T_CACM 1485-2023 水蛭（蚂蛐)质量控制技术规范.docx

ICS 11.020CCS C 05团体标准T/CACM 14852023水蛭（蚂蟥）质量控制技术规范Technical specification for quality control of Whitmania pigra2023 - 04 - 17 发布2023 - 04 - 17 实施中 华 中 医 药 学 会发 布全国团体标准信息平台T/CACM 14852023目次前言 . II引言 . III1范围 . 12规范性引用文件 . 13术语和定义 . 14外观性状 . 25采收加工 . 25.1产地 . 25.2采收加工方法 . 25.3可追溯性 . 36检查 . 36.1金属杂质 . 36.2二氧化硫残留量 . 36.3其他检查项 . 37指纹图谱 . 38包装 . 49运输 . 410贮藏 . 411其他 . 5附录 A（资料性）水蛭（蚂蟥）的基原研究（DNA 条形码） . 6附录 B（资料性）水蛭（蚂蟥）的可追溯体系示例 . 7附录 C（规范性）中华人民共和国药典对水蛭（蚂蟥）的相关规定 . 9参考文献 . 11I全国团体标准信息平台T/CACM 14852023前言本文件参照 GB/T 1.12020标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国医学科学院药用植物研究所提出。本文件由中华中医药学会归口。本文件起草单位：中国医学科学院药用植物研究所、牡丹江友搏药业有限责任公司、天津中医药大学、北京友博药业有限责任公司。本文件主要起草人：韩建萍、李振国、田晓轩、务勇圣、倪开岭、郝明、郑顺亮、周剑波、张立强、杜宇生、王永宽、王士青、朱志国、王功涛、周桂芳、刘文堂、张孝晨、臧德法。II全国团体标准信息平台T/CACM 14852023引言蚂蟥（Whitmania pigra）在 2020 年版中华人民共和国药典收载的中药名为水蛭，是中药水蛭（Hirudo）的基原动物之一。目前，水蛭（蚂蟥）的产区主要集中在山东省、安徽省、江苏省等地，多为野生资源；由于地域不同和种原差别，水蛭（蚂蟥）的药理作用可能存在差异；采集初加工有矾制、清水吊干等方法，对中药尤其是中药注射剂的质量稳定性影响较大。为进一步保障原料基原正确、稳定，中成药原料资源可持续发展，确保中成药疗效，提高水蛭（蚂蟥）的质量标准，制定质量控制技术规范是十分必要的。本文件在2020年版中华人民共和国药典标准基础上，新增描述了水蛭（蚂蟥）的采收加工方法（含可追溯性）、金属杂质检测及中药指纹图谱等。本文件为药材采集者、消费者、生产者、经销商、政府等相关方在水蛭（蚂蟥）的采集、选购、生产、经营、质量追溯管理以及保护与监管等方面提供依据。III全国团体标准信息平台T/CACM 14852023水蛭（蚂蟥）质量控制技术规范1范围本文件规定了水蛭（蚂蟥）的外观形状、采收加工、检查、指纹图谱、包装、运输和贮藏等相关要求。本文件适用于来源为水蛭科动物蚂蟥（Whitmania pigra）的水蛭药材的质量控制活动。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国药典（2020年版一部）中华人民共和国药典（2020年版四部）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1蚂蟥dried hirudo水蛭科动物蚂蟥（whitmania pigra）的干燥全体。来源：中华人民共和国药典（2020年版一部）3.2追溯traceability通过记录和标识，追踪和溯源客体的历史、应用情况或所处位置的活动。注：追溯包括追踪和溯源两个方面。来源：GB/T 381552019， 2.23.3盐货 salted hirudo运用盐制法加工的蚂蟥。注：基本操作如下：将蚂蟥放入器皿内，按一层盐一层蚂蟥装满器皿，将死后的蚂蟥干燥而得。1比较项目蚂蟥（whitmania pigra）柳叶蚂蟥（whitmania acranulata）水蛭（hiruto nipponica）形状扁平纺锤形狭长而扁扁长圆柱形，体多弯曲扭转宽cm0.520.10.50.20.3长cm41051225准信息平标全国团体台T/CACM 148520233.4碱货 hirudo processed with soda运用碱烧法加工的蚂蟥。注：基本操作如下：将蚂蟥与食用碱的粉末同时放入器皿内，上下翻动蚂蟥，边翻边揉搓，待蚂蟥收缩变小后，再洗净干燥而得。4外观性状呈扁平纺锤形，有多数环节，长 4 cm10 cm，宽 0.5 cm2 cm。背部黑褐色或黑棕色，稍隆起，用水浸后，可见黑色斑点排成 5 条纵纹；腹面平坦，棕黄色。两侧棕黄色，前端略尖，后端钝圆，两端各具 1 吸盘，前吸盘不显著，后吸盘较大。质脆，易折断，断面胶质状。气微腥。水蛭（蚂蟥）的基原研究（DNA 条形码）见附录 A。不应检出水蛭其它基原物种，蚂蟥与水蛭其它基原物种外观性状区别要点见表 1。表 1 蚂蟥与水蛭其它基原物种外观性状区别要点5采收加工5.1产地主产区为山东微山湖（东经116°34117°21，北纬34°2735°20）产区，辅助产区为位于同一水系京杭大运河的江苏省扬州市宝应县（东经119°07119°42，北纬33°0233°24之间）产区和安徽省安庆市宿松县（东经115°52116°3440，北纬29°472030°2530之间）产区。（参见图A.2）5.2采收加工方法夏、秋二季捕捉，借助地笼、渔网等工具或人工捕捉水蛭（蚂蟥），选出虫体长度6 cm15 cm的蚂蟥，未达到6 cm的将其放生，以保证资源的可持续利用。将筛选后的蚂蟥用清水冲洗干净，用钢丝或线绳自尾部穿过，悬挂在阳光充足的场地进行晾晒，其间做好防护措施，避免蝇虫侵害。晾至成型半干后从钢丝或线绳上取下，平铺至网布上继续晾干，水分控制在18.0%以下，保存在干燥处，不得有霉变、腐烂、虫蛀。盐货、碱货等其他加工方式不予采用。2时间min流动相 A%流动相 B%051000510100990110509901100国团体标准全信息平台T/CACM 148520235.3可追溯性通过利用现代信息技术建立的药材追溯体系，对影响药材质量的关键追溯点进行明确，供应商或农户宜通过移动通信终端即时通信小程序录入药材采收追溯数据（包括：农户姓名、身份证号码、手机号，收货编号、药材品种、药材规格、产地、药材重量、收货日期、特记事项，产地省市区、产地详细地址、产地坐标、产地图片，采收时间、采收过程图片及视频，晾晒时间、晾晒过程图片及视频）实现四大环节的可追溯，即追溯到农户（实名登记）、追溯到产地（自动定位）、追溯到环境（产地照片）、追溯到药材（收获数量），以保障水蛭（蚂蟥）的可追溯性。（微信示例见附录B）。6检查6.1金属杂质使用具有自动剔除金属异物功能的金属检测机，对药材进行逐一检测，直至剔除所有掺入金属杂质的个体。合格药材中不得检出金属杂质。6.2二氧化硫残留量按照中华人民共和国药典（2020年版四部）通则2331二氧化硫残留量测定法测定，二氧化硫残留量不应超过150 mg/kg。6.3其他检查项水分、总灰分、酸不溶性灰分、酸碱度、重金属及有害元素、黄曲霉毒素等检查项均应符合中华人民共和国药典（2020年版一部）对水蛭（蚂蟥）的相关规定（附录 C）。7指纹图谱按照中华人民共和国药典（2020年版四部）通则 0512中高效液相色谱法测定。色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为25 cm，内径为4.6 mm，粒径为5 µm）；以0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液为流动相 A，以50%甲醇为流动相 B，按照表2的规定进行梯度洗脱；检测波长为254 nm；柱温为室温；流速为每分钟0.8 mL。理论板数按次黄嘌呤峰计算应不低于7000。表 2 洗脱梯度参照物溶液制备：取次黄嘌呤对照品 10 mg，精密称定，置 100 mL 量瓶中，加 0.01 mol/L 磷酸二3全国团体标准信息平台T/CACM 14852023氢钾溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。供试品溶液制备：取水蛭（蚂蟥）最粗粉 1 g，精密称定，置离心管中，加 0.9氯化钠溶液 10 mL，室温放置 16 h，离心，取上清液用微孔滤膜（0.45 µm）滤过，即得。测定法：分别精密吸取参照物溶液 10 L 与供试品溶液 6 L，注入液相色谱仪，记录 50 min 内的色谱图。按中药色谱指纹图谱（图 1）相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度应大于 0.90。图 1 水蛭（蚂蟥）对照指纹图谱（峰 3：次黄嘌呤）8包装包装上应当有清晰标签，不易脱落或者损坏；标示内容包括品名、来源、规格、产地、数量或重量、采收日期、包装日期、保质期等信息。9运输运输工具应具较好的通气性，以保持干燥。在阴雨天，应严密防雨、防潮。在运输过程中，所用搬运工具必须洁净卫生，不能引入污染。10贮藏置干燥处，防蛀。4全国团体标准信息平台T/CACM 1485202311其他【鉴别】、【含量测定】应符合中华人民共和国药典（2020年版一部）对水蛭（蚂蟥）的相关规定（附录 C）。5全国团体标准信息平台T/CACM 14852023附 录A（资料性）水蛭（蚂蟥）的基原研究（DNA 条形码）通过基原研究（DNA 条形码）和产地研究来进一步明确水蛭（蚂蟥）的产地。水蛭（蚂蟥）外形见图 A.1。图 A.1水蛭（蚂蟥）（左-背面观，右-腹面观）（“正品蚂蟥与常见混伪品如光润金线蛭、菲牛蛭等形态差异很大，容易鉴别。参照中华人民共和国药典 2020 年版四部） 中药材 DNA 条形码分子鉴定法指导原则”完成了水蛭（蚂蟥）DNA 条形码鉴定研究。通过对山东省微山地区 3 批约 3400 条水蛭进行研究，蚂蟥占比均为 100%，不同批次蚂蟥基原稳定。将水蛭（蚂蟥）主产区确定为山东微山湖(东经 116°34117°21，北纬 34°2735°20)产区，辅助产区确定为位于同一水系京杭大运河的江苏省扬州市宝应县（东经 119°07119°42，北纬 33°0233°24之间）产区、安徽省安庆市宿松县（东经 115°52116°3440，北纬29°472030°2530之间）产区（采集了辅助产区多批次样品，按质量标准进行检测，符合质控要求），保证原料品质稳定。主产区地域分布见图 A.2。图 A.2水蛭（蚂蟥）主产区6全国团体标准信息平台T/CACM 14852023附 录B（资料性）水蛭（蚂蟥）的可追溯体系示例水蛭（蚂蟥）药材目前大部分通过野生捕捉获得，针对这一特点，结合中药质量追溯体系发展现状和追溯政策要求及相关标准，利用互联网、物联网技术，建立从野生捕捉到市场流通的水蛭（蚂蟥）药材追溯体系，结合广大农户的文化水平和手机微信的普及度，最终确定通过手机微信小程序录入原料采收追溯数据。水蛭（蚂蟥）追溯体系可以向所有供应商开放帐号，供应商通过手机端微信小程序进行登陆，在药材采收时进行数据的录入工作，包括产地定位、采收人员信息、采收现场图片/视频和采收数量等信息。供应商或农户在打开小程序后，可以看到对应原料的药典质量标准和团体标准规定。这些内容以图片、文字、视频等多媒体的方式展示，便于农户直观查看和学习，主要包括采收方式、加工方法、挑选的质量要求等内容，可作为供应商或农户采收和加工药材的参考标准。水蛭（蚂蟥）药材的追溯体系建立了四大追溯环节，18 个关键质量追溯点（包括：农户姓名、身份证号码、手机号，收货编号、药材品种、药材规格、产地、药材重量、收货日期、特记事项，产地省市区、产地详细地址、产地坐标、产地图片，采收时间、采收过程图片及视频，晾晒时间、晾晒过程图片及视频）。可追溯到农户（实名登记）、追溯到产地（自动定位）、追溯到环境（产地照片）、追溯到药材（收货数量），实现对水蛭（蚂蟥）药材的追溯，确保其质量和安全。图B.1为药材追溯小助手（微信小程序）中的相关截图信息，包括药材溯源登记、药材发货登记、农户档案溯源、药材档案信息和供应商资质信息等。7国全团体标准信息平台T/CACM 14852023图 B.1 水蛭（蚂蟥）-药材追溯小助手（微信小程序）8全国团体标准信息平台U=  1  1𝐶  𝑉 （C.1）T/CACM 14852023附 录C（规范性）中华人民共和国药典对水蛭（蚂蟥）的相关规定以下为中华人民共和国药典（2022年版一部）对水蛭（蚂蟥）【性状】、【鉴别】等的相关规定。【性状】蚂蟥呈扁平纺锤形，有多数环节，长4 cm10 cm，宽0.5 cm2 cm。背部黑褐色或黑棕色，稍隆起，用水浸后，可见黑色斑点排成5条纵纹；腹面平坦，棕黄色。两侧棕黄色，前端略尖，后端钝圆，两端各具1吸盘，前吸盘不显著，后吸盘较大。质脆，易折断，断面胶质状。气微腥。【鉴别】取本品粉末 1 g，加乙醇 5 mL，超声处理 15 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取水蛭对照药材 1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则 0502）试验，吸取上述两种溶液各 5 µL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（4:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙醇溶液，在 105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；紫外光灯(365 nm)下显相同的橙红色荧光斑点。【检查】水分不得过18.0%（通则0832第二法）。总灰分不得过8.0%（通则2302）。酸不溶性灰分不得过2.0%（通则2302）。酸碱度取本品粉末（过三号筛）约1 g，加入0.9%氯化钠溶液10 mL，充分搅拌，浸提30 min，并时时振摇，离心，取上清液，按照pH值测定法（通则0631）测定，pH值应为5.07.5。重金属及有害元素按照铅、镉、砷、汞、铜测定法（通则2321原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法）测定，铅不得过10 mg/kg、镉不得过1 mg/kg、砷不得过5 mg/kg、汞不得过1 mg/kg。黄曲霉毒素按照真菌毒素测定法（通则2351）测定。本品每1000 g含黄曲霉毒素B1不得过5µg，黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素B1的总量不得过10 µg。【含量测定】取本品粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液5 mL，充分搅拌，浸提30 min，并时时振摇，离心，精密量取上清液100 µL，置试管（8 mm×38 mm）中，加入含0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（临用配制）200 µL，摇匀，置水浴中（37±0.5）温浸5 min，滴加每1 mL中含10单位的凝血酶溶液（每4 min滴加1次，每次2 µL，边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按式（C.1）计算：𝐶 𝑉2 2式中：U每g含凝血酶活性单位，单位为个每克(U/g)；C1凝血酶溶液的浓度，单位为微升每毫升(µL/mL)；9全国团体标准信息平台T/CACM 14852023C2供试品溶液的浓度，单位为克每毫升 (g/mL)；V1消耗凝血酶溶液的体积，单位为微升(µL)；V2供试品溶液的加入量，单位为微升(µL)。中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。本品每1 g含抗凝血酶活性应不低于3.0 U。注 1：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液的配制：取 0.2 mol/L 三羟甲基氨基甲烷溶液 25 mL 与 0.1 mol/L 盐酸溶液约40 mL，加水至 100 mL，调节 pH 值至 7.4。注2：凝血酶溶液的配制：取凝血酶试剂适量，加生理盐水配制成每1 ml含凝血酶10个单位的溶液（临用配制）。【性味与归经】咸、苦，平；有小毒。归肝经。【功能与主治】破血通经，逐瘀消癥。用于血瘀经闭，癥瘕痞块，中风偏瘫，跌扑损伤。【用法与用量】1 g3 g。【注意】孕妇禁用。10全国团体标准信息平台T/CACM 14852023参 考文献1 GB/T 381552019重要产品追溯追溯术语2 李振国. 一种水蛭指纹图谱的建立方法和水蛭药材的鉴别方法：中国，200610001835.4 P.2006-01-24.3 臧德法, 叶雄平, 牟长军. 标准化健康养水蛭 M. 化学工业出版社, 2016.4 韩建萍, 宋经元, 姚辉, 等. 中药材 DNA 条形码鉴定的基因序列比较 J. 中国中药杂志,2012, 37(8): 1056-1061.5 陈晓辰, 宋经元, 董林林, 等. 宏基因组学与道地药材研究J. 中草药, 2012, 43(12):2315-2319.6 刘晓帆, 刘春生, 杨瑶珺,等. 基于 COI 基因的水蛭及其混伪品的 DNA 条形码研究 J. 北京中医药大学学报, 2013, 1(1): 63-66.7 李振国, 田晓轩, 张环宇, 王文秀, 倪开岭, 郝明, 张孝晨, 张立强, 等. 一种引物组合物及其在鉴定宽体金线蛭中的应用：中国，201911127667.7 P. 2019-11-18.8 陈士林, 姚辉, 韩建萍, 等. 中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则 J. 中国中药杂志,2013, 38(2): 141-148.9 李振国, 陈艳明, 务勇圣. 一种水蛭的 DNA 条形码分子鉴定方法：中国，201410162545.2 P.2014-04-21.10 倪开岭，张艳春. 水蛭、地龙仓储变质的原因分析 J. 牡丹江师范学院学报（自然科学版）, 2003(2): 10-11.11 刘武占，范建伟，李艳芳，邱新建，刘向东，苏瑞强，赵志全.HPLC 法同时测定水蛭(蚂蟥)中 7 个成分的含量J. 药物分析杂志，2014，34(8): 1417-1421.11