基因工程知识点总结归纳.docx

基因工程绪论1、克隆clone：作名词：含有目的基因的重组DNA 分子或含有重组分子的无性生殖。作动词：基因的分别和重组的过程。2、基因工程gene engineering：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。3、基因工程诞生的根底三大理论根底：40 年月觉察了生物的遗传物质是 DNA；50 年月弄清楚 DNA 的双螺旋构造和半保存复制机理；60 年月确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。三大技术根底：限制性内切酶的觉察；DNA 连接酶的觉察；载体的觉察3、基因工程的技术路线：切：DNA 片段的获得；接：DNA 片段与载体的连接； 转：外源 DNA 片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶restriction enzymes：主要是从原核生物中分别纯化出来的，是一类能识别双链 DNA 分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链的核酸内切酶。2、限制酶的命名：属名斜体+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均一样的限制酶。5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生一样的黏性末端的酶形成的位点不能被原来的酶识别。6、限制性内切酶的活性：在适当反响条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。7、星号活性：转变反响条件，导致限制酶的专一性和酶活力的转变。8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反响是吸能反响，最适反响温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进展其次链的合成。11、DNA聚合酶：(1) 、DNA聚合酶I：53外切酶活性、35外切酶活性，53聚合酶活性，用途：除去3端突起。补齐5端突起。合成cDNA其次链。切口移位探针的制备。(2) 、Klenow大片段：没有53外切酶活性，而保存了53DNA聚合酶活性和35外切酶活性。用途:用同位素标记具5端突起的DNA片段末端。补平5粘性末端。DNA序列测定。合成cDNA其次链。(3) 、Taq酶：75度为最适反响温度，95度仍具有稳定性，不具有外切酶活性，主要用于PCR。12、主要修饰酶：(1) 碱性磷酸酶：除去核酸分子3和5端的磷酸基团。(2) T4多聚核苷酸磷酸激酶：催化ATP中的位的磷酸基转移5-OH上 (3)末端脱氧核苷酸转移酶：在3端高效添加脱氧核苷酸。分子克隆载体1、分子克隆载体：是一类可供外源DNA片段插入并携带重组分子进入宿主细胞进展扩增或表达的DNA分子。2、分子克隆载体的功能：（1） 为外源基因供给进入受体细胞的转移力量（2） 为外源基因供给在受体细胞中复制或整合的力量（3） 为外源基因供给在受体细胞中扩增和表达的力量3、载体的分类：(1) 按用途分：克隆载体、表达载体、整合载体(2) 按来源分：原核生物载体：质粒载体、噬菌体载体、M13噬菌体载体、cosmid 载体、phagemid载体；真核病毒载体4、载体的特点：（1） 至少有一个复制起点，因而至少可在一个生物体中自主复制（2） 至少有一个克隆位点，可供外源DNA插入（3） 至少有一个标记基因，以学问载体或重组DNA分子是否进入受体细胞（4） 具有较小的分子量和较高的拷贝数5、标记基因的作用：外源基因是否插入载体分子形成重组子；外源载体是否进入宿主细胞6、标记基因的种类：抗性标记基因；养分标记基因；生化标记基因；噬菌斑7、常用的遗传标记基因：四环素抗性基因Tc；氨苄青霉素抗性基因Ap；氯霉素抗性基因Cm；卡那霉素Kan；霉素Neo；半乳糖甘酶基因LacZ)；葡萄糖苷酸酶基因Gus；荧光素酶基因；发光蛋白质基因。8、按复制起点划分克隆载体：1） 质粒复制型复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体有低拷贝和高拷贝2） ARS复制型染色体复制型一般拷贝数比较高3） 病毒复制型复制起点来自病毒，假设为RNA必需反转录为cDNA高拷贝4） 混合复制型：不同种生物复制起点混合穿梭载体9、依据载体的分子生物学特性划分：质粒载体、病毒型载体、混合型载体10、依据载体功能分类：1一般型载体：至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因。如 PBR322和pUC载体2表达型载体： 3类：型：转录起始区调控序列+启动子+终止子； 型：转录起始区+翻译起始区核糖体结合序列和起始密码 子+终止子； 型: 转录起始区+ 翻译起始区+ 信号肽链编码区+ 终止子常称之为表达分泌型载体3） 失控型质粒载体(Run-away plasmid vector)：是一些低拷贝质粒，其复制掌握是温度敏感型或药物敏感型，在不同温度或不同药物浓度下，质粒拷贝数会显著变化。4） 探针型载体：该类载体主要 特点是含有一些特别的DNA序列，用于特定的争论目的，如分别基因启动子、终止子、DNA复制起点等。5) 定序型载体：主要用于核苷酸的序列测定6) 整合型载体：主要用于基因治疗，稳定表达外源基因。9、标记基因与拷贝的关系：假设标记基因的表达效率较高，宿主细胞可能不大量表达标记基因以满足选择压力的要求，因而载体的拷贝数会降低，可实行相应方法提高拷贝数。如：对于药物抗性标记基因，可提高药物的浓度。对于养分标记基因，可降低该基因的表达效率。大肠杆菌分子克隆载体1、E.col克i 隆载体的种类1） 质粒载体复制起点来自一些自然质粒。2） 噬菌体载体，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。3） COS质粒载体质粒载体中插入cos片段，以利于体外包装4） 噬粒载体phagemid有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。2、质粒的特点：1） 质粒DNA的复制与染色体复制无关2） 质粒DNA以超螺旋形式存在3） 质粒DNA可以结合转移4） 质粒的不相容性和不相容群5） 质粒DNA的消退6） 质粒的整合3、大肠杆菌质粒的复制：以RNA为引物合成，RNA与RNA结合可削减质粒的拷贝数，使RNA复制起点上游一个核苷酸处G突变为T，使得拷贝数增多。4、质粒的不亲和性：在没有选择压力的状况下，两种亲缘关系亲热的不同质粒， 不能够在同一宿主细胞中稳定共存的现象。主要是由于他们在复制功能之间的相互干扰造成。5、噬菌体的构造特点：线性双链DNA病毒，具有末端互补的12个核苷酸，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48.5kb。6、热诱导表达：cl ts857 ，可作为组件插入质粒 DNA 内。目的基因插在clts857 下游，重组体的目的基因在 42 表达， 30 不表达。7、噬菌体载体的缺点：基因组太大；酶切点太多；野生型只能接纳肯定长度 的DNA。8、噬菌体载体的改造：切去非必需片段，加载目的基因去掉太多的酶切位点增加标记基因9、COS质粒载体的特点：在一般质粒载体中插入一个或两个来自的cos位点片段，双cos载体比单cos载体易于重组。10、COS质粒载体的优点：容量大，用于基因簇的克隆；形成的重组 DNA分子可进展体外包装，并能感染大肠杆菌细胞；操作简洁，易于转化细胞；对重组DNA分子长度具有选择性包装。11、噬粒载体phagemid：在质粒载体中插入一段M13或fd的复制起点，其插入方向打算在噬菌体颗粒中形成正链还是负链。基因操作的主要技术原理1、核酸分别提取的原则：保证核算的一级构造的完整性；排解其他分子的污染2、质粒载体分别的关键：如何使质粒与DNA与宿主染色体DNA分开依据：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA提取过程中，染色体断裂成片段，而质粒DNA仍保持超螺旋构型3、变性法提取质粒DNA的原理：在变性条件碱性或高温 )下，线状染色体 DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。 当变性条件恢复时，质粒DNA快速复性恢复自然构型，染色体DNA难以复性， 交联形成不溶性网状构造，与变性的蛋白质和 RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。4、RNA分别纯化的关键：防止内外源RNase的作用5、RNase的特点：抗酸抗碱；抗高温严寒；抗变性剂，酶活性不需要关心因子， 存在范围广。因此操作时要进展高温灭菌或用焦碳酸二乙酯处理或强蛋白质变性剂等。6、核酸的浓缩：沉淀法：可以除去溶液中某些可溶的盐离子和杂质。7、核酸凝胶电泳的根本原理：核酸分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向正极移动，通过凝胶的分子筛作用可以将不同大小和构型的核酸分子分别，分子量小的DNA，具有较严密的构型，在凝胶中移动快；反之，分子量大的DNA移动慢。8、核酸凝胶电泳常使用溴酚蓝作为指示剂、溴化乙锭作为染色剂9、脉冲场凝胶电泳原理：加在凝胶上至少有两个电场方向，使得DNA分子要不断地调整泳动方向，不同分子量大小的DNA分子用于转变泳动方向的时间不同， 则可以得到分别10、双脱氧核苷酸终止法的原理：双脱氧2”，3” 核苷酸可以象2” 脱氧核苷酸那样直接掺入合成的DNA链中，但因3端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可依据不同长度的DNA 片段测定出核苷酸序列11、双脱氧核苷酸终止法的过程：制备单链DNA，与引物退火，分为4个反响体系， 每个体系中参加dNTP和一种双脱氧核苷酸，DNA聚合酶定序反响，反响产物变性后电泳，凝胶枯燥，放射自显影，依据条带读出碱基序列，再依据碱基互补配对原则写出DNA链的序列。留意：要自己写一个序列，然后写上每个体系中消灭片段的序列，然后依据序列画出电泳图，考试考的可能性大，书上有步骤12、MaxamGilbert 化学法原理：DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反响，在碱性环境下硫酸二甲酯能使碱基G发生甲基化，在酸性环境下哌啶甲酸使A 和G脱嘌呤，碱性环境下肼使C和T发生开环，在高盐浓度下肼只使C开环。然后发生12个碱基的脱落或取代，最终发生链断裂，不同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列13、化学法测序的优点、不需要模板、引物和DNA聚合酶。14、Southern杂交Southern blot：用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分别酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用核苷酸片段。加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列Southern杂交的一般步骤：DNA的制备DNA酶切电泳琼脂糖凝胶电泳DNA原位转膜探针杂交放射自显影结果分析15、Northern杂交检测的是RNA。步骤与southern类似，不需要酶切。16、Western杂交：杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从SDS 中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反响进展检测。主要用于基因表达产物蛋白质的检测。Western杂交的一般步骤：蛋白质制备SDS-电转移至膜上一抗的制备一抗与膜结合1h洗膜30min二抗与膜的结合洗膜显色反响结果分析17、PCR反响体系：模板、引物、dNTP、buffer、taq酶、超纯水。18、引物设计的一般原则：引物的长度常为17至30个碱基；GC含量为40%至60%； Tm值高于55；两条引物之间配对碱基数小于5；引物自身配对的碱基数小于3。基因文库的建立1、基因组文库：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。2、建立基因组文库的一般程序:1) 载体DNA片段的制备：DNA分别，限制酶切割，脱磷酸化反响2) 供体DNA片段的制备：总DNA纯化，再进展机械或酶切割成特定大小的DNA片段。3) 供体和载体DNA的连接:要留意混合的比率和浓度4) 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增5) 基因组文库质量的评价：文库规模、重组频率3、利用载体构建基因组文库:1) 载体DNA片段的制备的方法：左右臂DNA片段的获得2) 供体DNA片段的制备：限制酶局部酶切，机械剪切法3) 重组DNA分子的形成：掌握混合的比率4) 重组DNA分子的包装：制备包装物，然后进展包装5) 基因组文库的扩增4、为提高文库的质量，实行以下措施:1） 双酶切载体产生不同末端以避开其自身形成串状体2） 供体DNA脱磷酸化以避开供体DNA间的连接导致重排3） 载体和供体DNA末端修饰以避开上述两种情形发生:载体补CT，供体补GA4） 承受文库快速构建法以避开扩增文库时DNA丧失5、基因组文库的载体可载入DNA大小：1质粒最大15kb适合构建cDNA文库；亚克隆2噬菌体最大25kbcDNA文库3COS质粒30-45kb基因组文库4噬粒最大12kbcDNA文库5P170-90kb基因组文库6BAC100-500kb基因组文库7YAC250-1000kb基因组文库6、鸟枪法克隆目的基因：随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分别出含有目的基因的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分别。7、鸟枪法克隆基因的步骤：染色体DNA的切断；与载体连接；转化受体细胞；筛选含有目的基因的目的重组子。8、鸟枪法的改进:目的基因的酶切图谱；在连接前将DNA片段进展分级分别9、鸟枪法克隆基因的局限性：工作量较大，需要了解目的基因的背景学问不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结果10、cDNA文库：从肯定生长阶段或条件的某种细胞分别到的全部mRNA经反转录成cDNA后再重组和增值所产生的无性生殖系的总和。11、cDNA文库的特点：基因特异性；器官特异性；代谢或发育特异性；不均匀性； cDNA均可获得表达12、建立cDNA文库的一般程序1） 载体DNA片段的制备2） 多聚ARNA的分别制备3） 双链cDNA的合成：反转录法合成单链cDNA，碱解或酶解除去RNA合成其次链4） ds-cDNA与载体DNA相连：人工接头、同聚物加尾、cDNA的定向插入5） 重组cDNA分子的转移和文库的建立:质粒载体则转化大肠杆菌、噬粒则包装感染13、其次链合成的方法：自身引导法、置换合成法、引导合成法。前两者5端会有几个碱基缺失。目的基因的分别和鉴定1、获得基因的一般方法：1) 化学合成法:主要用于较小基因的合成或需要转变碱基2) 半化学合成法：mRNAcDNA加人工接头或合成一段DNA与载体相连、3) 筛选法：用各种方法从基因文库或cDNA文库中选择目的基因2、基因筛选的方法:1)遗传互补法原理：当一外源DNA片段引入一受体细胞后，假设受体细胞获得某种的性状，那么此片段上携带着打算性状的遗传基因。养分缺陷型受体细胞转入外源DNA片段之后，涂布在合成培育基上可以生长；无某种表型的细胞会有性状；某些产酶细胞则可能过量产酶。酿酒酵母MF基因的筛选：基因组文库DNA 转化酿酒酵母细胞 在缺乏亮氨酸的培育基上培育 能生长的重组子即含合成亮氨酸的基因2核酸杂交法原理：利用核酸探针与待分别DNA的同源序列可进展杂交的特点分别目的基因。分别步骤：基因(基因组或cDNA)文库制备DNA样品膜与标记探针杂交 杂交斑点阳性克隆分别重组DNA分子作斑点杂交阳性克隆Southern 杂交以确认杂交结果 DNA进一步证明和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级构造比较；分别插入片段进展基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物。3免疫法原理:外源DNA引入宿主细胞后表达出蛋白质，以此蛋白质为抗原与相应抗体发生免疫反响，然后利用二抗与一抗反响，用二抗偶联的酶反响筛选目的基因。分别步骤:基因文库蛋白质样品膜制备免疫法筛选有色斑点阳性克隆进一步证明：分别阳性克隆无细胞抽提物，作斑点印迹， western印迹免疫分析；分别重组DNA，检测插入片段大小，测序等。4) 染色体巡查法5) 蛋白质-DNA杂交法6) 蛋白质-蛋白质结合法，即酵母双杂交法原理：利用酿酒酵母的GAL4蛋白质N 端和C端分别融合的两种蛋白质相互作用可激活具有UAS上游激活序列报告基因表达筛选目的基因的方法。GAL4蛋白质基因是一个调控基因，掌握半乳糖利用酶类基因的表达，其5 端存在UAS。GAL4存在两个构造域：N端具有UAS-DNA结合域BD，C端具有转录激活构造域AD，这两个构造域可以单独起作用。假设AD和BD分别与两个基因编码序列融合，且两种蛋白质能相互作用，就可导致GAL-LacZ基因的表达。与BD融合的基因称为钓饵基因，与AD融合的基因称为目的基因。3、用于基因分别和鉴定的关心方法：抑制消减杂交法；差异杂交法；阻断翻译法；释放翻译杂交法植物基因工程1、植物组织培育技术：愈伤组织培育、细胞悬浮培育、原生质体、植株再生2、植物基因转移方法：农杆菌转化法、基因枪法、原生质体法、电击法、显微注射法3、植物转化的标记基因：选择标记基因kan、Hyg、Bar、报告基因Bt、Gus、 GFP、启动子CaMVA)4、Ti质粒有六个功能区：1） 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素2） 冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成3） 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解4） Ti 质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移5） 毒性区Vir：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体6） DNA复制区Rep：参与Ti 质粒DNA复制5、将致瘤区替换成目的基因即可取出冠瘿6、根瘤农杆菌转化的一般步骤：叶盘法：从植物叶片上用打孔器取假设干叶片制备含有目的基因的Ti质粒 将质粒转入农杆菌置于含农杆菌的培育基 24小时将叶片转移至筛选培育基上诱导愈伤组织诱导生根移栽7、转基因技术在植物中的应用：抗虫、抗病毒、抗真菌、抗除草剂、抗逆、改进作物品种8、转基因植物的问题：转基因沉默：位置效应、转录水平的基因沉默、转录后水平的基因沉默。选择基因安全性问题；对生态环境的影响动物基因工程1、从遗传学角度划分：遗传性动物基因工程、非遗传性动物基因工程2、动物基因工程载体具备的功能：1） 为外源基因供给进入受体细胞的转移力量2） 为外源基因供给在受体细胞中复制或整合的力量3） 为外源基因供给在受体细胞中扩增和表达的力量3、动物基因工程载体：质粒型载体、病毒型载体、定向打靶载体基因敲入 、基因敲除、基因下调4、哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记：遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸G418APH灭活G418转移酶DHFR二氢叶酸复原氨甲喋呤DHFR突变体抗酶氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH 灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷氨基喋呤TK合成TMP激酶XGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤霉酚酸XGPRT合 成磷酸核糖转移GMP酶ADA-腺嘌呤核苷脱 腺嘌呤木酮 ADA灭活Xyl-A氨酶糖苷5、基因转移技术：1） 物理转染法：电击法、显微注射法、基因枪法、超声波法2） 化学转染法：磷酸钙法、脂质体法、原生质体法3） 生物法：病毒感染法6、转基因动物制备程序：1DNA 显微注射法制备转基因小鼠：基因制备促排卵结扎、假孕鼠取受精卵显微注射 DNA胚胎移植基因分型分析2胚胎干细胞制备转基因动物过程：转基因胚胎干细胞的获得胚囊注射嵌合体的检测和育种3转基因体细胞核移植法生产转基因动物7、转基因的鉴定：1） 标记选择法：正负选择标记筛选法、无启动子筛选法2） 分子鉴定法：PCR 扩增、斑点杂交、Southern 杂交、荧光原位杂交8、表达水平的检测：报告基因、Northern 杂交、反转录 PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western 杂交、目的蛋白的生物活性。9、转基因动物的应用：提高动物的生产性能、动物生物反响器、异种器官移植、根底争论。名字解释补充：1、原位杂交in situ hybridization：是用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进展定位和相对定量的一种技术。2、基因芯片gene chip：是将很多特定的 DNA 寡核苷酸或 DNA 片段称为探针固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进展杂交分析，利用碱基互补配对原理进展杂交，通过检测杂交信号并进展计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能争论和基因组争论、疾病的临床诊断和检测等众多方面。3、基因沉默RNA silencing是指真核生物中的双链RNA 诱导的识别和去除细胞中非正常 RNA 的一种机制。4、基因敲除gene knock-out：针对一个序列但功能未知的基因，从 DNA水平上进展试验设计，彻底破坏该基因的功能或消退其表达机制，从而推想该基因的生物学功能。5、基因敲入gene knock-in：基因敲入是利用同源重组原理将外源基因插入到染色体的特定位点上。6、基因下调gene knock-down：又称为 RNA 干扰，是通过 RNA 分子的作用到达转录后基因沉默的效应。7、a-互补alpha complementation：缺失突变的 LacZ 基因合成的是一种缺失了1141个氨基酸的缺陷性(贝塔)-半乳糖苷酶，使之丧失四聚体化作用的功能。在体外参加野生型的贝塔-半乳糖苷酶的溴化氰片段，就可以是多肽活性得以恢复，重获得四聚体的力量。8、聚合酶链式反响PCR):是利用单核苷酸引物对特异性 DNA 片段进展体外扩增的一种方法。9、基因打靶技术gene targeting technology：是指通过外源基因与靶细胞染色体上的同源序列间的同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞的特定位置上，而使某一个特定位点上的基因发生定点突变技术。10、报告基因reporter gene：是一种编码简洁被检测的蛋白质或酶的基因。祝大家考个好成绩！