RNA的提取及基础知识.docx

DEPC 水DEPC 是一种猛烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。它通过和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。DEPC 是一种有效的核酸酶抑制剂，它能够与很多酶的-NH，-SH 或-OH 等基团发生反响，从而破坏酶的活性位点。常用浓度为 0.1%1 L 水中参与 1 mL DEPC的DEPC 来作为 RNA 酶的抑制剂。DEPC 气味芳香浓烈，强挥发性，有毒， 需在通风橱中操作 。DEPC 水：是指终浓度含 0.1%DEPC 的水，在 1000ml 双蒸水中参与 DEPC 原液 1ml, 然后摇匀DEPC 是油状的，很难和水混溶，要加转子搅两三个小时，过夜。DEPC 水可以用于RNA 沉淀的溶解，含有 RNA 的各种反响体系如反转录、siRNA 的退火等，以及其它各种要求无 RNase、DNase 和proteinase 的反响体系。DEPC 水一般是指千分之一浓度的 DEPC,在搅拌器上搅拌至完全溶解，即看不到“油珠”为止，用来处理枪头、EP 管的 DEPC 水不需高压灭活，而用于配制 DEPC 酒精等试剂和用来这种 RNA 相关试验的 DEPC 水需灭活后使用。经检测不含RNase、DNase 和proteinase。DEPC 处理水：是指用终浓度为 0.1%DEPC 处理过的的水，然后高压蒸汽灭菌 121，灭活有毒性的DEPCDEPC 分解成二氧化碳和酒精封闭冷藏备用。 最好分装小瓶来用，尽量避开污染。总 RNA 提取试验目的把握组织或细胞中RNA 的提取方法及RT-PCR 试验方法试验原理Trizol 试剂是直接从细胞或组织中提取总 RNA 的试剂。它在裂开和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性，裂解细胞并释放出 RNA,酸性条件使 RNA 与 DNA 分别,参与氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA 存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来复原。在除去水样层后，样品中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式复原。乙醇沉淀能析出中间层的 DNA， 在有机层中参与异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化 DNA 对于样品间标准化 RNA 的产量格外有用。无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量1ml Trizol，动物组织( 50mg)，植物组织(100 mg)，丝状真菌( 100mg)，动物细胞(5×1061×107)，酵母(1×107) 。TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见很多介于7 kb和15kb之间不连续的高分子量条带，mRNA和hnRNA成分两条优势核糖体RNA条带位于5 kb (28S)和2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值1.8 。试验用品【试验耗材】1、移液枪：1ml、200l、20l、10l、2l。酒精擦拭，头部重点，紫外线照耀。2、吸头：1ml、200l、20l 3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置 1ml 吸头的一个，放置 20l 吸头的一个5、EP 管：1.5ml、0.2ml、100l6、：2 个 60ml 的棕色广口。青霉素小瓶分装无水乙醇，高压的 DEPC 水，20°C 保存。7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml 9、试管架：5ml、1.5ml、20l10、盐水瓶：250ml、500ml 各 2 个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4 个12、塑料小饭盒：1 个13、大瓷缸：2 个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2 卷16、三角烧瓶：带盖，稍大融琼脂糖【试验仪器】天平、振荡器、高速离心机、0.510ul、20200ul、1001000ul 加样器。【自备试剂】DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿，异丙醇，无水乙醇，0.050.1DEPCH2O， 75乙醇，TE 缓冲液，琼脂糖。【试剂配制】RNA 抽提的预备工作1.DEPC 水： 1ml1000ml 双蒸水1 DEPC 水，1000ml 容量瓶中静置 4 小时。2.75%乙醇：无水乙醇+DEPC 水，-20保存DEPC 水需先高压3. 氯仿：棕色瓶4. 异丙醇：棕色瓶【器具处理与预备】1. 塑料制品：包括枪头、EP 管、匀浆管等先将 DEPC 水冷静量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，小枪头需打入 DEPC 水，室温过夜，高压，烤干备用，试验前将枪头等放入吸头台，再高压一次EP 管。胶塞同样处理。塑料器皿也可在 0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。2. 玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，1 DEPC 过夜，蒙锡纸，150°C 烘烤 4h，180°C，2h。或泡酸过夜，冲洗干净后高温烘烤，1 DEPC 过夜，高压。盛装乙醇，DEPC 水用。3. 匀浆器：包括剪刀、镊子先洗净后，再高压不需要泡 DEPC试验内容和方法一、抽提一组织抽提1. 组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。试验时，在液氮中将组织研磨成粉末，趁液氮未挥发将粉末转移到 EP 管，室温 5000rpm 离心去上清。每50-100mg 组织，参与 1ml Trizol。2. 假设是颖标本经匀浆后转移离心管，参与 1ml Trizol。3. 假设组织量(110 mg)或细胞数很少(102104)，在样品中参与 800 ul Trizol 反复抽吸均匀，再参与糖原(终 250ug/ml),猛烈振荡或用匀浆器匀浆。4. 在匀化后和参与氯仿之前，样品可以在6070°C保存至少一个月。二细胞抽提1. 倒掉培育基，PBS 洗，直接将 1ml Trizol 注入培育瓶5×106，反复抽吸均匀。2. 或收集细胞后参与 Trizol 反复抽吸均匀。二、分相3. 在装有裂解物的离心管中参与 0.2ml 的氯仿(为 Trizol 总体积的 1/5),振荡混均30 秒，室温下静置 5 分钟.4. 12023 rpm15 分钟 4°C,分相为三层。上层：RNA(约为 Trizol 的 60%)；中间： DNA；下层:蛋白质(酚-氯仿)。5. 留神吸取上清液，转移到另一 EP 管中。1ml 裂解物产生的上清液体积约为 0.40.6 ml。有机相和中间层含有 DNA 和蛋白质,避开触及。三、RNA 沉淀6. 上清液参与约 0.5ml 的异丙醇,振荡混均 30 秒。室温下静置 10 分钟。7. 离心 12023rpm 10 分钟 4°C。8. RNA 沉淀将在离心底的侧面形成。留神吸弃上清液,留意避开吸弃 RNA 沉淀。四、RNA 清洗9. 离心管参与 1ml 预冷的 75%乙醇(1mlTrizol 至少 1ml 乙醇清洗DNA),振荡混均30 秒，使沉淀振荡起来，室温 12023rpm×12 分钟。有文献称不超过 7500g 离心。尽可能吸弃上清液,防止 RNA 沉淀丧失。重复以上清洗步骤一次。在75%乙醇中，RNA 在 4至少保存 1 周，20至少保存 1 年。10. 室温选择流淌性小，倒置离心管于滤纸上，枯燥RNA，但不能完全枯燥(510 分钟)。用 DEPC 水 15l 溶解沉淀，55-60孵育 1015 分钟。11. 测量 OD 值后，样品放置70保存，一个月五、RNA、DNA 浓度的计算取 78l DEPC 水加 2l 第 10 步液体，则稀释倍数为 40 倍。【RNA】=A260【DNA】=A260X 40 X n/1000g/lX 50 X n/1000g/l(n 为稀释倍数)分别RNA的抱负效果是A260/A280=1.82.0A 代表 RNA OD 值；A 代表蛋白 OD 值260280留意事项1. RNA产量：每1 mg组织或1×106培育细胞预期的RNA产量(1) 肝和脾，610g (2)肾，34g(3)骨骼肌和脑组织，11.5g (4)胎盘，1-4g(5) 上皮细胞(1×106 cultured cells)，815g(6) 纤维母细胞(1×106 cultured cells)，57g2. 电泳检测: 制备甲醛变性，1琼脂糖凝胶快速电泳，25ug/lane，65V，2.5h， 检测RNA分子完整性，观看18S、28S条带。3. RNA沉淀完全枯燥，会极大地降低可溶性。局部溶解的RNA其A260/280比值<1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶解RNA，并在55 60°C下孵育10分钟，当RNA以后要用于酶切反响时，避开使用SDS。对于胰腺，肾等组织中RNase含量很高，沉淀用100%去离子甲酰胺溶解，70°C保存。4.分别RNA的抱负效果是A260/A280=1.82.0【分别胶范围】500bp1.21.510 kp0.30.7 二者之间 0.81.0【分析和定量】紫外分光光度计测定 A260 及 A280 来定量分析 RNA 的纯度及浓度。用什么稀释的 RNA，就用其调零。5. 预防 RNA 酶污染6. 在分相步骤吸取上清液过程中，和清洗步骤吸弃上清液过程中，都应在不触及其他相或沉淀的前提下吸取尽可能多的上清液。7. 台式离心机最大能到达2,600×g的离心力，假设将离心时间延长到30-60分钟可以满足操作。8. 当 TRIZOL 用量少于 2ml 时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。TRIZOL 用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受参与 TRIZOL 和氯仿后 12,000×g 的离心力。不行使用有裂缝或者破损的试管。 离心前留神平衡试管。离心前玻璃管口必需盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必需盖紧。9. 用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避开接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避开呼吸道吸入。【疑难解答】一、无 RNA 沉淀1. 匀浆不完全：匀浆不完全时，基因组 DNA 分子照旧很大，溶液粘稠。变性的蛋白质和基因组 DNA 一起形成絮状凝集物简洁包裹 RNA，使之不能有效地释放到溶液中。2.沉淀不完全：从小于 2×105 动/植物细胞、小于 2mg 动物组织、小于 4mg 植物组织或 RNA 含量低的动/植物组织中提取 RNA 时，匀浆体积太大，将造成RNA 过分稀释而不能沉淀下来。当从这样的样品中提取 RNA 时，应按比例削减抽提溶液。二、抽提率低1. 系统超负荷：假设过多增加单位体积内的样品量，将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DNA和蛋白质所占比例增大，使RNA 不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致相分别困难，降低RNA沉淀效率.2. 样品均化或裂解不完全: 匀浆不完全时，RNA分子易被蛋白质和基因组DNA复合物包裹，不能被有效释放。3. 终RNA不完全溶解:未溶解的RNA丧失。4. 样品未准时处理或细胞生长过度：样品分别后短时间内细胞内 RNA 酶被激活，细胞生长过度同样会激活细胞内 RNA 酶，假设不准时提取 RNA，大局部 RNA 会被降解。假设样品临时不作 RNA 提取，应马上用液氮冷冻完全，置-80贮存。三、A260/A280 比率 <1.651. 在分光光度计测量前用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品。低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸取值。2. 样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。3. 匀浆化后样品没有在室温下放置5分钟。4. 分别的水样层中污染有苯酚层。5. 终RNA没有完全溶解。四、RNA降解1. 从动物体取下的组织没有马上进展抽提或冰冻保存。2. 用于抽提的样品，或抽提的RNA样品保存于520°C，而不是存放于70°C。3. 细胞经胰酶消化而分散。4. 水溶液或试管污染有RNA酶。5. 用于琼脂糖凝胶电泳的福尔马林pH低于3.5。6. RNA 在水溶液中呈酸性，易自发水解，应溶于TE，20以下保存。?五、DNA污染1. 样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。2. 用于抽提的样品包含有机溶媒如乙醇，DMSO，强缓冲液或碱性溶液。六、蛋白多糖和多糖污染下述的对RNA沉淀方法改进能从抽提的RNA中移去复合污染。以匀浆化时每1 ml TRIZOL 为例，在水样层中参与0.25 ml异丙醇后再参与0.25 ml的高盐溶液(0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl) 。将终溶液混匀，离心并连续进展前述的抽提操作。改进后的沉淀法能有效地析出RNA而多糖和蛋白多糖仍以可溶的的形式留在溶液中。对于含有大量多糖的植物，要抽提其RNA将改进后的沉淀法和在最初匀浆化时多加一次离心 (RNA 抽提指南，可选方案 )合并使用是格外必要的。