2023年版：高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识.docx

2023 版：高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用标准化专家共识全文宏基因组下一代测序 mNGS 技术直接针对标本中核酸无偏倚检测 病原微生物序列。但是， mNGS 需经标本前处理、核酸提取、文库制 备、上机测序、数据库比对、报告生成及结果解读等一系列过程，对 技术平台及人员素养要求较高。 为标准 mNGS 技术在感染性疾病诊断中的应用，提高危急重症、疑难感染性疾病和发突发传染病的救治水平，在多项国家科技专项的支持下， 本领域有关专家起草了本共识，以促进 mNGS 技术的标准应用和良性进展。 快速准确的微生物鉴定技术始终是临床微生物关注的焦点。传统微生物检验，诸如形态学、培育、抗原抗体及靶向核酸检测等方法在解决疑难及未知病原微生物上存在局限性1, 2 。型宏基因组下一代测序metagenomics next-generation sequencing ，mNGS 技术直 接针对样本中全部核酸进展无偏性测序，结合病原微生物数据库及特 定算法，检测样本中含有的可能病原微生物序列。随着该技术的社会经济本钱不断降低和技术的不断完善，已渐渐从科研走向临床应用，成为临床疑难和未知病原微生物检验的重要手段3。利用 mNGS 技术进展病原微生物检测需经样本前处理、核酸提取、文库制备、上机 测序并满足测试的质量掌握要求后，承受特定算法软件与专用的病原微生物数据库进展比对，实现对病毒、细菌、真菌、寄生虫及非经典及发突发传染病的病原体觉察具有独特价值6, 7 。微生物等的检测 1， 4, 5 。mNGS 技术不依靠培育，对常见病原微生 物检验阴性、阅历治疗失败、不明缘由的危急重感染的病原学诊断以16，组织本领域有关专家起草了本共识，以促进mNGS 技术的规为进一步标准 mNGS 技术在感染性疾病诊断中的应用， 提高危急重症 和疑难感染性疾病的诊疗水平，在多项国家科技专项的支持下，参考 国内外相关文献、共识与标准 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ，特别借鉴了高 通量测序技术临床检测标准化应用北京专家共识第一版通用局部 范应用和良性进展。本共识中声明的内容为专家争论并推举的要点。 一、临床应用的根本要求 一适应证基于医学决策的 mNGS 病原微生物检测申请， 一般用于传统检验方法未能给出明确病原学结果从而影响患者准确诊疗的感染性疾病、发 突发传染病、验证常规检验结果或排解其他发热疾病。推举临床通过 拟诊先行传统微生物检验及聚合酶链反响 polymerase chain reaction ，PCR 检测拟诊疑似常见病原微生物，不盲目使用mNGS技术。在必要或紧急状况下，如危急重症、疑难感染、群体性感染事件等，可考虑作为一线检测方法。 表 1 列出了 mNGS 临床应用适应性说明。临床上在选择 mNGS 进展病原微生物确认时应留意如下事项。1. mNGS 检测申请表： mNGS 检测试验室应供给适合临床使用的申请表。除患者根本信息外，申请单应包括标本类型、拟诊、现病史、既往史、流行病学史、关注的病原体、抗菌药物使用史等。另外，申 请表中应列出不同测序工程及适用范围供医生选择。2.靶向基因测序：基于高通量测序技术的病原微生物检测，除无偏倚的 mNGS 外，还包括原核生物的16S rRNA 基因、真菌 5S rRNA基因两端的 ITS1 、ITS2 及 25-28S rRNA 基因中的 D1 及 D2 区等 以及特定病原微生物靶基因等17。如疑心沙眼衣原体可选momp 主要外膜蛋白基因 ， 疑心结核分枝杆菌 Mycobacterium tuberculosis ，MTB 可选 rpoB 等靶向基因测序 18, 19, 20, 21 。临床医生通过测序试验室供给的工程清单项选择择适宜的工程，切忌大撒网式排查。 3. DNA 测序与 RNA 测序的选择：mNGS 技术理论上可检测以核酸为遗传物质的全部病原微生物。假设临床上已排解病毒感染，可直接进展DNA 测序。考虑到 DNA 测序受人源基因组影响较大，为避开因死亡中的 DNA 和 RNA 进展测序。 mNGS 技术本身是一种核酸检测技术，由于不同微生物类别本身构造差异，其核酸释放效率差异明显，尤其微生物 DNA 残留影响现症感染推断， 可进展 RNA 测序14，22, 23 。当疑心病毒感染， 尤其对呼吸道、 脑脊液cerebrospinal fluid ，CSF 及血液标本，或临床表现简单，无特定疑心方向时，需要同时对样本 是真菌、分枝杆菌等核酸提取需要特定的破壁处理，对于疑似真菌或 分枝杆菌感染时也应特别提出，在检测过程中增加必要的样本处理过 程。 4.mNGS 技术的局限性：受临床mNGS 技术本身、测序本钱及数据库等影响， 常规 mNGS 策略常无法获得样本中全部微生物的序列，临床标本中低浓度致病微生物可能会漏检，同时针对特定的耐药或毒力基因的分析亦较难实现 5。假设需要对耐药基因或毒力基因进展分请者如有特别要求应加以注明。析，可以承受特定方法去除局部人源宿主核酸以提升微生物基因组比 例，或者结合耐药相关基因或毒力基因进展靶向捕获富集后进展。申二标本类型及采集标准类别微生物核酸的提取效率。理论上，凡存在于临床标本中的病原微生物均可通过mNGS 检出，但该技术的准确性依靠标本中微生物的核酸质量及含量，也依靠于不同1.血液及高凝标本：持针器肘静脉采集 35 ml试验室供给专用采血 管，即游离 DNA 样本保存管， 内含乙二胺四乙酸ethylene diamine tetraacetic acid ，EDTA 抗凝剂和保护剂，可抑制血浆中核酸酶及 有核细胞中DNA 的释放。采血时皮肤需彻底消毒，采血至刻度，上下颠倒混匀 510 次，条码标记或编号。切忌在输液处或导管处采集血标本。此外，高凝状态的关节液、胸腹腔积液，甚至 CSF 也可采 用此方法。假设增加 RNA 测序应同时采 2 管。2.支气管肺泡灌洗液及痰液：严格按操作规程采集支气管肺泡灌洗液bronchoalveolar lavage fluid，BALF ，弃去前段可能污染的部分，回收 10 ml 置无菌螺帽管塑料或玻璃质地均可中，内含支气管末梢和肺泡中的分泌物。咳痰标本需在医护人员帮助下，患者用生理盐水漱口 23 次，弯腰 90°，用力咳出深部痰35 ml 置无菌螺帽 或编号。管中。假设无法自行咳痰，可通过吸痰器从气道采集。咽拭子只适用于 呼吸道病毒检测。检查容器有无渗漏，紧盖后封口膜密封，条码标记3.CSF 、房水及其他体液：经专科医生标准化采集方法获得，无菌螺 帽管封口膜密封。 CSF留取第 2 管或第 2 管后标本、关节腔积液、胆汁等检测病原微生物 DNA 或 RNA 需采集 1 ml，如同时进展 DNA及 RNA 测序应采集 2 ml。房水至少采集 200 l。骨髓单独进展 DNA或 RNA 测序， 0.5 ml 标本即可，假设同时进展DNA 及 RNA 测序则至少采集 1 ml。这些临床标本采集困难，切记防污染，避开经引流管 采集。胸腹腔积液需富集后提核酸，至少采集 10 ml 24。4.脓肿及深部组织： 1开放性脓肿需清创后采集深部伤口或溃疡基底局部泌物拭子置无菌管中。 2封闭的脓肿需对病灶局部的皮肤或黏膜外表彻底消毒，注射器抽取脓液，假设少于 3 ml，应采集最大标本 量送检。3深部组织感染需手术取材，置于无菌螺帽瓶中。多数情 况下组织中病原微生物含量低于脓液，尽可能取脓肿边缘组织。5.粪便标本：至少黄豆粒大小的颖标本，稀便35 ml ，置螺帽容器中。6.标本转运：假设标本在 24 h 内到达试验室并开头检测，可考虑冰袋低 温运输；假设运输时间在 2472 h 内，应干冰运输，并马上进展标本前 处理和核酸提取；血液标本 4 冰箱保存不得超过 7 d专用采血管，在运输过程中避开猛烈晃动；其他临床标本如需长期保存，应按如下原则执行： 1DNA 测序： -20 保存不超过 7 d。 2RNA 测序：应置-80 。3避开标本反复冻融，一般不得超过 3 次。4 理论上 -80 可长期保存。 5假设疑心高致病性或发突发传染病， 严格依据国内传染病法等相关法律要求包装及转运。尽可能在医院生 物安全防护条件下抽提核酸后再送测序。建议 1 原则上，临床疑心病原微生物感染，常规方法未得到明确病原 学证据而影响临床救治时， 可利用 mNGS 进一步确认。鼓舞临床在排 除常见病原微生物后有目的选择 mNGS 。申请单应填写临床表现、症 状体征、治疗经过、现病史、流行病学史及既往史等。测序试验室应让申请者知晓不同类型感染性疾病的标本选择、采集时机、采集方式、送检量、转运及储存条件、不同 mNGS 检测策略的适用范围。疑为传 染病应符合国家相关生物安全标本采集及转运要求。申请者可提出重 点关注的病原体，如呼吸道病毒、结核分枝杆菌、真菌及寄生虫等。 试验室应供给适宜临床使用的申请单， 内容应包括不同 mNGS 测序策略及对应的适应证。三报告解读原则目前病原微生物确实认照旧遵循 Koch 法则，即：1该微生物存在 并可从被接种的动物体内分别到此微生物。4该微生物可引起每一个个体发病 25。但是，作为一种临床检验方法，利用mNGS 确于同类疾病患者中，安康个体则无此微生物。 2该微生物必需能够 被分别、培育、纯化。3该微生物接种于易感动物可引起一样疾病， 认的感染病例并不能够完全满足传统 Koch 法则，作为该法则的补充， mNGS 具有如下特征。 1. mNGS 结果分析：理论上，凡存在于标本中的微生物均可检出，但因不同类型微生物基因组长度和测序平台等差异，导致无法针对全部微生物建立统一的阴阳性判读标准 7， 26, 27, 28 。试验室应依据 预期用途、标本类型、检测目标和技术特点，建立并验证阳性阈值及 判读标准。原则上 mNGS 的临床意义同核酸检测。另外，打算一个序 列是否来自于某种微生物，很大程度上取决于用于比较的参考微生物序列数据库，假设数据库中未包括该物种以及与其进化距离较近物种的基因组序列可能造成结果不准确。2. mNGS 结果确认：假设检出的微生物符合疾病特征则可能是引起感染的病原微生物，但不能只从序列数多少确认，需考虑序列在基因组上的掩盖度、特异性及保守性 11， 14 。该病原微生物可通过 PCR等方法得到验证， 如呼吸道标本中的流感病毒、 腺病毒及冠病毒等；粪便标本中的志贺菌、沙门菌及诺如病毒等；CSF 中的肠病毒、单纯疱疹病毒及西尼罗河病毒等；血液中的布鲁菌、巴尔通体及人类免疫缺陷病毒等。假设检出高序列数的某种未命名微生物，应高度警觉 物种的消灭。3.mNGS 阳性阈值及判读标准：报告单中的阳性阈值以百万分子序列此，少量的特异序列检出即可判为阳性 如少于 3 条特异序列26。避开报出与临床不相关的环境菌、共生菌及条件致病菌等。一般序列数确定。阳性阈值确实定不依靠某个单一的指标，包括但不限于特定 微生物的检出序列数、 归一化每百万序列reads per million ， RPM 的比值、检出物种的基因组掩盖度等。病毒因极少存活于环境中，因 数越高病原微生物的可能性越大数十条特异性序列。对于结核分 枝杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌等临床关注度高、且较难检测的病原 菌可承受独立的判读标准， 即检出 1 条特异序列即可判为阳性7， 28 。寄生虫基因组因较为简单，且与人源基因组相像，应在严格确认序列特异性之后再行判读14。假设检出序列为发物种，则可不受阈值限制，但需给出同源性比对结果。4. 微生物种群致病： 无菌部位脓肿标本可见多种病原微生物共检消灭象。如脑脓肿、颈间隙脓肿、咽旁脓肿、口腔脓肿等，所检出的微生物序列数均可能到达阳性阈值， 多数为严格厌氧菌与兼性厌氧菌共生。这种因微生物种群而致病的现象称为一个种群或一个微生物生态系统引起一种疾病，而非Koch 法则的一种病原菌引起一种疾病。尽管种群致病的理论还需进展深入探讨，但随着深度测序技术的广泛应用，这种现象在临床上将得到更多验证29。 5.不行培育或难培育微生物的结果验证：mNGS 针对标本中全部病原微生物核酸序列，不行培育或难培育微生物不能通过传统培育方法再现，且这类病原微生物同样缺乏血清学或抗原检测。除病毒、螺旋体、 立克次体、寄生虫外，这些微生物可通过核酸检测验证，测序同样是 诊断的金标准。 6. 致病菌、定植菌和污染菌：当确定条件致病菌为病原菌时应考虑患者免疫状态、根底疾病及标原来源。假设消灭大量背景菌或杂菌序列而 无主导微生物应首先考虑污染，其次考虑条件致病菌。假设外科手术 或其他有创操作后，无菌部位来源的标本，表现为细菌单一，序列数 可能不高，应结合临床考虑医院感染，此时应与背景菌区分，不行一味认为污染。mNGS 不能区分微生物是定植还是感染。mNGS 检测阴性对排解感染有意义， 但也应结合临床表现作出正确的诊断14， 28 。7. 高度传染性微生物：针对具有高度传染性的特别病原微生物，试验室应依据相关卫生行政部门的规定制定特别报告程序，标本上传疾病预防掌握中心Center for Disease Control and Prevention，CDC ，如当消灭像疑似 O1 群或 O139 群霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌、埃博拉病毒或型病原微生物等，应尽快承受其他方法验证，如PCR 、血清学等，假设支持测序结果应快速反响临床和CDC 系统。 8. 提高测序深度： mNGS 常规数据量对耐药和毒力基因检测有局限性 8， 30 ，因其得到的微生物序列数缺乏样本总序列的5%，特异性序列掩盖度不到微生物基因组 1%，在这种状况下进展耐药基因、 毒力岛基因、转录组及代谢通路分析几乎不行能。目前，有以下几种 做法可提高测序深度： 1在常规测序深度下已明确了病原微生物， 再提高测序数据量至可掩盖该物种基因组80% ，但花费巨大不适合普及。2在宏基因组根底上叠加固定的假设干种耐药基因进展靶向测序。3研发降低人源核酸比例的创方法，获得更多微生物测序数据量4， 7， 31 。建议 2 mNGS 作为一种型检测方法， 其临床意义仍未超出核酸检测范畴，它补充了传统病原微生物确认的Koch 法则。 mNGS 可检测难培育、罕见或发病原微生物，可同时给出多种病原微生物信息，因 此，在一份无菌部位来源的临床标本尤其脓肿中检出微生物种群包括不同类别或同类不同种属不应轻易视为污染。假设这些微生物的存在符合临床诊断，应赐予抗菌药物全掩盖，这恰好表达了该技术对全面生疏病原微生物的优越性。mNGS 常规数据量对耐药和毒力基因检测有局限性，如需耐药和致病信息需提高测序数据量。建议 3 假设检出的病原微生物符合临床预期，应确认序列结果的准确 盖度上。临床医生在解读条件致病菌时，应排解污染和背景微生物，考虑患者免疫状态及与临床表现的符合性。mNGS 结果不能作为临床性和特异性。为提高结果的特异性，降低错误率，即使病原微生物也 应建立阳性阈值。阳性阈值建立在微生物特异序列数及其在基因组覆决策的唯一依据，结果阴性也需结合临床排解感染。 二、mNGS 检测病原微生物的试验室要求mNGS 是 NGS 技术的一种，多数试验室承受边合成边测序方法 32。该方法使单个 DNA 分子扩增成大量一样的DNA ，然后同步复制，以此增加荧光信号强度，从而读出 DNA 序列。因此， mNGS 具有通量 高、读长短、流程简单、操作环节多、对试验环境及人员要求高的特 点。因此，对试验室设施要求高，需要严格遵守临床基因扩增检验实验室治理暂行方法的相关规定。一试验室分区及人员要求1. 根本原则：即各区独立、留意风向、因地制宜、便利工作，以到达 工作有序、互不干扰、防止污染、报告准时16。mNGS 检测分“干、湿试验”，“湿试验”指从样本处理到测序数据产生的整个测序过程，需要在标准的测序分区试验室完成。一般“测试分区试验室”分试剂预备区、标本处理与核酸提取区、文库构建区及测序区。“干试验”指测序数据的生物信息学分析。扰， DNA 和 RNA 操作核酸提取应分开。如在同一试验室应分两个区域，主要仪器耗材包括生物安全柜、核酸提取仪、移液枪、离心2. 单向工作流程：假设试验室设有缓冲间，缓冲间统一为正压或负压。 假设未设缓冲间，从试剂预备区到测序区压力依次递减。为避开相互干机、试剂及耗材等不行混用。如使用琼脂糖凝胶电泳检查核酸及文库 质量，则需有单独的电泳区。靶向测序PCR 应在单独的扩增区进展 33。 3.污染防控：应定期进展环境评估，为了监控污染需制定试剂、仪器和试验室物表定期消毒的标准作业程序 standard operation procedure ，SOP 。还应对无模板参考品或阳性比照中可能消灭的 污染物进展连续跟踪，并使用保守的阈值标准见第一章第三局部报 告解读原则 3，最大程度削减假阳性结果产生9。4.试验室人员力量：试验室人员应参与相关培训，并获得国家要求的 相应资质 27， 34 。检验人员应具备 mNGS 工程制定和质量掌握 力量。报告签发人员应具备临床医学、微生物学和分子生物学背景，把握相关临床诊疗指南。疑难报告的签发及结果解释需询问相关领域专家。开展mNGS 试验室自建检测工程laboratory-developedtests ，LDT 的试验室同时还应具备生物信息学分析的专业人员，生物信息学分析人员需娴熟把握mNGS 检测原理及生物信息软件， 具备数据信息维护和治理、开发算法及更数据库的力量。建议 4 微生物检测非靶向mNGS 试验室至少应包括试剂预备区、样本制备区、文库制备区及测序区。试验室工作流程应为单向。假设试验室设有缓冲间，缓冲间统一为正压或负压。假设未设缓冲间，压力从试 剂预备区到测序区依次递减。 DNA 和 RNA 核酸提取分区域进展。假设 开展靶向扩增 NGS 测序，应额外增加扩增区及电泳区。假设同时开展 遗传及肿瘤 NGS ，核酸提取及建库过程不宜与之混用。报告签发人员应具备临床医学、病原微生物或分子生物学背景，罕见病原微生物结果解释可询问相关领域专家。假设配备有生物信息学分析人员，需把握 mNGS 微生物检测软件应用，具备数据信息维护和治理、开发算法 及更数据库的力量。 二检测平台1.建立标本前处理及核酸提取方法：标本预处理方法和核酸提取技术 在使用前需经过验证。2.测序平台的选择：包括仪器设备的选择、测序平台质量的评价及主流测序平台类型 3 个方面。配备开展高通量测序检测工程所需的全部仪器设备：优先选择国家药品监视治理局 NationalMedicalProductsAdministration ，NMPA 批准的测序平台和配套试剂。测序平台应到达临床预期： 除开展满足临床需求的工程外， 测序通量、序列的准确率、支持读长、仪器性能验证、内部质控、测序周期及批量检测力量等也是评价测序平台质量的重要指标。主流测序平台：目前，mNGS 主流测序方法有边合成边测序、DNA纳米球测序及半导体测序3， 32 。试验室依据需要选择适宜的检测平台，使用模拟样本或临床微生物样本验证测序全流程。表2列出了不同类型测序平台的技术特点及环境要求。3.自动化测序平台： mNGS 微生物检测的灵敏度与标本背景有关，如组织标本中含有大量人源基因组，导致微生物序列数占比削减，通过高效自动化测序平台，增加测序深度可提高检测灵敏度。自动化过程降低人工操作、减低外源污染，试验室分区简化。已有文献报道实现生物信息分析和报揭露送。了血液、CSF 、尿液等标本，从文库构建到报揭露放全自动化过程 26。自动化平台应包括标本前处理、核酸提取、文库构建、高通量测序、三生物信息平台 序列比对过滤、微生物物种检测等过程35, 36, 37 。目前尚无统一的标准化数据分析程序及软件3。数据分析流程由多种分析软件生物信息学分析也称“干试验”是mNGS 检测中的重要局部，是对 测序产生的原始数据进展处理和分析，包括但不限于数据质控、人源配套完成，包括数据质控软件如 Fastp 、Trimmomatic 、FastQC 等、比对软件如 Bowtie2 、BWA 、MAQ 、SOAP2 、Blast 等、物 种 分 析 软 件 如 SURPI 、 Taxonomer 、 MegaBLAST 等 26， 38, 39 。人源基因组和微生物基因组检测数据库有美国国家生物技术信息中心、美国病原体系统资源整合中心40、真核生物病原体数据库 41及病毒病原数据分析资源库 42等，在构建物 种比对数据库时可予以选择，还有耐药基因分析可考虑抗性基因数据 库43, 44, 45 ，毒力基因分析可使用毒力基因分析数据库 46, 47 等。随着 mNGS 产品的体外诊断化进展， 结合人工智能技术的自动化的数据分析系统已经能够供给应临床试验室。建议 5 试验室构建 mNGS 技术平台以拟开展的检测工程及科研工作 库、高通量测序、核酸扩增、产物分析、数据分析等全流程。承受模拟样本或临床病原体样本对全部技术环节进展验证，包括检测为依据，充分论证不同检测平台的适用性，包括生物信息平台。技术 平台的建设应包含标本处理、核酸提取、文库构建 DNA 和 RNA 文灵敏性、测序通量、序列质量、读取准确率、支持读长、仪器性能验 证、内部质控、测序周期及生物学信息分析力量。比对数据库应满足 各类微生物检测需求。 三、mNGS 微生物检测方法的建立一标本前处理 染。依据申请要求提前预备被检测微生物所需的文库资料及生物信息分析软件。建立临床标本的前处理程序，包括简单标本、微量标本和标本液化、浓缩及去除宿主核酸等前处理方法和设备使用应标准化。 全部标本应具有唯一标识，防止在信息录入和标本分拣过程中穿插污组织标本的前处理程序， 针对真菌和 /或分枝杆菌等特别微生物的破壁 处理程序。建立 RNA 病毒、微生物游离核酸测序的前处理方法。建 立组织标本研磨方法，具体方法见表 3。二核酸提取1.使用经性能确认的核酸提取试剂：临床标本中存在不同类型的病原 微生物，核酸提取方法的可重复性和提取效率对保证核酸的完整性及 纯度至关重要。试验室应依据临床标本类型和微生物种类建立针对性的标准化提取程序。建议使用经性能验证的商品化提取试剂及设备。Bioanalyzer 检测，假设大局部片段在200 nt血浆游离 DNA 除外，140nt 以下说明DNA降解严峻， 需重提。 3 高质量的RNA A260/A280 应在 1.82.0 ，A260/A230 应>2。4微量的核2.核酸质量验证： 1高质量的 DNA A260/A280 应在 1.71.9 ， A260/A230 应>2，可用 1%琼脂糖凝胶电泳验证 DNA 质量无杂带、无拖尾、背景无蛋白污染。 2DNA 完整性如 Agilent 2100 酸承受 Qubit 荧光染料法进展定量测定 15。3.核酸含量极低样本的处理： 如 CSF 、房水等，应在标本中加 50 l ATL DX研磨珠，低频震荡10 min ，离心后取 150 l。参加 150 l裂解液和 8 l 蛋白酶 K，涡旋震荡混匀 30 s，56 恒温震荡 15 min假设无恒温震荡仪，可用金属浴代替，期间每3 min 混匀 1 次；取裂解后的样本 300 l，参加磁珠 240 l，震荡混匀，室温静置 5 min ， 上清提核酸。依据商品化的操作说明进展。4.去除人源 DNA 的方法：多数临床标本存在大量宿主细胞和宿主游离核酸，微生物核酸丰度相对较低。因此，在核酸提取环节中可考虑建立高效去宿主 DNA 方法，提高 mNGS 微生物检测的灵敏度4，48 ， 去除人源核酸的方法选择需要结合临床检测目的，举例如下。去污剂处理：因人源细胞的细胞膜较微生物外壁脆弱，在核酸提取前用温顺去污剂如皂苷裂解宿主细胞释放DNA ，再用脱氧核糖核酸酶降解人源 DNA ，通常可使微生物富集效率提高1 000 倍49。低渗溶液破坏宿主细胞：使用细胞膜不透性的叠氮碘化丙锭结合暴露在溶液中的宿主 DNA 48。抗甲基化 DNA 磁珠：因人源 DNA 甲基化程度高， 大多数微生物基因 组中缺乏甲基化 DNA ，使用抗甲基化 DNA 磁珠可有效去除人源 DNA ，可实现 35 倍富集 26。使用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术 剥离目标序列： 此法对构建 RNA文库较为有利，可提高非编码 rRNA 序列含量，但对 DNA 文库构建 意义不大，不推举花费更大财力去除全部人源 DNA 。5.qPCR 预估人源核酸的去除效率：去除宿主DNA 后，对宿主及微生物常用的标志基因，如肌动蛋白基因、甘油醛-3- 磷酸脱氢酶基因和16S rRNA 基因等，进展实时荧光定量 PCRquantitative real-time PCR ，qPCR 定量检测，通过阅历积存或许预估宿主剩余比例及有效 数据比例，必要时可提高测序数据量。 三文库制备文库制备是将基因组 DNA 片段化并在片段末端连接寡核苷酸接头的 过程，文库质量直接影响测序数据质量。目前常用的建库方法有超声 波打断建库、酶切建库及转座酶建库等，选用操作简洁的方法对降低污染有利。1.明确核酸质量及文库产出标准：试验室依据文库制备方法及测序平台明确起始核酸质量标准纯度、浓度及文库产出标准文库浓度、 片段大小等。 2.建议使用配套试剂：假设起始DNA 在 10 ng 以上，可承受一般建库试剂盒；假设 DNA 在 100 pg10 ng 之间，则承受超微量DNA 建库试剂盒；假设 DNA 量低于下限，应先行全基因组扩增，再进展建库。3.构建 RNA 文库：逆转录前需在冰上操作，防止RNA 降解。应添加RNA 酶抑制剂，必要时在建库前承受杂交捕获法或核糖体分别法去除rRNA 15。4.文库质量：可承受Qubit 荧光染料法检测文库浓度，qPCR 检测文库中有效连接接头的核酸浓度。上机前需依据不同的测序平台对文库浓度的要求进展。 高质量的文库 DNA ， 其 A260/A280通常在1.752.00 。此外，还应承受生物分析设备检测文库片段大小及峰型， 文库片段大小为插入片段和接头序列的总长度，合格文库插入片段长 度大于 100 bp ，文库应主峰明显、无杂峰、无接头、无引物二聚体15。建议 6 试验室应具备针对不同类型临床标本的前处理方法，尤其针对简单和极微量标本应具备阅历证的灵敏的手段。无论DNA 还是 RNA核酸提取质量应满足测序要求。在核酸提取的过程中应引入阅历证的降低人源核酸处理方法。推举使用配套试剂构建文库，依据初始核酸和宏基因组测序要求。文库制备方法需用临床标本或模拟样品或质控品进展验证或开展试验室间比对，合格前方可用于临床。浓度选择文库建库试剂盒，假设DNA 量低于下限应先行全基因组扩增 再进展建库，文库核酸浓度、纯度及长度应到达测序包括靶向测序四上机测序 微生物检测、耐药基因检测、微生物组学分析、宏基因组学分析等、测序数据量指每个样本测序所得的序列数或碱基数nt，二者可相 互转换，一般宏基因组测序用序列数表示。 测序数据量与预期用途 如样本中微生物与人源核酸占比、 测序灵敏度以及测序本钱等因素相关。 mNGS 微生物检测的灵敏度与标本人源核酸含量有关，不同类型临床样本人源核酸平均含量不一样，为保证结果牢靠性，在一样样本处理和核酸提取方法时，通常不同类型临床标本推举不同测序数据量，原则上背景简洁的标本如 CSF 、血浆等人源核酸含量低较低的测序 数据量即可满足病原微生物检出。在条件允许的状况下可增加测序数 据量以提高检测灵敏度。 可通过数据抽样， 即从下机数据中如 20 M随机抽取 15 M 组成一个模拟的 15 M 测序数据集模拟分析不同测序数据量、不同物种的检测限，从而最终确定不同标本类型的最正确测序数据量。通常靶向测序的数据量应3 万条序列，宏基因组测序鸟枪法测序数据量应 2 000 万 20 million ，20 M高质量序列，准确度Q30 比例 85% 。也有文献推举 CSF600 万条6 M序列26，35 、血流感染为例，每个标本平均 20 M 序列时，总体灵敏度为 31%52，每个标本平均 24 M 序列时，总体灵敏度到达48%50，当每个标血液游离 DNA 2 400 万条序列24 M50、咽拭子病毒检测 1 000万条 10M 序列 51等。测序数据量提升可显著提高灵敏度，以 本平均数据量到达33 M 序列时，总体灵敏度到达71% 53。五生物信息学分析 生物信息分析是对测序得到的原始序列进展数据分析和处理的过程，以预定程序执行。该流程由多个软件组成，包括去除人源序列、处理微生物序列及相关元数据、检测候选目标微生物，实现检测与数据的 转换。数据分析中应考虑预期用途、软硬件功能、数据存储位置、版 本号及信息备份等。同时应确保患者信息安全，设置读取规章、人员 权限、数据特别提取的警报。目前已经具有商业化的自动分析系统可以选择，试验室也可选择与国际同步的算法和软件，搭建试验室自己的分析流程，搭建过程中应选阴阳性样本或质控品进展生物信息 学分析力量模拟测试。 1.序列质量：碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，用于评估下机序列数的准确度。质量值 Q越高代表碱基被测错的概率 P越低，两者关系为Q=-10 lgP 。Q20 对应的测序错误概率为1%、准确率99% 。Q30 对应的测序错误概率为1、准确率 99.9% 。常用 Q20和 Q30 分别代表质量值 20 或 30 的碱基所占百分比。试验室应要求的高质量序列再与人源基因组比对去除，剩余序列进入后续的微生物检测分析 11， 14, 15 。保证 Q30 至少到达 85% 54。在对测序数据进展分析之前，应首 先进展质量掌握，去除读长过短如<50 bp 和低质量的序列，获得 2.判读标准：判读标准与测序数据量亲热相关，在生物信息学分析流 程搭建和优化过程中，应确定判读标准，以区分阴阳性结果。试验室应对不同类型的临床标本和不同类型微生物建立不同的判读标准。判读标准应包括但不限于检出序列数、基因组掩盖度、微生物丰度、测序深度、离散度、 RPM 比值等技术指标 7， 11 ， 14 ， 26 ， 35 。高通量测序得到的是大量短序列通常在 100 bp 以内，因此，当 序列比对到参考序列时，如同时消灭人源和某种微生物，则优先判为宿主序列。判读为某微生物属水平的序列数应大于种水平。当种水平序列数越接近属水平，则该物种的可能性越高。比对到微生物的序列 数与基因组测序掩盖度呈正相关。试验室可依据基因组掩盖度、序列 特异性等参数计算出病原微生物检测可信度 %，便于临床推断。其他判读方法：有文献通过自建参考品先设定判读标准，再承受临床标本进展判读标准确实认。也有文献通过检测肯定数量的阴阳性样本， 承受统计学方法， 如受试者工作特征曲线或准确率- 召回率precision-recall ，PR曲线来确定合理的判读标准27。 3.阳性阈值：判读为阳性的界值即为阳性阈值。阈值的设置与检出序列数、检出序列的特异性、特异序列的基因掩盖度、该物种同源性复杂程度以及检测灵敏度有关。即使病原微生物也应制定阳性阈值。针 对某些特别传染病病原微生物，在排解污染的前提