2023年分子生物学实验指导.docx

生物科技行业分子生物学试验指导分子生物学试验指导动植物检疫专业2023，2分子生物学试验留意事项1课前要提前预习试验内容，了解试验设计的原理，理清试验挨次，制定试验方案没有方案或方案不合理者不能进入试验操作。 2由于试验内容多，时间短，多数试验需要同时或穿插进展，壹定要做好统筹安排。3试验课中的全部单项试验都属于壹个整体流程。试验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，壹切听从试验进度，必需在理论课上课期间完成。 4试验的每壹步都要具体地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！5对任何自己不生疏的试验仪器都不要随便操作尤其是微量移液器！。在操作的过程中觉察任何意外的现象都要准时向任课教师汇报。 6写作试验报告或试验论文壹定要文理通顺、规律清楚、图表说明具体，争论分析透彻。7. 在试验室内不能大声喧哗。8. 在试验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里或先放在自己的桌面壹角，严禁随地丢弃！特别留意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。9. 试验完毕后要把用过的器皿清洗后归放整齐且清点数目，向教师汇报征得同意前方可离开试验实。10. 值日组的同学最终离开，等待清扫试验室的卫生，关闭门窗水电。11. 试验时损坏的任何物品都要准时申报。试验壹质粒 DNA 的提取1. 目的学会最常用的小量制备质粒 DNA 的碱裂解方法。2. 原理依据共价闭合环状质粒 DNA 和线性 DNA 在拓扑学上的差异来分别。在 pH12.0 12.5 这个狭窄的范围内，线性 DNA 双螺旋构造解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒 DNA 也会变性，但俩条互补链彼此相互盘绕，仍会严密结合在壹起。当参加pH4.8 的乙酸钾高盐缓冲液使 pH 恢复中性时，共价闭合环状质粒 DNA 复性快，而线性的染色体DNA 复性缓慢，经过离心和蛋白质和大分子RNA 壹起沉淀下去。3. 器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml 微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。4. 试剂pMD18-T-F 载体菌， LB 培育基1000ml含 100ug/ml 氨苄青霉素，葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液溶液 I，NaOH/SDS 溶液(溶液 II)，KAc 溶液pH4.8(溶液 III)， RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbufferpH8.0。5. 试验预备氨苄青霉素储存液无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C 保存，配制 LB 培育基胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl10g 加 200mLddwater 搅拌完全溶解，用约 200mL5NNaOH 调 pH 至 7.0，加 ddwater 至 1L，121°C20min 灭菌；溶液 I50mmol/L 葡萄糖， 25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0；溶液 II0.2mol/LNaOH，1%SDS；溶液 III60mL5mol/LKac，加冰乙酸调 pH4.8，补 ddwater 至 100ml，70%乙醇-20°C保存，TEbuffer10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0；10mg/mLRNaseARNA 酶 A 溶于 10mmol/LTrisHClpH7.5，15mmol/LNaCl 中；摇菌试管洗净且盖上棉花塞、 1.5ml 离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，壹起高压灭菌121°C30min。6. 操作步骤（1） 在超净工作台中取 5mlLBAmp+，参加灭菌的摇菌管中。（2） 从超低温冰箱中取出保存 pMD-18T-F 的菌种操作完后快速把菌种放回超低温冰柜中，切不行将菌溶化！，在超净工作台上用烧红的接种环刮壹下，再把接种环于无菌 LB 培育液含 100ug/ml 氨苄青霉素中搅拌壹下，37°C 摇床中摇 20h。（3） 取 1.5ml 的菌液于 1.5ml 离心管中，15000rpm 离心 1min，弃上清液尽量弃干净，留沉淀备用。（4） 在沉淀中参加 100ml 溶液 I，盖上盖后马上在涡旋混合器上混匀，室温下静置 5min。等待的同时，取壹个塑料盒，装上适量的冰块备用。（5） 参加 200ml 溶液 II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（6） 参加 150ml 溶液 III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。715000rpm 离心 5min，留神吸取 400ml 上清液于另壹个干净的 1.5ml 离心管中，不要将白色沉淀物带入！，参加 800ml95%乙醇，盖上盖后马上在涡旋混合器上混匀，室温下静置 5min。815000rpm 离心 10min，留神弃掉上清液，参加 500ml70%乙醇，盖上盖后马上在涡旋混合器上混匀。15000rpm 离心 10min，留神弃掉上清液，尽量倒置弃干净（9） 再参加 500ml70%乙醇，盖上盖后马上在涡旋混合器上混匀。15000rpm 离心10min，留神弃掉上清液，尽量倒置弃干净（10） 离心管倒置于37°C 培育箱中或室温空气枯燥。管底的沉淀质粒 DNA 用肉眼几乎见不见！。（11） pMD18-T-F 参加 30ml 无菌蒸馏水或 TE 缓冲液，用记号笔标记后放入冰箱中备用。（12） 在剩余的菌液中倒入少许 84 消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块壹起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写试验报告7. 思考1影响本试验结果的因素有哪些？试验二、质粒 DNA 的酶切1. 目的学会用限制性内切酶切割质粒 DNA。2. 原理II 型限制性内切酶能识别双链 DNA 内部的特别序列且在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA 混合物能够确认和分别酶切片段。3. 器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。4. 试剂pMD18-T-F 质粒，EcoRI，BamHI，内切酶缓冲液10×，10×电泳加样缓冲液5. 试验预备配制 TAE 电泳缓冲液50´储存液，1000´溴化乙锭储存液0.5mg/ml，10´加样缓冲液， 1.5ml 离心管装入铝制饭盒灭菌、移液器吸头装入相应的吸头盒灭菌6. 操作步骤（1） 混合以下溶液于壹个无菌的 1.5ml 微量离心管中： pMD18-T-FDNA(或 pUCm-T-F)6L10×酶切缓冲液用 EcoRI 的缓冲液2L ddwater30LEcoRI1L BamHI1L 总体积 40L（2） 先预备壹个冰盒且放入壹定量的冰块。从-20冰柜中取出限制性内切酶，马上插入冰块中。（3） 用壹只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部以免手指的给酶液加温，另壹只手持微量移液器，留神翼翼地吸取 1L 限制性内切酶。（4） 在酶切样品混合液中参加限制性内切酶后马上把内切酶原液送回冰柜！，轻轻震惊微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中 1000rpm 离心 10 秒。取出后插到水漂的孔中，在推举的最适酶切温度水浴中温育1-3h壹般是 37。（5） 酶切后取少量酶切产物和适宜的分子量的DNA如从前的 PCR 产物比照电泳， 以确认切下的片断是否为自己想要的片断。（6） 酶切后的质粒能够回收备用。（7） 清理桌面垃圾，清洗试验仪器。撰写试验报告。7. 思考（1） 酶切反响混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？（2） 如何估量 DNA 用量和酶的用量？（3） 在吸取内切酶的时候如何操作才能别免铺张？试验三、质粒 DNA 的 PCR 扩增1. 目的学会 PCR 操作的根本技术。2. 原理是将待扩增的 DNA 模板加热变性，和其俩侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA 聚合酶延长。再进入下壹轮变性复性延长的循环，n 次循环后DNA 可被扩增1+X n 倍。其中<25nt 的引物退火温度Tm=2A+T+4G+C。3. 器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR 微量管，双面微量离心管架， PCR 仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。4. 试剂3U/lTaqDNA 聚合酶，PCR 缓冲液10×，MgCl2free，25mMMgCl2，dNTP，引物，模板质粒 pMD18-T-F，无菌 ddwater。5. 试验预备dNTP 混合液每种25mM，TAE 电泳缓冲液，1000´溴化乙锭储存液0.5mg/ml，10´加样缓冲液，1.5ml 离心管装入铝制饭盒灭菌、移液器吸头装入相应的吸头盒灭菌。合成的引物：Senseprimer5”-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3” Antisenseprimer5”-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3”目的基因模板质粒：已经克隆在 pMD18-T-F 载体上的 781bpNDV-F 基因。待扩增的F 片段长度：837bp。6. 操作步骤（1） 在 0.2mlPCR 微量离心管中配制 50l 反响体系。ddwater32l10×PCRbuffer不含 MgCl25l 25mMMgCl23l2.5mmol/LdNTP4l每种 dNTP 终浓度 0.2mM10mol/LPrimer12l12.525pmoles 10mol/Lprimer22l12.525pmoles 模板质粒 1l1×10-3pmoles3U/lTaq 酶 1l3u 总体积 50l（2） 依据厂商的操作手册设置 PCR 仪的循环程序：945min941min601min721min50sgoto29times7210min（3） PCR 完毕后，取 10l 产物进展琼脂糖凝胶电泳。观看胶上是否有估量的主要产物带。（4） 清理桌面，撰写试验报告。7. 思考（1） 复性温度如何确定？（2） 为什么要在最终延长 10min？（3） 是否有非特异性扩增产物或引物二聚体，如何才能消退？试验四、DNA 电泳鉴定1. 目的学会常用的 DNA 琼脂糖凝胶电泳、。2. 原理DNA 双螺旋分子骨架俩侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的 DNA 由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3. 器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml 三角瓶，微波炉，台式离心机， 旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml 离心管，双面微量离心管架，试管架等。4. 试剂pMD18-T-F 载体，TAE 电泳缓冲液，1000´溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液或 6´加样缓冲液，DNA 分子量标准lDNAHindIII:23130，9420，6560，4360， 2320，2030，560，130bp。5. 试验预备配制 TAE 电泳缓冲液 50´ 储存液， pH 约 8.5 ： Tris 碱 242g ， 57.1ml 冰乙酸， 37.2gNa2EDTA.2H2O，ddwater 定容至 1L，1000´溴化乙锭储存液0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于 100mLddwater， 4°C 避光储存， 10´ 加样缓冲液 20%Ficoll400 ， 0.1mol/LNa2EDTApH8.0，1.0%SDS，0.25%溴酚蓝；6´加样缓冲液0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液；1.5ml 离心管装入铝制饭盒灭菌、移液器吸头装入相应的吸头盒灭菌。 6操作步骤（1） 称取 0.5g 琼脂糖粉，放入三角瓶，参加 50mlTAE 电泳缓冲液(1´)，放入微波炉中烧开1min。50ml 正好倒俩块小胶。（2） 留意观看烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停顿微波炉切不行让胶溶液溢出到微波炉中！。（3） 戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手约50-60°C。（4） 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至和模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置 10-20 分钟待胶完全凝固。剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用。（5） 在水平电泳槽中加满1´TAE 电泳缓冲液。依据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，留意正负电极的位置连接正确。（6） 待胶完全凝固后15-20 分钟，留神拔出梳子。用手指捏住模具俩侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的壹侧要朝向电泳槽的负极。（7） 剪 1 片光面纸或封口膜，点 6ml 蒸馏水、1ml10´加样缓冲液，再参加 3ml 质粒DNA溶液制成 10mlDNA 样品。（8） 在凝胶上选择相邻的加样孔。用10ml 的吸液头分别将管中的样品参加凝胶的加样孔中假设需要时，在相邻的加样孔中参加 1.5-3mlDNA 分子量标准物。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另壹只手扶住这只手的手腕，以削减移液器的抖动。见到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不行使蓝色样品流到孔外。（9） 翻开电源开关，样品将形成壹条蓝色的横带向前移动假设觉察蓝色向后移动，马上关闭电源，调换电极。电泳将进展约 30min。（10） 当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm 时，关闭电源。取出模具和凝胶。（11） 把凝胶留神反扣放入盛有EB 的搪瓷盒中。放置约10 分钟后，取出用自来冲洗俩次。放入凝胶成像系统中拍照。（12） 清理垃圾。染有 EB 的凝胶要放到专用的垃圾袋中作特地处理，以免污染环境。（13） 撰写试验报告。7思考（1） 泳道中的质粒 DNA 有几条带？为什么？（2） 溴酚蓝的迁移率相当于多少 bp 的 DNA?（3） 影响本试验结果的因素有哪些？