PCR实验技术指南.docx

PCR 的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今日我们把相关内容整理出来，与大家(dàji)共同争论，期望对大家能有所帮助。一、引物设计(shèjì)所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件便利些，防止你一不留神看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也便利。设计软件有很多，既可以(ky)在线设计如 Primer3 :/frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_ cgi，也可以用Primer5、Oligo6.65 等等。1. 引物设计(shèjì)的原则细心地进展引物设计是 PCR 中最重要的一步。抱负的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描述(miáo shù)了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满足的特点：1） 典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。2） 选择 GC 含量为 40到 60或 GC 含量与模板 GC 含量接近的引物。3） 设计 5”端和中间区为 G 或 C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。4） 避开引物对 3”末端存在互补序列(xùliè)，这会形成引物二聚体，抑制扩增。在用软件设计时大家常常会疑心,到底? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为 0-2 时,PCR 产率可达 100%, ? G=-6 时,为 40%.5） 避开 3”末端富含 GC。设计引物时保证(bozhèng)在最终 5 个核苷中含有3 个 A 或 T。6） 避开 3”末端的错误(cuòwù)配对。3”端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延长。3最好(zuì ho)以 G 或 C 结尾，防止 AT 的松散结合引起错配。7避开存在可能(knéng)会产生内部二级构造如发夹构造的序列，这会破坏引物退火稳定性。8） 引物的一个重要参数是熔解温度Tm。这是当 50的引物和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度。两引物的 Tm 值相差不应大于 5。计算 Tm 有几种公式。第一个公式(Wallace 规章):Tm = 4g + C +2a + T, 这来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于 15-20 个碱基的引物,也适用于手工设计时的简洁计算。其次个公式(Baldino 算法)适用于计算 14-70 个核苷酸在0.4molL 的阳离子溶液中的 Tm, 也可用于扩增产物的 Tm 计算.Tm=81.5+16.6*lgK+0.41(%G+C)-(675/n)。以上两种算法都是基于碱基组成而不是碱基排列而计算的，事实上一样碱基组成的引物 Tm 可能差异不小：GGGAA 和 GAGAG 的 Tm 是不一样的，所以确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级构造和相邻碱基的特性推测引物的杂交稳定性。大局部计算机程序如 Primer5 等均使用近邻分析法。9） 当在引物 5端添加酶切位点时要考虑：a)该目的序列内部不得含有一样的酶切位点，在引物发出后才觉察错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的马虎人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。b)假设打算 PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。假设不设计保护碱基，则多半要用 TA 克隆的方式连接到质粒上，这时要留意 Taq 酶的选择，这一点在后面再聊。假设想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以参加到引物 5”端而不影响特异性。当计算引物 Tm 值时并不包括这些序列，但是应当对其进展互补性和内部二级构造的检测。 10有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比方(brú)，假设仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸全部不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，依据不同生物的碱基使用偏好，削减兼并性。次黄嘌呤可以同全部的碱基配对，降低引物的退火温度。特别要留意的是：不要在引物的 3”端使用兼并碱基，由于 3”端最终 3 个碱基的退火足以在错误位点起始 PCR。使用较高的引物浓度1µM 到 3µM，由于很多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。说了半天了,想起来还得提示大家一句:千万别搞错了引物的位置！这句话似乎(sì h)多余。看了上面的图吧,假设要扩增目的序列为“ATGTGA”的片段，则引物分别为“ATG”和“TCA”认真琢磨(zhuómó)一下，特别是 5端再接上酶切位点可别搞错了！合成错了一条可就是 50 块钱，到时候挨老板批的时候别怪我没提示你哦：设计好了引物就要让公司合成，这时候别忘了谈价格：现在竞争很厉害，价格已经挺廉价了，留意两个参数：一个是 OD 值， 假设公司说 1OD 能比 2OD 优待，那通常 1OD 足够了。其次是纯度(chúndù)，是 HPLC 的还是 OPC 的，事先要说好，建议看看这里唉，不是我给他们做广告，只是他们的说明书写得真不错： :/ takara .cn/product/cs/c_3.htm#1 引物设计方面还有很多话题可说，比方如何利用引物搭桥将两个片段通过 PCR 而不是酶连接起来、假设要设计引物表达蛋白时留意“N 端规章”。二、PCR 成分(chéng fèn)引用分子(fnz)克隆 3供给的 PCR 标准反响条件： 模板(múbn)1pg-1g引物 1mol/LDNA 聚合酶 15 单位(dnwèi)Mg2 1.5mmol/LdNTPs 200mol/L KCl 50 mmol/L1. 模板(múbn)模板可是 PCR 的关键，模板的质量是 PCR 成功的先决条件，巧妇难为无米之炊嘛！怎样得到模板，这可是一个大问题，仅仅一个提取基因组 DNA 就有很多的名堂，这会是我们后面专辑的内容，这里不多说啦，有问题来论坛争论吧。P 不出东西的时候不妨先考虑：模板有没有问题？DNA 样品中觉察有多种污染物会抑制 PCR。一些在标准基因组 DNA 制备中使用的试剂，如 SDS， 在浓度低至 0.01时就会抑制扩增反响。所需的最正确模板量取决于基因组的大小。你的目的片段在基因组中占多少？至少要保证模板中含有一个单拷贝吧！100ng 到 1µg 的人类基因组 DNA，相当于 3×104 到 3×105 个分子。所以对于单拷贝基因,这需要 0.1g 的人基因组 DNA,10ng 的酵母 DNA,1ng 的大肠杆菌 DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的 PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的 DNA 中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA 中的杂质也会影响 PCR 的效率。2. 引物引物以干粉形式运输。最好用 TE 重溶引物，使其最终浓度为 100µM。TE 比去离子水好，由于水的 pH 常常偏酸，会引起寡核苷的水解。固然，假设担忧TE 对于 PCR 的影响，不妨(bùfáng)用 ddH2O。引物的稳定性依靠于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20。以大于 10µM 浓度(nóngdù)溶于 TE 的引物在-20可以稳定(wndìng)保存 6 个月，但在室温15到 30仅能保存(bocún)不到 1 周。干粉引物可以在-20保存(bocún)至少 1 年， 在室温15到 30最多可以保存 2 个月。留意：溶解之前先离心一下， 防止一开盖就飞了。引物的浓度会影响特异性。最正确的引物浓度一般在 0.1 到 0.5µM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。通常跟着引物来的说明书会告知你，关于寡核苷酸的计算可以看看这里： :/ takara .cn/product/fl/i_1.htm3. 聚合酶的选择这可是有讲究，咱论坛里有个专题争论这个问题。主要考虑两个方面：用途对保真度的要求高不高？本钱高保真的酶总是会贵一些的。综合考虑一下找个平衡点吧，固然啦，该花钱的时候可不能省。Taq DNA 聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，由于其缺少 3”到 5”外切核酸酶校正活性。使用带有 3”到 5”外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比 Taq DNA 聚合酶低。在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述，大家不妨比较一下。提示一点：高保真酶除了我所知的 Merck 的 Easy-A 以外，都不会在 3端加 A 尾巴由于其 3-5外切酶活性，所以做 TA克隆的时候需要一点小诀窍扩增完了再加一般 Taq 去加个 A。另外还有个方法：将 Taq DNA 聚合酶同带有 3”到 5”外切核酸酶活性其次种聚合酶混合在一起可以获得比单独 Taq DNA 聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及扩增长模板。4. Mg2浓度(nóngdù)镁离子影响 PCR 的多个(du è)方面，如 DNA 聚合酶的活性，这会影响产 量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP 和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最正确的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含 200µM dNTP 的典型 PCR 起始浓度是 1.5mM留意：对实时定量(dìngliàng)PCR，使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液 (róngyè)。在多数状况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性固然，也有相反的报道。为了确定最正确浓度, 可以用 0.1-5mmol/L 的递增浓度的 Mg2+ 进展预备试验,选出最适的Mg2+浓度。在 PCR 反响混合物中, 应尽量削减有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或 EDTA 等可能影响 Mg2+ 离子浓度的物质(wùzhì),以保证最适Mg2+ 浓度。5. dNTPs高浓度(nóngdù)的 dNTPs 会对扩增反响起抑制作用。将每种 dNTP 的浓度从200µM 降低到 25-50µM 可以使扩增产物获得满足的产率。6. KCl标准浓度为 50 mmol/L, 对于较短片(dun piàn)段可将其提高到 70-100 mmol/L.三、PCR 反响(fnyìng)参数1. 变性(biànxìng)：在第一轮循环前,在 94下变性 5-10min 格外重要,它可使模板 DNA 完全解链,然后(ránhòu)参加 Taq DNA 聚合酶(hot start),这样可削减聚合酶在低温下仍有活性从而延长非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使 PCR 失败,由于未变性完全的 DNA 双链会很快复性,削减 DNA 产量.一般变性温度与时间为 94 1min。在变性温度下, 双链 DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反响体系完全到达适当的温度。对于富含 GC 的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。2. 退火：这是 PCR 的一个关键参数。在抱负状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以削减非特异性结合。合理的退火温度从 55到 70。退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5, 当产物中包含有影响试验的非可异性扩增带时,以 2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会削减引物二聚体和非特异性产物的形成。假设两个引物 Tm 不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5。或者为了提高特异性，可以在依据较高 Tm 设计的退火温度先进展 5 个循环，然后在依据较低 Tm 设计的退火温度进展剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的局部拷贝。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反响甚至可将退火与延长两步合并,只用两种温度(例如用 60和 94)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反响中所需时间主要是为使整个反响体系到达适宜的温度。3. 延长(yánshn)：延长反响通常为 72,接近(jijìn)于 Taq DNA 聚合酶的最适反响温度 75.实际上,引物延长在退火时即已开头(kish),由于 Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从 20-85.延长反响时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般(ybn)反响体系中,Taq DNA 聚合酶每分钟约可合成 1kb 长的 DNA。延长时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延长反响的时间。一般在扩增反响完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延长反响,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进展克隆或测序反响尤为重要。4. 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于 DNA 浓度。一般而言 25-30 轮循环已经足够。循环次数过多,会使 PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经 25-30 轮循环扩增后, 反响(fnyìng)中 Taq DNA 聚合酶已经缺乏, 假设此时产物量仍不够, 需要进一步扩增,可将扩增的 DNA 样品稀释103-105 倍作为模板, 重参加各种反响底物进展扩增, 这样经 60 轮循环后, 扩增水平可达 109-1010。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用以下公式表示:CCo(1+P)n 。其中：C 为扩增产物量,C0 为起始 DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。在扩增后期,由于产物积存,使原来呈指数扩增的反响变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物连续大量扩增，到达较高水平。因此，应适当调整循环次数，在平台期前完毕反响，削减非特异性产物。四、提高(tí go)PCR 扩增特异性1. 递减(dìjin)PCRTouchDown PCR递减 PCR 通过在 PCR 的前几个(j è)循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的 Tm 高大约 5的退火温度下开头(kish)，然后每个循环降低 1到 2固然，也可以(ky)每几个循环降 12，直到退火温度低于 Tm 5。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中连续扩增占据优势。递减 PCR 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如 AFLP® DNA 指纹分析。2. 热启动热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 TaqDNA 聚合酶的最正确延长温度在 72，聚合酶在室温仍旧有活性。因此，在进展 PCR 反响配制过程中，以及在热循环刚开头，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点由于遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动 PCR 尤为有效。并且，热启动在很大程度上防止引物二聚的发生。限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反响液，并将其置于预热的 PCR 仪。这种方法简洁廉价，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消退非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种根本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪到达变性温度。包括延缓参加 Taq DNA 聚合酶在内的大局部手工热启动方法格外烦琐， 尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种根本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反响成分，如模板和缓冲液，物理地隔离 开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。3. 促进(cùjìn)PCR 的添加剂退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进展高特异性的扩增，但是，某些模板，包括(bokuò)高 GC 含量的模板，需要其他的措施。影响 DNA 熔解温度的添加剂供给了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级构造会阻挡引物结合和酶的延长。PCR 添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及 PCRx Enhancer Solution 可以增加扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并关心 DNA 聚合酶延长通过二级构造区。PCRx Solution 还有其他优点。在同 PlatinumTaq DNA 聚合酶和 Platinum Pfx DNA 聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。这样，将 Platinum 技术同添加剂结合， 增加了特异性，同时削减了第三种方法-镁离子优化的依靠。为获得最正确结 果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制 Taq DNA 聚合酶的 DMSO，甲酰胺和甘油。4. 巢式 PCR使用巢式引物进展(jìnxíng)连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是 15 到 20 个循环的标准扩增。将一小局部起始扩增产物稀释 100 到 1000 倍参加到其次轮扩增中进展 15 到 20 个循环。或者(huòzh)，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进展大小选择。在其次轮扩增中使用一套巢式引物， 其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式 PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，由于同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进展总数一样的循环30 到 40会扩增非特异性靶位点。巢式 PCR 可以增加有限量靶序列如稀有 mRNA的灵敏度，并且提高了困难 PCR如 5”RACE的特异性。五、PCR 产物(chnwù)测序对于(duìyú)PCR 产物的测序有两个方式:1. DNA 直接测序: 指直接分析不经分别的 PCR 扩增产物,假设各个位点上碱基序列都是全都的,则所得信号是确定的,否则,在那些有相异碱基的位点消灭模糊信号, 假设模板在多数状况下被正确扩增,则少数的突变将被掩盖,这是结果显示的是模板的序列.但是,当扩增的前几轮即消灭错误(cuòwù)扩增并被后续的循环积存,这时就不再反映模板的状况.2. PCR 产物经克隆后测序: 这是对单克隆测序,其结果是反映单一扩增产物的序列,结果是确定的.六、PCR 污染(wrn)与对策PCR 反响的最大特点是具有较大扩增力量与极高的灵敏性，但令人头痛(tóutòng)的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生. 1、污染(wrn)缘由(一)标本间穿插污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置(fàngzhì)时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间穿插污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而集中，导致彼此间的污染.(二)PCR 试剂的污染(wrn):主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染.(三)PCR 扩增产物污染.这是 PCR 反响中最主要最常见的污染问题.由于 PCR产物拷贝量大(一般为 1013 拷贝/ml)，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限， 所以极微量的 PCR 产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性.还有一种简洁无视，最可能造成 PCR 产物污染(wrn)的形式是气溶胶污染; 在空气与液风光摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较猛烈地摇动反响管， 开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四)试验室中克隆质粒的污染:在分子生物学试验室及某些用克隆质粒做阳性比照的检验室，这个问题也比较常见.由于克隆质粒在单位容积内含量相当 高，另外在纯化过程中需用较多的用具(yòngjù)及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长生殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.2、污染(wrn)的监测一个好的试验室，要时刻留意污染的监测，考虑有无污染是什么(shén me)缘由造成的污染，以便实行措施，防止和消退污染.比照(duìzhào)试验：1） 阳性比照:在建立 PCR 反响试验室及一般的检验单位都应设有 PCR 阳性比照，它是 PCR 反响是否成功、产物条带位置及大小是否符合理论要求的一个重要的参考标志.阳性比照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性比照，其含量宜低不宜高(100 个拷贝以下). 但阳性比照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一 PCR 试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的试验中可免设阳性比照.2） 阴性比照:每次 PCR 试验务必做阴性比照.它包括标本比照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常(zhèngcháng)血清作比照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作比照.试剂比照:在 PCR 试剂中不加模板 DNA 或 RNA， 进展 PCR 扩增，以监测试剂是否污染.3） 重复性试验(shìyàn)4） 选择不同区域(qyù)的引物进展 PCR 扩增3、防止(fángzh)污染的方法(一)合理分隔试验室:将样品的处理(chl)、配制 PCR 反响液、PCR 循环扩增及 PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进展，特别留意样本处理及 PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开.最好能划分标本处理区;PCR 反响液制备区;PCR 循环扩增区;PCR 产物鉴定区. 其试验用品及吸样枪应专用.试验前应将试验室用紫外线消毒以破坏残留的 DNA 或 RNA.(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得留意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严峻的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要格外留神，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌屡次抽吸，以免穿插污染或产生气溶胶污染.(三)预混和分装 PCR 试剂:全部的 PCR 试剂都应小量分装，如有可能，PCR反响液应预先配制好，然后小量分装，-20保存.以削减重复加样次数，避免污染时机.另外，PCR 试剂，PCR 反响液应与样品及 PCR 产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱.(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.(五)设立适当的阳性比照和阴性比照，阳性比照以能消灭扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并留意穿插污染的可能性，每次反响都应有一管(y un)不加模板的试剂比照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性比照.(六)削减 PCR 循环次数，只要 PCR 产物到达检测(jin cè)水平就适可而止. (七)选择质量好的 Eppendorf 管，以避开样本外溢(wài yì)及外来核酸的进入，翻开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出.4、PCR 污染解决对策这是从另一篇文章总结而来，与前面的局部略有重复，大家任凭看看吧PCR 检测微量感染因子时，肯定要留意产物(chnwù) 残留污染的问题。一 污染(wrn)的预防进展 PCR 操作时，操作人员应当严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能消灭的PCR 污染或杜绝污染的消灭。一划分操作区：目前，一般 PCR 尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够到达单人单管，均要求试验操作在三个不同的区域内进展，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进展：1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；2. PCR 扩增区，包括反响液的配制和 PCR 扩增；3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有肯定的隔离，操作器材专用，要有肯定的方向性。如：标本(biobn)制备PCR 扩增? 产物分析? 产物处理。切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个(lin è)工作区。二分装(fn zhun)试剂：PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。全部的加样器和吸头需固定放于其 中，不能用来吸取扩增后的 DNA 和其他来源的 DNA：1. PCR 用水应为高压(goy)的双蒸水；2. 引物和 dNTP 用高压(goy)的双蒸水在无 PCR 扩增产物区配制；3. 引物和 dNTP 应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找缘由。(三) 试验操作留意事项尽管扩增序列的残留污染大局部是假阳性反响的原因，样品间的穿插污染也是缘由之一。因此，不仅要在进展扩增反响是慎重认真，在样品的收集、抽提和扩增的全部环节都应当留意：1. 戴一次性手套，假设不留神溅上反响液，马上更换手套；2. 使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避开气溶胶的污染；3. 避开反响液飞溅，翻开反响管时为避开此种状况，开盖前稍离心收集液体于管底。假设不留神溅到手套或桌面上，应马上更换手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作(cozuò)多份样品时，制备反响混合液，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以削减操作，避开污染，又可以增加反响的准确度；5. 最终参加(jirù)反响模板，参加后盖紧反响管；6. 操作时设立阴阳性比照和空白比照，即可验证 PCR 反响的牢靠性，又可以帮助(xiézhù)推断扩增系统的可信性；7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最简洁受产物气溶胶或标本 DNA 的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有(méi yu) 这种特别的加样器，至少 PCR 操作过程中加样器应当专用，不能穿插使用， 尤其是 PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；8. 重复试验，验证(yànzhèng)结果，慎下结论。二 追踪污染源假设不慎发生污染状况，应从下面几条动身，逐一分析，排解污染。一设立阴阳性比照：有利于监测反响体系各成分的污染状况。选择阳性比照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性比照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。假设以含靶序列的重组质粒为比照，100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性比照的选择亦要慎重，由于 PCR 敏感性极高，可以从其它方法Sourthern 印迹或点杂交等检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括 PCR 体系中各试剂的时机比照，即包括 PCR 反响所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中 PCR 产物残留污染是格外有益的。假设扩增结果中试剂比照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批的试剂进展扩增，扩增时设立不同的反响管，每一管含有一种被检测试 剂，在检出污染试剂后，应马上处理。二环境污染：在排解试剂污染的可能性外，更换试剂后，假设不久又觉察试剂被污染了，假设预防措施比较(bjiào)严密，则考虑可能为环境污染。环境污染中常见(chán jiàn)的污染源主要有：1. 模板提取时真空抽干(chu àn)装置；2. 凝胶电泳加样器；3. 电泳装置；4. 紫外；5. 切胶用刀或手术(shushù)刀片；6. 离心机；7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或试验台面等；此时可用擦拭试验来查找可疑污染源。1用无菌水浸泡过的灭菌(miè jn)棉签擦拭可疑污染源；2 0.1ml 去离子水浸泡；3取 5ml 做 PCR 试验；4电泳检测结果。8. 气溶胶。假设经过上述追踪试验，仍不能查找到精准污染源，则污染可能是由空气中 PCR 产物的气溶胶造成的，此时就应当更换试验场所，假设条件不允许，则重设计的引物与原引物无相关性。三污染(wrn)处理一环境污染(huánjìng wrn)1. 稀酸处理法：对可疑器具用 1mol/L 盐酸擦拭(cshì)或浸泡，使剩余 DNA脱嘌呤；2. 紫外照耀UV法：紫外波长nm一般选择(xunzé)254/300nm，照耀30min 即可。需要留意的是，选择 UV 作为消退残留 PCR 产物污染时，要考虑 PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV 照耀仅对 500bp 以上长片段有效，对短片段效果不大。UV 照耀时，PCR 产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延长终止，但并不是 DNA 链中全部嘧啶均能形成二聚体，且 UV 照耀还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于 UV 波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照耀的长 DNA 链上， 形成二聚体缺陷的数量少于 0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 链间与链内的交联和 DNA 断裂等 均可终止 Taq DNA 聚合酶的延长。这些位点的数量与二聚体位点相当。假设这些位点 0.13/碱基在 DNA 分子上随机分布，一个 500bp 片段的 DNA 分子链上将有 32 处损伤位点，那么，105 个这样的分子(fnz)中每个分子中会至少有一处损伤。相反，假设 100bp 的片段，每条链上仅有 6 处损伤，105 个拷贝分子中将有很多分子没有任何损伤。这就是 UV 照耀有肯定的片段长度限制的缘由。二反响(fnyìng)液污染可承受以下(xiàliè)方法之一处理：1. DNase I 法：PCR 混合液未加模板和 Taq 聚合酶参加(jirù)0.5U DNase I，室温反响 30min 后加热灭活，然后参加模板和 Taq 聚合酶进展正常 PCR 扩增。该方法的优点是不需要知道污染 DNA 的序列；2. 内切酶法：选择识别 4 个碱基的内切酶如 Msp I 和 Taq I 等，可同时选择几种，以抑制用一种酶只能识别特定序列(xùliè)的缺陷，室温作用 1h后加热灭活进展 PCR；3. 紫外照耀法：未加模板(múbn)和 Taq 聚合酶的 PCR 混合液进展紫外照耀，留意事项与方法同上述 UV 照耀法；4. g 射线辐射法：1.5kGy 的辐射可完全破坏 0.1ng 基因组 DNA，2.0 kGy可破坏 104 拷贝的质粒分子，4.0 kGy 仍不影响 PCR，但高于此限度会使 PCR 扩增效率下降。引物可受照耀而不影响 PCR，g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏 DNA 的。三尿嘧啶糖苷酶UNG法由于 UV 照耀的去污染作用对 500bp 以下的片段效果不好，而临床用于检测的 PCR 扩增片段通常为 300bp 左右，因此 UNG 的预防作用日益受到重视和确定。1. 原理：在 PCR 产物或引物中用 dU 代替 dT。这种 dU 化的 PCR 产物与 UNG 一起孵育，因 UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的 N-糖基键，可除去 dU 而阻挡 TaqDNA 聚合酶的延长，从而失去被再扩增的力量。UNG 对不含 dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链 DNA 中消退尿嘧啶，而对 RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。2. dUTP 法：用 dUTP 代替 dTTP，使产物中掺入大量 dU。在再次进展 PCR 扩增前，用 UNG 处理 PCR 混合液即可消退 PCR 产物的残留污染。由于 UNG 在PCR 循环中的变性一步(y bù)便可被灭活，因此不会影响含 dU 的的 PCR 产物。3. dU 引物法：合成引物时以 dU 代 dT，这样 PCR 产物中仅 5端带 dU。UNG 处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段1-2kb 以上的扩增用 dUTP 法效率较用 dTTP 低，而用 dU 法就可抑制这一缺点。dU 引物最好将dU 设计(shèjì)在 3端或近端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。4. 优点：可以去除(qù chú)任何来源的污染；UNG 处理可以和 PCR 扩增在同一个反响管内进展；由于扩增产物中有大量 dU 存在，可彻底消退污染源。5. 需留意的是掺入 dUTP 的 DNA 不应对产物(chnwù)的任何操作有影响，在进展 PCR 产物克隆时，应当转化 UNG-UNG 缺陷大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌 UNG 消化掉。四 固相捕获(bhuò)法用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1用一生物素标记的单链RNA 探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3洗脱靶分子后用特异引物扩增非 RNA 探针杂交区域。第 2步的漂洗后可用 PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。五RS-PCR 法RNA-specific PCR也称为链特异性 PCR，主要指用于 RNA 模板的特异性 PCR 法，该法可明显降低假阳性而不影响 PCR 的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的 3 端A 区有 2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列(xùliè)，5端 2 0 个核苷酸C 区为附加修饰碱基。与 mRNA 逆转录后，经超速离心使 cDNA 与多余引物分开，再用和其次引物C以第一链 cDNA 为模板合成其次链cDNA，以后的 PCR 循环中用逆转录引物的 B 区和引物 C 进展扩增加尾 cDNA，而污染的 DNA 或质粒 DNA 才不会被扩增。六抗污染引物法该对引物扩增时通过病毒 DNA 克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。假设重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使消灭了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒 DNA 才能被引物扩增，因此只要(zhyào)消灭预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。附录: 各种(è zhn)碱基符号B=CorGorTD=AorGorTH=AorCorTK=GorTM=AorC