SN0169-92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法.docx

受控文件出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法SN0169-92 代替 ZBX09002 一 88Methodforexaminationofcoliform，fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport 1、主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。本标准适用于出口食品的检验。2、设备和材料2.1 吸管：1mL，具 0.1mL 刻度；5mL 和 10mL，具 1mL 刻度。2.2 水浴箱：44.5±0.5。2.3 培育箱：36±1，44.5±0.5。2.4 冰箱：05和-15-20。2.5 均质器。2.6 乳钵和研棒。2.7 平皿：直径 90mm。2.8 天平：感量 0.1g。2.9 显微镜。2.10 稀释瓶：100mL、200mL 和 500mL 三角烧瓶及广口瓶。2.11 玻璃珠：直径约 5mm。2.12 菌落计数器。3、培育基及试剂3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤。3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。3.3EC 肉汤。3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。3.5 养分琼脂斜面。3.6 色氨酸肉汤。3.7MR-VP 培育基。3.8 Korser 氏枸椽酸盐肉汤。3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。3.10 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。3.11 生理盐水。3.12 革兰氏染色液。3.13Kovacs 氏靛基质试剂。3.14 甲基红指示剂。3.15 Voges-proskauer(V-P)试剂。4、样品制备4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用 75乙醇在开口处擦拭后取样。假设不能准时检验，应将冷冻样品置于-15保存；非冷冻而易腐的食品，应置于 4冰箱保存。检验前冷冻样品可于 2518h 内解冻，或在 45以下 15min 内解冻。4.2 不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样 25mL 放入装有 225mL 稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以 30cm 幅度、于 7s 内振摇 25 次(或以机械振荡器振摇)，制成 1： 10 的样品匀液。4.2.2 固体和半固体食品以无菌操作取 25g 样品，放入装有 225mL 稀释剂的灭菌均质杯内，于 8000r/min 均质12min，制成 1：10 样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。4.3 稀释样品匀液依据对样品污染状况的估量，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如 10-2、10-3、10-4。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过 15min。5、大肠菌群的测定5.1 大肠菌群 MPN 值的测定5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤，每管接种 1mL。5.1.2 将接种管置于 36±1培育 48±2h。5.1.3 观看试管的产气状况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在 24h 和 48h 内产气的LST 肉汤管数。如全部 LST 肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证明试验。5.2 大肠菌群的证明试验5.2.1 将全部产气管用直径为 3mm 的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。5.2.2 置 BGLB 肉汤管于 36±1培育 48±2h。5.2.3 记录全部 BGLB 肉汤管的产气管数。5.2.4 结果报告：按 BGLB 肉汤产气管数，查 MPN 表见附录 B(补充件)报告每克(毫升) 样品中大肠菌群的 MPN 值。6、粪大肠菌群测定6.1 用直径为3mm 的接种环将全部48±2h 内产气的LST 肉汤管培育物移种于EC 肉汤管中。6.2 将全部接种的 EC 肉汤管在 30min 内放入带盖 44.5±0.5水浴箱内，培育 24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培育基液面。应以为 44.5产气阳性的大肠杆菌和 44.5 不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性比照。6.3 记录 EC 肉汤管的产气状况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。6.4 结果报告：按产气管数，查MPN 表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的 MPN 值。靛基质MRVP枸椽酸盐鉴定(型别)典型大肠杆菌非典型大肠杆菌典型中间型非典型中间型典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌7、大肠杆菌测定7.1 将6.3 条中的EC 肉汤管连续培育24h，取其产气管的培育物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36±1培育 24±2h。7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2 个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取 2 个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到养分琼脂斜面上，36±1培育 1824h。7.4 将斜面培育物移种到以下培育基中进展生化试验。7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1培育 24±2h 后，加Kovacs 氏试剂 0.20.3mL，上层消灭红色为靛基质阳性反响。7.4.2 MR-VP 培育基：在 36±1培育 48±2h。以无菌操作移取培育物 1mL 至 13mm×100mm 试管中，加 5-萘酚乙醇溶液 0.6mL，40氢氧化钾溶液 0.2mL 和少许肌酸结晶，振摇试管后静置 2h，如消灭伊红色，为 VP 试验阳性。将 MR-VP 培育物的剩余局部再培育 48h 滴加 5 滴甲基红溶液。如培育物变红色，为甲基红试验阳性，假设变黄色则为阴性反响。7.4.3 Koser 氏枸椽酸盐肉汤：于 36±1培育 96h 记录有无生长。7.4.4 LST 肉汤：于 36±1培育 48±2h，观看试管中是否产气。7.4.5 革兰氏染色：取 18h 养分琼脂斜面培育物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。7.4.6大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：如消灭上表以外的生化反响类型，说明培育物可能不纯，应重划线分别，必要时做重复试验。7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC 试验为或，再依据 LST 肉汤阳性管数查 MPN 表，报告每克(毫升)样品中大肠杆菌 MPN 值。8、大肠菌群固体培育基测定法8.1 样品制备同第 4 章。8.2 计数8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿 1mL。另取 1mL 稀释剂参加一个灭菌平皿中，作空白比照。8.2.2 将冷至 45±0.5的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)1015mL 倾注于每个平皿中。留神旋转平皿，将培育基与样液充分混匀。8.2.3 待琼脂凝固后，再加 34mLVRBA 掩盖平板表层。8.2.4 翻转平板，置于 36±1培育 1824h。8.2.5 选用有 30150 个菌落的平板，计数平板上消灭的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落四周有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为 0.5mm 或更大。8.2.6 证明8.2.6.1 从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，移种于 BGLB 肉汤管内， 36±1培育 24h 和 48h，观看产气状况。8.2.6.2 将消灭产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进展革兰氏染色，以便排解革兰氏阳性杆菌。8.2.7 结果报告经最终证明为阳性(产气，革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于 8.2.5 条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。例：10-4 样品稀释液 1mL，在VRBA 平板上有 100 个典型和可疑菌落，挑取其中 10 个接种 BGLB 肉汤管，证明有 6 个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10-4/g(mL)6.0×105/g(mL)附录 A 培育基和试剂(补充件) A1 月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤胰蛋白(胨)或胰酪胨(Trypticase)20g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾2.75g磷酸二氢钾2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的 20mm×150mm 试管中，每管 10mL。121高压灭菌 15min。最终 pH6.8±0.2。A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛胆粉(oxgall 或 oxbile)溶液200.0mL 0.1煌绿水溶液13.3mL蒸馏水将蛋白胨乳糖溶于约 500mL 蒸馏水中，参加牛胆粉溶液 200mL(将 20.0g 脱水牛胆粉溶于 200mL 蒸馏水中，pH7.07.5)，用蒸馏水稀释到 975mL，调 pH7.4。再参加 0.1煌绿水溶液 13.3mL，用蒸馏水补足到 1000mL，用棉花过滤后，分装到 20mm×150mm 试管(管内有倒立的小发酵管)中，每管 10mL。121高压灭菌 15min。最终 pH7.2±0.1。A3EC 肉汤胰蛋白(胨)或胰酪(胨)20.0g3 号胆盐或混合胆盐1.5g乳糖5.0g磷酸氢二钾4.0g磷酸二氢钾1.5g氯化钠5.0g蒸馏水1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中，分装 16mm×150mm 试管(管内有倒立的小发酵管)，每管8mL。121高压灭菌 15min，最终 pH6.9±0.1。A4 伊红美蓝琼脂(EMB) 蛋白胨10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾2.0g琼脂15.0g伊红(水溶性)0.4g 或 2水溶液 20mL 美蓝0.065g 或 0.5水溶液 13mL 蒸馏水1000.0mL在 1000mL 蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶 100mL 或 200mL，高压灭菌 15min。最终 pH7.1±0.2。使用前将琼脂溶化，于每 100mL 琼脂中加 5mL 灭菌的 20乳糖水溶液、2mL 的 2伊红水溶液和 1.3mL0.5的美蓝水溶液，摇匀，冷至 4550倾注平皿。A5 养分琼脂斜面牛肉膏3.0g蛋白胨5.0g琼脂15.0g蒸馏水 1000.0mL将各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解。分装适宜的试管。121高压灭菌 15min。最终 pH7.3±0.1。灭菌后摆成斜面备用。A6 色氨酸肉汤胰胨或胰酪胨 10.0g 蒸馏水 1000.0mL加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管，每管5mL。121高压灭菌 15min。最终 pH6.9±0.2。A7MR-VP 培育基(胨)胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钾(K HPO )5.0g24蒸馏水 1000.0mL将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121高压灭菌 15min，最终 pH6.9±0.2。A8Koser 氏枸椽酸盐肉汤磷酸氢铵钠(NaNH HPO ·4H O)1.5g442磷酸氢二钾(K HPO )1.0g24硫酸镁(MgSO ·7H O)0.2g42枸椽酸钠(含 2H O)3.0g2蒸馏水 1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管 10mL，121高压灭菌 15min。最终pH6.7±0.2。A9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g胆盐或 3 号胆盐1.5g中性红0.03g结晶紫0.002g琼脂 1518g蒸馏水1000.0mL将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调至pH7.4±0.1。煮沸 2min，将培育基冷至 4550倾注平板。临用时制备，不得超过 3h。A10Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液贮存液磷酸二氢钾(KH PO )34.0g24蒸馏水 500mL将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，用 1mol/L 氢氧化钠约 175mL 调至 pH7.2。用蒸馏水加至1000mL 贮存于冰箱。稀释液取贮存液 1.25mL，用蒸馏水稀释至 1000mL，分装于适宜容器后，121高压灭菌 15min。A11 生理盐水氯化钠8.5g 蒸馏水 1000.0mL将氯化钠溶于蒸馏水中，121高压灭菌 15min。A12 革兰氏染色液结晶紫染色液： 结晶紫1.0g95乙醇 20.0mL1草酸铵水溶液 80.0mL将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液：碘1.0g 碘化钾 2.0g 蒸馏水 300.0mL将碘与碘化钾先行混合，参加蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。沙黄复染液： 沙黄 0.25g 95乙醇 10.0mL 蒸馏水 90.0mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。染色法a. 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染 1min，水洗。b. 滴加革兰氏碘液，作用 1min，水洗。c. 滴加 95乙醇脱色约 1530s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。d. 滴加复染液，复染 1min，水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。A13Kovacs 氏靛基质试剂对二甲氨基苯甲醛 5.0g戊醇 75.0mL盐酸(浓)25.0mL将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后渐渐参加浓盐酸即可。A14 甲基红指示剂甲基红 0.1g 95乙醇 300mL将甲基红溶解于 300mL 乙醇中，加水稀释至 500mL。A15Voges-Proskauer(V-P)试剂甲液-萘酚5.0g无水乙醇 100.0mL乙液阳性管数阳性管数氢氧化钾 40.0g用蒸馏水加至 100.0mL 附录 B1g 检样中最近似值(MPN)表0.10.010.0010.10.010.00100032009.10013201140026202200039203260103210150116.1211200129.22122702312213340206.2220210219.322128022122223502316223420309.4230290311323136032162324403319233531003.6300231017.233139102113026410315303951107331043111113117511215312120113193131601201132093121153211501222032221012324323290130163302401312033146013224332110013329333>1100(补充件)使用三管法，接种量分别为 0.1，0.01 和 0.001g。注：本表承受 3 个稀释度0.1g(mL)、0.01g(mL)和 0.001g(mL)，每个稀释度接种 3 管。表内所列检样量如改用 1g(mL)、0.1g(mL)和 0.01g(mL)时，表内数字应相应降低 10 倍； 如改用 0.01g(mL)、0.001g(mL)和 0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增加 10 倍，其余类推。附加说明：本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进出口商品检验局负责起草。本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。本标准主要参考美国公职分析化学家协会(AOAC)法定分析方法第 14 版第 46 章(1984 年)。中华人民共和国国家进出口商品检验局 1992-12-28 批准 1993-05-01 实施