除致癌基因的位点插入一段与中间载体同源的质粒序列。将中间载体转移到含有卸甲载体的根癌农杆菌中。由于卸甲载体的T-DNA 与中间载体拥有同源序列， 故可在 根癌农杆菌中发生同源重组。将中间载体整合到卸甲载体的T-DNA区，并与卸甲质粒一同复制。为发生整合的中间载体因其没有在根瘤农杆菌中的复制元件，会自行消逝。依据中间载体上所携带的抗性基因进展抗性选择，即可。7、二元载体的建立的基根源理原理： 关于一元载体来说，由于其T-DNA 与 Vir 区是在同一载体上，故又称顺式载体 。而事实上， T-DNA 与 Vir区完好没有必需必定要建立到同一载体。当它们处于不一样载体上时，Vir区经过反式作用照旧能够使T-DNA发生转移。二元载体中，根癌农杆菌菌株中含有两个Ti 质粒，一个称为微型Ti 质粒，一个称为关心Ti 质粒。此中微型Ti质粒缺失了 Vir区，其 T-DNA 也进展了 卸甲办理 ，同时引入 多个酶切位点 ，便利外源基因的插入，其余，拥有广谱的复制原件 ，可同时在大肠杆菌和根癌农杆菌中生计。经过改造的微型Ti 质粒相当小，可像一般质粒同样进展遗传操作。 关心 Ti 质粒相对较大，只去除了T-DNA，可激活微型 Ti 质粒上的 T-DNA发生转移。特长：二元载体建立较为便利；由于一元载体的T-DNA 中含有中间载体，它们会伴同外源目的基因一同被转入植物细胞内，而二元载体的不会带入大批无用的冗长DNA 序列。所以 外源基因的转变效率高于一元载体。8、 Sanger双脱氧链停顿法绘图P158双脱氧链停顿测序法使用双脱氧核苷酸，它与脱氧核苷酸的主要不一样在于：双脱氧核苷酸分子中脱氧核糖的置的羟基 OH缺失。扩增时，在 DNA 聚合酶的作用下，其 5地点的磷酸基团与上位脱氧核苷酸的3位3地点的羟基联合，可是，由于其自己3地点的羟基缺失，以致下位的5地点的磷酸基没法与之联合。即，双脱氧核苷酸整合到正在合成的DNA 链中，该 DNA 的合成就到此停顿。9、载体的分类按功能分：克隆载体： 主要用于扩增或保存DNA 片段，是最简洁的载体。拥有强盛的包装力量表达载体：带有目标细胞识其余启动子 其余载体：整合载体、穿越载体等.5 / 6按根源分：质粒细菌等原核生物染色体外遗传物质 噬菌体原核细胞的病毒真核病毒真核细胞的病毒人工遗传物质噬菌粒、粘粒、细菌、酵母等精选文档10 、基因转移常用方法及对象自然转变： 细菌等原核生物直接吸纳人工导入 ：物理法、化学法、生物法DNA物理 ：基因枪、超声波、显微注射、体细胞核移植、点击法化学法 ：PEG 引诱生物 ：农杆菌介导法、花粉管通道法对象 ：微生物、植物、动物试验 分子杂交一： Southern杂交原理： Southern blot：一种检测 DNA 分子的方法。将DNA 片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜，联合了DNA 分子的滤膜先与特定的预杂交液进展预杂交，而后与标志的核酸探针和滤膜混淆。假设滤膜上的DNA 分子存在与探针同源的序列， 那么探针将与该分子形成杂合双链，进而吸附在滤膜上。 在经过必定的清洗程序将游离的探针分子除去后，经过放射自显影或生化检测，便可推断滤膜上能否存在与探针同源的步骤： 目的 DNA 用限制内切酶酶切后，进展琼脂糖凝胶电泳 0.4mol/Lnao H 碱性条件下使其变性DNA 分子及其分子量。再用 1.5mol/L Nacl、 1mol/L 的 Tris (ph=7.4)条件下中和，使 DNA 保持单链状态将凝胶上的 DNA 原位转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上 80 ° C 办理或紫外照耀，将 DNA 固定在滤膜上将联合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂交液进展杂交特定溶液和温度下，将标志的核酸探针与滤膜混淆清洗，将游离探针分子去除，同放射自显影或生化显影，即可推断滤膜能否存在与探针同源的及其相对分子质量。留意：马上滤膜的空白处用鱼精DNA 或牛奶蛋白关闭起来，防范在杂交过程中，滤膜自己对探针的吸附。DNA 分子主要用来推断某一世物样品中能否存在某一基因， 肯定有探针。.以及该基因所在的限制性内切片段的大小。应用该技术的前提是6 / 6