SR-SIM超高分辨率显微镜系统操作手册.docx

4.翻开显微镜电源5.翻开载物台电源3. 翻开两个拖线板电源6. 翻开汞灯开关SR-SIM 超区分率构造照明镜显微镜系统操作手册SR-SIM 原理：构造照明是一个宽视场技术，其中，受栅格图案的衍射级的干扰， 产生通过在拍摄图像的同时叠加在样品上，栅格图案被捕获的每个图像组在步骤之间的移动或旋转。高频信息用反傅里叶算法处理之后， 可以从原始数据中提取以产生一个重建的图像，横向区分率大约提高两倍，衍射限制范围在 150 和 300 纳米之间的轴向区分率。1.将UPS后 部 电源 往 上扳2. 打 开前部绿色电源SR-SIM超高区分率显微镜开机步骤：107.翻开电脑留意：全部带三角警示标记的保育器开口都要关紧，避开激 光照耀！Zeiss SR-SIM 镜 头 配 有 10X/dry 、 63X/1.46Oil 、63X/1.57Oil、100X/1.57Oil1.选择Locate 选项卡4.观看完毕后点击Oculars offline2.选择Oculars onlineELYRA S.1 软件根本操作流程1. SR-SIM Workflow-Acqisition图像猎取1) 目镜找视野3.选择BF明场或者Fset77荧光 Fset77 为双色滤片，能同时观看 488nm，561nm1.选择需要的图像区分率2.选择需要的rotation ，一般选5次2) 图像猎取8.选择相应的伪彩9.如有多通道可通过点击加号增加通道，每个通道重复步骤 1-81.选择相应的激发波长2.通常设置激光强度为 2，并在此根底上调整3. 曝光时间为 100ms，并在此根底上调整4. EMCCD 增益(EMCCD Gain)为 40，并在此根底上调整10.温度提示为红色时，仪器不能使用。等仪器降至相应温度方可使用留意：通常 405nm 的激光需设置较高的参数！5. 点击SIM 选项卡6.在勾选所需要的激光波长之后，系统会自动选择最正确的光栅基于所选择的物镜和激发光使用者仍可以手动转变所需的光栅10. 点击 Continuous进展预览并调整参数11.点击 Snap 进展单张图片活图7. 手动选择所需的滤片系统不会自动选择6.选择需要的张数，一般为10-21 张5.点击Smallest 数值4.点击Interval3. 点击向下箭头2.将图像调整至焦平面，点击 Center7.点击StartExperiment 开头获图3) 猎取三维图像1.选择Center2. SR-SIM Workflow Processing图像处理1.点击Processing2.选择Structured Illumination, 点击右边的小三角，以开放条目. 选择 Structured Illumination3.选择需要处理的 SIM 图像4.点击Select7.点击Apply5. 点 击Automat ic6.选择SR-SIM+Wild field3. 最亮点投影4. 点击Apply1.点击 Maximum intensity projection3.点击Select2.点击需要处理的图像此时得到的图片为不同z 轴上最亮点的投影。Zeiss ELYRA S1 通道校正Channel Alignment操作流程1. Acquire：使用 200nm 荧光小球猎取SIM 图像2. Process：SIM 图像处理3. Process：Channel Alignment 通道校正4. Use：使用校正结果样品编号所匹配的物镜0000-1783-45563X/1.4 Oil，100X/1.46 Oil0000-1788-601100X/1.57 Oil样品为具有四种荧光通道、200nm 直径的标准荧光小球。有以下两个样片：留意：物镜及样片需要认真清洗！在试验前。需将样品放置在开启的系统中稳定 30 分钟至 60 分钟。需使用与物镜折射率相匹配的镜油。具体操作流程见以以下图：1.选择需要的物镜1. Acquire SIM Image 猎取SIM 图像使用 200nm 的荧光小球2.选择 5 rotation3. 建议案挨次依次设置642-561-488-4054.激光强度： 488nm，561nm：2-5%;405nm，642nm：4-10%5.Exposure time：100ms6.EMCCD Gain：30-508.点击Interval9.点击Center11.点击Smallest 数值12. z-stack 选择 slice 为 21 张7.选择Center10.点击向下箭头1.选择Processing 选卡3. 选择从前拍摄的SIM 原始图像2. 生成SIM 图像7.点击Apply2.选择Structure Illumination4. 点击Select5.选择Automatic 模式6.选择SR-SIM2. 选择Channel Alignment3. 通道校正1. 选择Processing 选卡3. 选择从前拍摄的SIM 图像6.点击Apply4. 点击Select5.选择校正模式Affine留意：在校正完成之后，请马上保存结果！4. 如何保存校正表格点击Apply 后消灭以下表格留意：消灭表格后马上保存，系统不会自动保存！如何使用校正结果2.选择要处理的图片，点击Select1.选择Processing 选项，点击 Channel Alignment3.选择Affine4.取消Fit 前面的钩取消钩之后会消灭的表格6. 确保ID的序号是相同的 软件不会自动匹配5. 点击Load, 导入从前使用200nm标准荧光小球的校正结果7.点击Apply