2023届新高考生物备考复习：细胞工程.pdf

2023届新高考生物备考复习细胞工程一、细胞工程的概念细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。植物细胞工程发展历程土壤农杆菌的夏厦粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物1974年 学技术的紧密结合。-I9 6 0年1958年亨尔森诱导烟草独厚原生质佐毅佥，获得了第一株体细胞独1971年 闻 杂 独 植 捶。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花1964年|登 越&t向皋物S _科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。斯图尔德等发现胡萝I、的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。1902年 哈伯兰特提出了细胞全能性的理论，但相关的实验尝试没有成功二、植物细胞工程（一）植物细胞工程的基本技术（1）植物组织培养技术1、概念离体的植物器官（如一片叶x组 织（如一片花瓣）或细胞（如一粒花粉）等，培养在人工配制的培养基 上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。答-莘叶子 花瓣 花 粉 细 胞 植物体外植体：在植物组织培养过程中，从植物体上被分离下来的，接种在培养基上供培养用的原生质体、细胞、组织、器官等2、原 理：植物细胞的全能性1 ）全能性的概念:细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。2）具有全能性的原一般生物体的每个细胞都具有该物种的全套遗传信息，有发育成完整个体所必需的全部遗传信息。3）体现全能性的标志：细胞T 完整个体或其他各种细胞4）哪些细胞具有全能性？植物细胞、动物受精卵、胚胎干细胞、动物体细胞的细胞核5）全能性的大小：受精卵 胚胎干细胞 生殖细胞 体细胞植物细胞动物细胞（核）分化程度低的细胞 分化程度高的细胞分裂能力强的细胞 分裂能力弱的细胞6）生物体内细胞不体现全能性的原基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。实 例：芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶。7）体现全能性的条件:离体、合适的外界条件3、生殖方式：无性生殖4、分裂方式：有丝分:5、一般过程1 ）脱分化概 念：在一定的激素和营养条件下，已分化的细胞失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞的过程。条 件：离体、一般不需要光、适宜的营养、细胞分裂素和生长素比例适中。结 果：形成愈伤组织细胞排列疏松且无规则、高度液泡化、呈无定形状态的薄壁细胞团。2）再分化概 念：愈伤组织重新分化成芽、根等器官的过程条 件：离体、需要给予适宜的 光 照（诱导叶绿素的合成，使试管苗能够进行光合作用 适宜的营养、生长素与细胞分裂素。结 果：形成根、芽或胚状体生长素/细胞分裂素 结果比值高(1)有利于根的分化，抑制芽的形成任值低(之1)一 有利于芽的分化，抑制根的形成比值适中(=1)促进愈伤组织的形成简记为”高 根，7低丁芽；中”愈伤胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物而统称为体6、探究实践菊花的组织培养1）原 理：植物细胞具有全能性2）材 料：离体的茎尖、根尖、叶片、花药等3）条 件：离 体 状 态 无 菌 操 作 种类齐全、比例适合的营养物质 植物激素（主要是生长素和细胞分裂 素）适宜的外界条件（温度、pH、光 照 等）4 ）MS培养基的配方一、MS培养基的配方（1 L的 用 量）NH4N O,（硝 酸怯）1 650 mgKH,PO4（哂酸二氢仲）170 mgCaCL-2H:O（二水合氯化钙）440 mgZnSO,4H Q （四水合破酸伴）8.6 mgK1（哄 化 仰）0.83 mgCuSO4 5H:O（五水合硫酸铜）0.025 mg甘兼酸 2 mg拈酸叱哆磬（维生素B J 0.5 mgKNOj（硝 酸 用）1 900 mgMgSO4 7H2O（七水合硫酸铁）370 mgMnSO4 4H：O（四水合硫 酸 恬）22.3 mgH.B O,（硼 改）6.2 mgNa:MoO4 2H;O（二水合锢 酸 钠）0.25 mgCoCL 6H:O（六水合氯化转）0.025 mg盐酸碱胺素（维生术B）0.1 mg烟酸 0.5 mg肌静100 mg蔗博30 g琼脂10g婪合铁盐*含水、无机盐、氨基酸、维生素、蔗糖、琼 脂 等，其中蔗糖最多，作用是提供营养物质、调节渗透压。5）操作步骤外植体的消毒I外植体的切段I接种外植体I诱导愈伤组织I诱导生芽生根移栽外植体的消毒I外植体的切段I接种外植体语导愈伤组织诱导生芽生根I移栽1W寻1 1力组次诱导生芽生根I移栽外植体的消毒外植体的切段I接种外植体外植体的消毒流水冲洗一酒精消毒30s一无菌水清洗2 3次一次氯酸钠溶液处理30min一无菌水清洗23次。外植体的切段将消过毒的外植体置于无菌培养皿中一用无菌滤纸吸去表面的水分一用解剖刀将外植体切成0.5 1cm长的小段。接种外植体在酒精灯火焰旁，将外植体的1/31/2插入透导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。注 意：接种时注意外植体的方向,不要倒插！（将 形 态 学 现 朝 上，下端朝下）诙导生芽生根生芽培养基：生长素：细胞分裂素 1生根培养基：生长素：细胞分裂素X6）在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）外植体的消毒（酒精、次氨酸钠）接种的无菌操作（超净工作台、酒精灯火焰旁）移栽前清水洗掉根部培养基移栽到消过毒的环境中生存一段时间。(2)植物体细胞杂交技术不同种物种之间存在着生殖隔离、1 5 b/S%指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。2、原 理：细胞膜的流动性和植物细胞的全能性3.植物体期胞杂交特术过程A细 胞 A原生质体2.诱导融合物理法：电融合法、离心法-I 化学法：聚乙二醇(P E G)融合法、高Ca2+高pH融合法等“正在融合的原生质体B细 胞 B原生质体 否“愈伤组织1）原生质体：指去除植物细胞壁后剩余的细胞膜及其内部的结构（与原生质层区分开）2）原生质体的获得方法：用纤维素酶和果胶酶处理（酶解 法，利用了酶的专一性）纤维素酶和果胶酶的酶溶液中一般加入一定浓度的无机盐离子和甘露醇，原因是：使溶液具有一定的渗透 压，防止原生质体吸水过多而涨破。3）诱导融合的方法:物理法：电融合法、离心法化学法：聚乙二醇（PEG）融合法、高 Ca2+高 pH融合法4）两个标志植物细胞融合完成的标志：杂种细胞再生出新的细胞壁（参与此过程的主要细胞器：高尔基体、线粒体）植物体细胞杂交完成的标志：培育成新植物体5）融合后染色体数是两亲本染色体数之和，染色体组数是两亲本染色体组数之和，基因组成是两亲本基因型之和（AaBbCcDd卜融合后，培养基中一般有5 种类型的细胞：A、B、AA、BB、AB（需要进一步筛选卜6）变异类型染色体数目变异 I融合垣 四 雌植物体细胞杂交育种番茄马铃薯植株是异源四倍体。若亲本植株可育，则杂种植株可育。杂种植株是不同于亲本的新物种。2 gE 二9I（22m四 雌杂交育种诱导多倍体7）优 点：打破生殖隔离，克服有性杂交不亲和性，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。8）缺 点：不能让杂种植物按照人们的需求表现出双亲的杂合性 状，如番茄 马铃薯植株并没有出现地上结番茄，地下结马铃薯的现象。（这是因为杂种植株细胞内存在染色体排斥丢失的现象，且细胞内基因表达相互干扰）9）少数成功实例:白菜甘蓝、普通小麦长燕麦草等例：A种植物的细胞和B种植物细胞的结构如下图所示将 A、B 两种植物细胞去掉细胞壁后，诱导二者的原生质体融合，形成单核的杂种细胞，若经试组织培养后1了杂种植株，则该杂种植株是()A.二倍体；基因型是DdYyRrA物种B物种B.三倍体；基因型是DdYyRrC.四倍体；基因型是DdYyRrD.四倍体；基因型是DDddYYyyRRrr(-)植物细胞工程的应用1、植物繁殖的新途径(1)快速繁殖定义：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术,也叫微型繁殖技术优点：高效、快速地实现种苗的大繁殖；保持优良品种的遗传特性；不受自然生长季节的限制；培养周期短。实例：一些优良的观赏植物、经济林木、无性繁殖作物和濒危植物等。(2)作物脱毒定义：植物顶端分生区附近的(茎尖、根 尖)的病毒极 少，甚至无病毒，用此进行茎尖组织培养来获得无病毒植株，即脱毒苗。(不能抗病毒)取材：茎尖适用生物：无性繁殖的生物，如马铃薯、草莓、香蕉 优 点：明显提高农作物的产量和品质2、作物新品种的培育(1)单倍体育种 定 义：取花药或花粉经过离体培养后得到 单 倍 体 幼 苗,再经过人工诱 导 染 色 体 数 目 加 倍，最终培育成遗传性状稳定的纯合二倍体的过程。材 料：主要是花粉或 花 药，也有未授粉子房或胚珠 过 程：选择亲本有性!杂交F i花药离 体培养单倍体植株诱导染色 体加倍可育纯合子选择所需类型P：第(紫色甜玉米x白色甜玉米年B第2年配子AASS j aass紫色m F甜玉米AaSsAS As aS as,|花药离体培养单倍体幼苗 AS As aS as 秋水仙素处理纯合体植株AASS AAss aaSS aass紫色甜玉米原理：染色体数目变异、植物细胞全能性优点：极大缩短育种年限，节约大 人力和物力；可获得纯合子，后代不发生性状分离,能稳定遗传。可作为进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。缺点：技术相对复杂，需要与杂交育种结合，其中的花药培养需要组织培养技术的支持。(2)突变体的利用原理：在植物组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断增殖的状态,此容易受到培养条件和诱变因素的影响而产生突变基因突变或染色体变异和植物细胞的全能性)常用材料：愈伤组织过程:诱变处理以田心 脱分化 心 再分化 筛选培育外 植 体-愈 伤 组 织-突变体-新品种 优 点：提高愈伤组织突变可以获得高产、优质、抗逆的新品种，加快育种进程。缺 点：突变不定向，需要处理大量材料，突变少利多害，符合要求的品种较少。实 例：抗花叶病毒的甘蔗、抗盐碱的烟草等。3、细胞产物的工厂化生产初生代 谢 物：生物生长和生存所必需的代谢物，如蛋白质、糖类、脂质、核酸等。次生代 谢 物：不是植物基本的生命活动所必需的 产 物;一般在特定的组织或器 官 中，并在一定的环境和时间条件下才产生的代谢物（如干旱、虫 害 等）；一般是小分子化合物（如酚类、菇类和含氮化合物等）；在植物的抗虫、抗病等方面发挥作用，也是很多药物、香料和色素等的重要来源；含量很低，从植物组织中提取会大 破坏植物资源，有些产物又不能或难以通过化学合成途径得到。过程:脱分化 培养、提取外植体 愈伤组织-细胞产物植物细胞培养：在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术。注 意：A、一般组织培养到愈伤组织即可。因为此时细胞分裂能力旺盛，代谢快，有利于产物生成。B、液体培养基（培养液）有利于培养的细胞与营养物质充分接触。优点：不占用耕地，几乎不受季节天气限制，对社会、经济、环境保护具有重要意义。实例：紫草宁、紫杉醇、人参皂昔等三、动物细胞工程动物细胞工程（含胚胎工程）的发展历程2017年我国科学家首次培育了体细胞克隆猴克隆羊多 莉 峰1996年19591951 年单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生张明觉：发现哺乳动物 精 现2014 年907年胚胎分割移植成功197弊耨：首例胚胎移植成功1890年2006年 山中伸弥：获得诱导多能干细胞icuh埃文斯：成功分离和1981年 培养小鼠的胚胎干细胞1975年 米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术1958年格登、童第周：体细胞核移植成功哈里森：首创动物组织体外培养法动物细胞工程包括三大常用技术：动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植，其 中，动物细胞培养是动物细胞工程的基础。(-)动物细胞培养1、概念是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。分散的原因：使细胞与培养液充分接触，保证细胞所需的。2和营养供应保证细胞内代谢物及时排出。2、原理细胞增殖(有丝分裂)3、培养对象：胚胎或幼龄动物的细胞（细胞的生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强，容易培养）4、结果获得数 更多的相同细胞或细胞产物（但不能获得完整动物个体。）5、动物细胞培养的条件体内细胞维持生命活动和增殖需要营养和稳定的内环 境，体外培养细胞需要类似的以下条件:糖 类 氨吃-营养条件无机盐维生素.其他条件一无菌、无毒的环境适宜的蘸、pH和渗透压L适宜的气体环境有机物：糖类（一般是葡萄糖x氨基酸、维生素等无机物：无机盐（包括大元素、微 元素）1）营养条件：培养基构成：合成培养基+动物血清等一些天然成分合 成 培 养 基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基（化 学 成 分 已 知，有别于天然培 养 基）动 物 血 清：含有尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物 质，如多种未知的促细胞生长因子及其他活性物质。培 养 基 的 类 型：液 体 培 养 基（培 养 液）2）无菌、无 毒 的 环 境：对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。、在无菌环境下进行操作。卜无菌另外，可根据实际情况适量添加抗生素、培养液需要定期 更 换：清除代 谢 物，防止细胞代谢物积无毒累对细胞自身造成危害。3）温度、pH和渗透压:适宜的温度：36.50.5适宜的pH:7.2-7.4培养液呈暗红色：加入了 pH指示剂，根据pH的改变而呈现不同的颜色，方便培养细胞时进行判断适宜的渗透压：目的是维持细胞正常的形态和功能。4）气体环境：02:细胞代谢所需 C02:维持培养液的pH培养装置：培养皿或松盖培养瓶置于C02培养箱中进行培养（C02培养箱能释放：95%的空气（注意不是02）+5%的C02,且湿度饱和）6、动物细胞培养的过程1）取材动物胚胎或幼龄动物的器官或组织（分化程度低、分裂能力强、容易培养）（与植物组培取材类似）2）分散成单个细胞机械法（需要特殊的仪器）酶解法：先剪碎然后用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理）应注意酶的用量和时间，以免损伤细胞膜蛋白不能用胃蛋白酶的原因：胃蛋白酶的最适pH约为2,大于6时失去活性3）制备细胞悬液向细胞分散好的培养皿中加入培养液，以终止胰蛋白酶的作用，使其形成细胞悬液（血清发挥终止作用）4）原代培养体外培养细胞分为两类：悬浮生长类：能够悬浮在培养液中生长增殖。贴壁生长类：大多数细胞属于此类，把细胞贴附于培养瓶瓶壁上的现象称为细胞贴壁。（单层细胞）要 求：培养皿（瓶）表面光滑、无毒、易于贴附悬浮生长类体外培养的动物细胞贴壁生长类（大多数）会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。除受以上因素影响外，还会发 蜴 触 抑制现象。接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触 时，细胞通常会停止分裂增殖的现象。圆球形细胞刚开始 培养的动物细胞贴壁生长 细胞单层贴壁生长铺满瓶壁铺展贴壁生长(100X)并进行有丝分裂(100X)后出现接触抑制(100X)正常细胞 肿瘤细胞失去接触抑制5)传代培养动物组织经处理后的初次培养称为原代培养，分瓶之后的培养称为传代培养。悬浮细胞：原代培养f 分裂受阻f 离心法收集f 制成细胞悬液f 传代培养。贴壁细胞：原代培养f 分裂受阻f先胰蛋白酶处理f 再离心法收集f制成细胞悬液f 传代培养。细 胞 株：原代培养的细胞一般传10代左右细胞的生长就会 出 现 停 滞，大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够 度 过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传40-50代，这种传代细胞叫作细胞株。细 胞 系：细胞株细胞的遗传物质没有发生改变，当细胞株传至50代以后便不能再传下去。但是也有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传下去动物细胞培养的过程取动物组织.放入co用制成 中培赢簿师却悬液,传的养舞舞 一 一-0F：1 T .：，这种传代细胞称为细胞系。取动物组织I腼 去 蝇（胞疆白6mt3分散成单个细胞制成细胞悬液J1转入培养液进行原代培养细胞贴壁1接触抑制分瓶进行传代培养7、植物组织培养与动物细胞培养的异同点植物组织培养动物细胞培养原理植物细胞的全能性细胞增殖培养前处理离体用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶将组织细胞分散开取材离体植物器官、组织、细胞动物胚胎或幼龄动物的组织、器官培养基的物理性质固体液体（又称培养液）培养基的成分有机营养成分无机营养成分植物激素糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质及一些天然成分如血清特有成分植物激素血清植物组织培养动物细胞培养特殊环境条件再分化需光气体环境结果一般获得新的植株获得大量细胞是否体现细胞的全能性是否过程外植体(离体的寿官、编织或细胞)S化念伤蛆织再分化根、芽或疑状体)1完筌植株动物组织块附电个细施 加培薜液如胤取液I原代培养I细胞悬液I传界相同点1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂；2.均需无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件8、干细胞培养及其应用(1)干细胞的概念：动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞即为干细胞，在一定的条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。(stem cell)（2）干细胞的来源：早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。（3）干细胞的分类：胚胎干细胞和成体干细胞等1 ）胚胎干细胞（简 称ES细 胞）：存在于早期胚胎（8细胞期之前含8细 胞 期）中，具有分化成为成年动物体内任何一种类型的 细 胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。ES细胞的特点：体积小、细胞核大、核仁明显E S细胞的用途：研究体外条件下细胞分化的机理；体外诱导形成组织细胞，治疗组织损伤（如心肌细胞、神经元、造血干细胞）；培育人造器官，用于器官移植。2）成体干细胞：成体组织或器官内的干细胞 分 类：造血干细胞、神经干细胞和精原干细胞等 分 布：骨髓、外周血、脐带血、神经系统、睾丸中。作 用：具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组 织，不具有发育成完整个体的能力。举 例：造血干细胞移植治疗白血病或放疗后引起的造血系统功能障碍；利用神经干细胞治疗神经组织损伤和神经退行性疾病（帕金森病、阿尔茨海默病）3）诱导多能干细胞（简 称iPS细 胞）胚胎干细胞的局限：必须从胚胎中获取，而且取出的胚胎最终会被遗弃，涉及伦理问题。定 义：体外诱导的成纤维细胞、已 分 化 的T细胞、B细胞 等，获得类似胚胎干细胞的一种细胞。诱导方法：将特定的基因、特定的蛋白或一些小分子化合物导入细胞中。过程:心肌烟胞iPS细胞用于治疗人类疾病示意图优点：无需破坏胚胎；可以来自病人自身的体细胞,从而避免发生免疫排斥反应。此，普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞(-)动物细胞融合技术与单克隆抗体1、概念动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。与植物体细胞杂交的区别：无需去除细胞壁；全能性受限制，不能培育成新的动物个体2、原 理：细胞膜的流动性3、融合方法:物 理：电融合法、离心法化 学：PEG融合法、高Ca2+高pH融合法生 物：灭活病毒诱导法(动物细胞融合特有)生物法介绍:病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝 聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。4、结 果：形成杂交细胞（注意不是植物的杂种细胞卜融合后形成的原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。5、融合过程：细胞膜融合T 细胞质融合T 细胞核融合6、杂交细胞的特点：具有两种细胞的遗传信息，杂种细胞表现出两个亲本细胞的特点。7、意 义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。8、植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较植物体细胞杂交动物细胞融合耐细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性处理的细胞不同来源的植物体细胞可同一个体甚至同一类型的细胞融合前处理的用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞诱导融合方法电融合法、离心法；聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法r结果杂种植株杂交细胞融合成功标志再生出细胞壁细胞核的融合mt打破组直隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能fits白菜-甘蓝等新作物制造单克 线用9、动物细胞融合的应用：研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别单克隆抗体的制备。10、单克隆抗体的制备(1)传统获得抗体的方法及缺点 每一个浆细胞只能产生一反复注射动物体内缺 点：产量低、纯度 YYY丫 丫单一抗体f B淋巴细胞 克隆1 产生B淋巴细胞群一单克隆抗体一种B淋巴细胞(只产生一种特定抗体)能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞既能迅速大量增殖，、又能产生产定楚比单克隆抗体做区杂交瘤细胞 金:的抗体发明者：英国米尔斯坦和德国科勒，获得了诺贝尔奖。(2)单克隆抗体的概念：由单个B淋巴细胞经过无性繁殖(克 隆)，形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。(3)制备过程:）勉a 文G M （*&又 工 金 机 体）注 射 定 的 加*种I1 3 蝴 施 与8*巴 城融合协 体 松 注 阳 性 的 余攵!*（分 法 的 执体 能 与 精 定 优始 仓）仔 种 中 文18后克帆体获得能产生抗体的B淋巴细胞：将特定的抗原注射到小鼠体内，一段时间后，从小鼠的脾中分离能产生特定抗体的B淋巴细胞（脾是动物体最大的免疫器官，内含大淋巴细胞，这些能产生抗体的B淋巴细胞有可能是本次抗原刺激产生的，也有可能是之前别的抗原刺激产生的）（只需获得即可，无需进行原代培养,否则增加后期筛选的工作量获得大的骨髓瘤细胞：从患骨髓瘤的小鼠体内提取骨髓瘤细胞进行体外扩大培养，无接触抑制。诱导细胞融合：物理、化学或生物法（最终至少有5种类型的细胞：A、B、AA、BB、AB、ABB、AAB 等 筛选杂交瘤细胞:在特定的选择培养基（HAT培养基）上进行筛选，未融合的亲本细胞和融合后具有同种核的细胞都会死亡，只有杂交瘤细胞能生长。此，得到多种杂交瘤细胞。（能大量增殖，但大多数杂交瘤细胞分泌抗体的性质不稳定，且分泌的不是特异性抗体。）杂交瘤细胞的克隆化培养和抗体检测：先对杂交瘤细胞进行有限稀释，然后将其分散至96孔板中，尽使每个孔中只含有一个细胞（虽然有时做不到），然后对这些细胞进行克隆化培养，使其增殖并产生抗体,（所谓的克隆化，即对一个细胞进行培养，使其增殖形成单一的细胞群），一段时间后，向每个孔中加入标记的特定抗原，根据抗原-抗体结合的特异性，就能筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。目标杂交瘤细胞的大规模培养：可以将目标杂交瘤细胞在体外配制培养液中进行增殖，也可以注射到小A A腹腔中进行增殖（腹水的环境条件接近小鼠的内环境）,然后从细胞培养液或小鼠腹水中获得单克隆抗体。项目 第 一 次 筛 选 第 二 次 筛 选（需 要 多 次 筛 选）傩;中 百 田 诱 导 融 合 后 得 到 多 种 杂 交 选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产瘴 述 原 因 细 胞，还 有 未 融 合 细 胞 等 生其他抗体的细胞。用特定的蝌培养基进行筛选：未融合的亲本细胞和融方法 合的具有同种核的细胞都会死 亡，只有融合的杂种细胞才能生长.用96孔板培养，在每个孔中尽量接种T杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足的能分泌所渤体的细胞。筛 选 结 果 筛选出融合的杂交瘤细胞 筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞项目腹腔培养体外培养优点易 于 控 制 培 养 条 件（如无需提供无菌 环 境 等），操 作 简 单，成本较低可 大 规 模 培 养，大量生产缺点 规 模 小，产量少 需要人为控制培养条件,成本相对较高(4)单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高、能大量制备(5)技术手段：动物细胞融合、动物细胞培养(6)原 理：细胞膜的流动性和细胞增殖11、单克隆抗体的应用1 )获得抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体时，需要向小r r；体内注射的抗原是什么？(人绒毛膜促性腺激素)ADC的作用机制示意图2）ADC（抗体一药物偶联物）由哪三部分组成？（特异性抗体、药物、接头），分别有什么作用？（抗 体：靶向运 输，通过识别靶细胞表面抗原将药物运输至靶细胞内,药 物：治 疗 作 用，接 头：连接抗体与药物）.此,ADC也被形象地称为“生物导弹”3）与抗体相连的药物有哪些？（细胞毒素（诱导肿瘤细胞 凋 亡X化学药物（阻断肿瘤细胞的信号通路以抑制其生 长X放射性同位素（靶向放疗）4）单克隆抗体诊断试剂盒和ADC的 应 用：前者检测的特异性和灵敏度大大提高,如早孕检测、艾 滋 病 检 测;后者能特异性杀伤肿瘤细胞，对其他细胞影响小，即靶点 清 楚，副作用小。5）单克隆抗体应用总结：诊断试剂（资 料1）运载药 物（资 料2）治疗疾病（三）动物体细胞核移植技术和克隆动物2017年，我国的科学家利用体细胞核移植技术成功克隆出两只殊猴“中中”和“华华”A坪合I、将动物的一个细胞的细 胞 核，移 入去核的卵母细 胞 中,使这个重新组合的细胞发育成新 胚 胎，继而发育成动物个体的技术。克 隆 动 物：用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。2、原 理：动物细胞核的全能性3、生 殖 方 式：无性生殖4、种 类：胚胎细胞核 移 植：细胞分化程 度 低，表现全能性容易。体细胞核移植：细胞分化程度高，表现全能性十分困难。5、非人灵长类动物体细胞克隆的困难原因:供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；对非人灵长类动物胚胎操作的技术尚不完善。6、体细胞核移植的过程1 ）供体细胞的采集与培养选择性状优良（如产奶量高）的奶牛，取其体细胞（如耳，一般不用生殖细胞）进行体外动物细胞培养，获得大量细胞，一般培养至10代以内（能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。），作为核供体。2）受体卵母细胞的采集与体外培养选择卵母细胞的原因:体积大，易操作；细胞质内含有促使细胞核体现全能性的物质；卵 黄 多，营养物质丰富体外培养至减数分裂II中 期（Mil期）:为不同动物排出的卵不是成熟的卵细胞，有可能是初级卵母细胞或次级卵母细胞。培 养 到Mil期的卵母细胞已发育成熟，细胞质中具有激活重构胚以及早期胚胎发育的必需因子。3）显微操作去除卵母细胞中的核去核原因:保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞。此时的“核”其 实 是Mil期的纺 锤 体染色体复合物，去核时同时吸走第一极体。去 核 方 法：显微操作法其 他 方 法：梯度离心、紫外光短时间照射、化学物质处理（使卵母细胞核DNA变性。）4）将供体细胞注入去核卵母细胞通过显微操作，将供体细胞直接注入去核卵母细胞的透明 带 内，而不是注入细胞核，这样能降低去核操作导致的供体核被 破 坏，提 高 成 功 率,同时操作较简单。5）电融合法促使两细胞膜融合供体细胞进入卵母细胞，形成重 构 胚,体现了细胞膜的流动性。重 构 胚：人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。6）激活重构胚物 理 法：电刺激化 学 法：Ca2+载体、乙醇和蛋白质合成抑制剂等目 的：使重构胚进行早期胚胎培养，完成细胞分裂和发育进程。7）将早期胚胎移入代孕母牛体内8）妊娠分娩与供体遗传物质基本相同的犊牛（性状取决于供体和受体，性别取决于供核亲本）7、克隆动物的遗传特点细胞核基因来自体细胞核供体，因 此，克隆动物的性状与体细胞核供体基本相同。细胞质基因来自卵母细胞此，克隆动物的性状与卵母细胞细胞质供体少部分相同。克隆动物的性状与代孕母体没有直接关系。生物的性状不完全由基因决定，环境也有重要影响。在胚胎发育过程中还可能发生基因突变、染色体变异。8、该过程中应用到的技术动物细胞培养、动物细胞核移植（核 心X动物细胞融合、早期胚胎培养、胚胎移植。动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合!胚胎移植从屠宰场收集牛卵巢，采集卵母细胞（研究人员正在使用设备从牛的卵巢采集卵母细胞），在体外培养到M i l期将供体细胞注射入去核的卵母细胞出生与供体奶牛遗传将胚胎移入受体4 4?唐i t太4：白田砧帖j i-殖、耳土麻rfa从供体高产奶牛身体的某一部位（如耳）上取体细胞，进行细施培养通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母Bil 与，反击 MI B N必高产奶I牛（供体）9、体细胞核移植技术的应用前景(1)加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育(2)培育的转基因克隆动物可作为生物反应器，生产医用蛋白药用置白因药用量自(3)克隆动物细胞、组织、器官可作为异种移植的供体；更深入了解胚胎发育及衰老过程、克隆特定疾病模型动物等(4)保护濒危物种，增加动物的存活数10、存在的问题：(1)成功率低(2)克隆动物存在健康问题如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等，易出现早衰(多利羊只活了 7年，而正常羊的寿命是12年左右)11、对克隆的理解克隆是指遗传组成完全相同的分子、细胞或个体，即克隆应包含三个层次的内容分子水平克隆：如DNA复 制；细胞水平克隆：如动物细胞培养；个体水平克隆：如克隆动物。四、胚胎工程1、为什么进行要胚胎工程？哺乳动物自 畜牧业上需要快速身 繁 殖 率 低 大 量 繁 殖 良 种 家 畜短内时间内可产生大量后代胚胎工程胚胎移植胚胎分割早期胚胎培养体外受精2、概念:指对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内生产 后 代，以满足人类的各种需求。胚胎工程技术包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等。工程实质：在体外条 件 下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟 操 作，并未改变个体发育的实际规律。理论基础：哺乳动物受精和早期胚胎发育的规律3、胚胎工程的理论基础（1 ）受精1 ）概 念：是精子与卵子（相互识别，细胞膜的信息交流）结合形成合子（即受精卵）的过程，包括受精前的准备阶段和受精阶段。场 所：输卵管2）准备阶段准备阶段1精子获能曲细精管输精管形成场所：睾丸内的曲细精管形成时期：从初情期开始直到生殖机能衰退形成过程:次级精母细胞 精细胞 精子精子变形:精子头出现f 顶 体（高尔基体）绵羊不同种动物精子的逊 相 似,大小略有不同,与动物的体型大小无关。精子获能:刚排出的精子不能立即与卵子受精，必须在雌性动物的生殖道发生相应的生理变化，才能获得受精能力。（注意不是获得能量）获能方法：A、在雌性动物生殖道内获能B、在人工配制的获能液（有效成分：肝素、Ca2+载 体）中获能；准备阶段2卵子的准备形成场所：雌性动物的卵巢（卵泡中）形成时期：胎儿性别分化后到生殖机能衰费1!形成过程：胎儿期由卵原细胞经过复制形成初级卵母细 胞，包裹在卵巢的卵泡中，初情期后，卵子从卵泡中排出，进入输卵管，这一过程称为排卵，一个卵泡中只能形成一个成熟卵子，不同动物排出的卵子成熟程度不同，有可能是初级卵母细胞，也有可能是次级卵母细胞，因此卵子不是指卵细胞，而是初级或次级卵母细胞及其外部的透明带等结构。排出的卵子，在输卵管中进一步成熟，直到减数分裂II中期（Mil期）才具备受精能力。因 此，卵细胞的形成过程是不连续的，减数分裂I在胎儿期就完成了，要等到初情期排卵时才开始减数分I成熟即泡1 -1未 成 蝴 卵 子）初级卵母细胞I 一马、犬次级卵母细胞+第一极体排 卵（无受精能力）猪、羊、牛而减数分裂II、受精作用、受精卵的早期细胞分裂都在输卵管中完成。3）受精阶段精子穿越 卵 细 胞 膜 外释 放 出 多 种 酶，以溶解这些结构的 结 构，如透明带精 子 触 及 卵 细 胞 膜 的 瞬 间，透明带#，阻精子触及卵细胞膜止后来的精子进入透明带透明带反应精子入卵卵细胞膜反应精 子 入 卵 后，卵细胞膜会立 即 发 生 生 理 反 应，拒绝其他精子再进入卵内阻止多精入卵的第一道屏障：透明带反应阻止多精入卵的第二道屏障：卵细胞膜反应雄原核第一极体雌原核精排成卵子完 成 殿 分 裂 口，释放放出第二极体第二极体,形成雌原核精 子 入 卵 后，尾部脱离，原有的核膜破裂并 形 成 一 个 新 的 核 膜，最后形成f比原来精 子 的 核 还 大 的 核,叫做雄原核。j峨、雄原核靠近雌 雄 原 核 充 分 发 育 后，相 向 移 动，彼 此 靠 近，核 膜 消 先 这个含有两仝体组的合壬就是核膜消失，形成受精卵。第一次卵裂即将开始受精卵。受精过程结束后，受精卵的发育也就开始了。y受精的标志：观察到两个极体或雌、雄原核。受精完成的标志：雌、雄原核融合成合子。（2）胚胎早期发育1）场 所：输卵管和子宫2）分裂方式：有丝分裂（受精卵的早期分裂称为卵裂）3）胚胎早期发育阶段：人卵细胞受精到受精卵卵裂后植入的过程桑甚胚，8细胞4细胞2细胞受精卵IY卵裂（细胞未分化）卵裂期概念：胚胎发育早期，有一段时间是在透明带内进行分裂，细胞数不断增加，胚胎总体积并不增加，这种受精卵的早期分裂称为卵裂。受精卵细胞分裂营养物质的来源是卵母细胞的细胞质。特点:K i-aw IT iiF_1-a l_ _ _ _ _ _ _ _ 细胞数目_ _ _ _ _ _ _ _每个细胞体积增*减小DNA总量增多每个细胞内的DNA总量不变有机物总量或少_ _ _ _ _ _ _ _ 物质种类_ _ _ _ _ _ _ _胚胎总体积增多不增加或略有减小桑茸胚概 念：当卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团，形似桑葺时，这时的胚胎称为桑黄胚。特 点：胚胎细胞数目 丝 个左右，这个阶段及之前的每一个细胞都具有发育成完整个体的潜能，具有全能性。囊胚胚胎进一步发育，细胞开始出现分化，形成滋养层和内细胞团，随着胚胎进一步发育，胚胎内部出现了囊胚 腔，囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程叫做孵化。囊胚腔透明带滋 养 层发育,胎盘和胎膜内细胞团重匕 胎儿的各种组织内细胞团细胞未分化，具有全能性原肠胚细胞继续分裂分化，分为外胚层、中胚层、内胚层三层，并进一步发育为不同的组织、器官、系统。全能细胞细胞分化受精-2-*-4-8 桑椎一囊胚*原肠胚工细 胞 细 胞 细 胞 帮 内W团|福层卵裂期 滋养层 滋养层|囊 胚 腔|外胚层原肠腔幼出生,性变哥分 化 体 发 育 个 体胚后发育胚胎发育3、胚胎工程技术及其应用胚胎工程技术：体外受精、体外胚胎培养、胚胎移植(1)试管动物是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎后，再经胚胎移植产生后代的技术。(2)体外受精1）过 程：包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精卵母细胞的采集方法A、输卵管采卵（冲取卵子）利用促性腺激素促使雌性动物排出更多的卵子，从输卵管中冲取卵子。适合小型实验动物如兔、羊等。B、屠宰动物的卵巢采卵从已屠宰的雌性动物体内摘取卵巢，再从卵巢中采集卵母细胞。适合大型动物如：牛、马等。C、活体采卵（卵巢中）借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等仪器，直接从活体动物卵巢中吸取卵母细胞。适合大型动物。精子的获能精液由精子和精浆两部分组成。精浆中含有一种能抑.制精子获能的 物 质,此在一般情况下，精液中的精子无法获能。精子获能前进行离心 处 理，目的是除去精浆以利于精子获能。然后在人工配制的获能液（加入了肝素、Ca2+载 体）中进行获能。受精一般情况下，可以将获能的精子和培养成熟的卵子置于获能溶液或专用的受精溶液中共同培养一段时间,来促使它们完成受精。Mil期卵母细胞体外受精卵集 成熟培养尸.获 能 处 理获能精子精子离心处理 新鲜或解冻的精液,适当的培养液受精卵培养.2）意 义：是提高动物繁殖能力的有效措施，可以为胚胎移植提供可用胚胎（3）胚胎移植1 ）概 念：指将通过体外受精及其他方式得到的 胚 胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术供 体：提供胚胎的个体受 体：接受胚胎的个体无性生殖有性生殖体勺陵精-体内受精-转入目的