引物设计丁香园医学心理学内科学_医学心理学-临床医学.pdf

引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即 错 配)。？具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度(primer length)，产物长度？(product length),序列 Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定 性(internal stability,用 G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构(duplex formation and hairpin)的能值，在错配位点(false priming site，的引发效率，引物及 产物的 GC 含量(composition)，等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内 切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如 下 要 点：？1.引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致 其延伸温度大于 7 4 C,不适于 Ta q DNA 聚合酶进行反应。?2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3?端相似性较高的序列，否则容易 导致错配。引物 3?端出现 3 个以上的连续碱基，如 GGG 或 CCC，也会使错误引发机 率 增 加。?3.引物 3?端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错 配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基，因此应 当避免在引物的 3?端使用碱基 A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR 反应 失败。5?晞序列对 PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。?4.引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 G C 含 量 不 能 相 差 太 大。?再次引物不能在模板的非目的位点引发聚合反应错配即具体实现这条基本原则需要考虑到诸多因素如引物长度产物长度序列值引物与模板形成双链的内部稳定性用值反映形成引物二聚体及发夹结构的能值在错配位点的引发效率引物践中的总结引物设计应注意如下要点引物的长度一般为常用的是但不应大因为过长会导致其延伸温度大不适聚合酶进行反应引物序列在模板内应当没有相似性较高尤其是端相似性较高的序列否则容易导致错配引物端出现个以上的连导致不同的扩增效率末位碱基为的错配效率明显高其他个碱基因此应当避免在引物的端使用碱基另外引物二聚体或发夹结构也可能导致反应失败晞序列对影响不太大因此常用来引进修饰位点或标记物引物序列的含量一般为过高或过 5.引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72 C左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多 种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)，在 Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest n e i g h b o r method)。?6.G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定 性。应当选用 3?端 G 值较低(绝对值不超过 9),而 5?晞和中间 G 值相对较高的引物。引物的3?嚅的 G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。？7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过 4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并 且降低引物有效浓度而使 P C R 反应不能正常进行。？8.对引物的修饰一般是在 5?端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的 载 体 的 相 应 序 列 而 确 定。?值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的 PCR 因为 产物序列相对固定，弓 I物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去 满 足 条 件。(转 载)现在针对 PCR 引物设计的引物有好几种:Oligo 6.22 Primer 5.0等，如果你对引物没有 特殊要求也可以利用 generunner进行设计引物，近来我一直都在用其设计引物效果也是 不错的.具体方法可以参照各自使用说明书 一般是通过设计软件，例如 oligo6，primer5 等，你可以在网上搜一下引物设计软件下载 和使用说明，是比较容易的。至于设计引物的一般原则如下：*序列选取应在基因的保守区段*避免引物自身或与引物之间形成 4 个或 4 个以上连续配对，避免引物自身形成环状发 卡结构 再次引物不能在模板的非目的位点引发聚合反应错配即具体实现这条基本原则需要考虑到诸多因素如引物长度产物长度序列值引物与模板形成双链的内部稳定性用值反映形成引物二聚体及发夹结构的能值在错配位点的引发效率引物践中的总结引物设计应注意如下要点引物的长度一般为常用的是但不应大因为过长会导致其延伸温度大不适聚合酶进行反应引物序列在模板内应当没有相似性较高尤其是端相似性较高的序列否则容易导致错配引物端出现个以上的连导致不同的扩增效率末位碱基为的错配效率明显高其他个碱基因此应当避免在引物的端使用碱基另外引物二聚体或发夹结构也可能导致反应失败晞序列对影响不太大因此常用来引进修饰位点或标记物引物序列的含量一般为过高或过*典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在 于非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较 长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低*Tm 值在 55 65 C(因为 60 C核酸外切酶活性最高)，GC 含量在 40%60%*引物之间的 TM 相差避免超过 2C*引物的 3端避免使用碱基 A，引物的 3端避免出现 3 个或 3 个以上连续相同的碱基*为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。*Taqman 探针 PCR 要求片段长度在 80bp 150bp*引物末端(最后 5 个核苷酸)不能有超过 2 个的 G 和Co 怎么设计引物 来源：？张小伟的日志 1.引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种 的同一基因，通过序列分析软件(比如 DNAman)比对(Alignment)，各基因相同的序 列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在 1530 碱基之间。引物长度(primerlength)常用的是 18-27bp，但不应大于 38，因为过长会导致其 延伸温度大于 74 C，不适于 TaqDNA 聚合酶进行反应。3.引物 GC 含量在 40%60%之间，Tm 值最好接近 72 C GC 含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能 相差太大。另外，上下游引物的 Tm 值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 510 C。若按公式 Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为5580 C,其 Tm 值最好接近 72 C以使复性条件最佳。4.引物 3端要避开密码子的第 3 位 如扩增编码区域，引物 3端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生 简并，会影响扩增的特异性与效率。5.引物 3端不能选择 A,最好选择 T 再次引物不能在模板的非目的位点引发聚合反应错配即具体实现这条基本原则需要考虑到诸多因素如引物长度产物长度序列值引物与模板形成双链的内部稳定性用值反映形成引物二聚体及发夹结构的能值在错配位点的引发效率引物践中的总结引物设计应注意如下要点引物的长度一般为常用的是但不应大因为过长会导致其延伸温度大不适聚合酶进行反应引物序列在模板内应当没有相似性较高尤其是端相似性较高的序列否则容易导致错配引物端出现个以上的连导致不同的扩增效率末位碱基为的错配效率明显高其他个碱基因此应当避免在引物的端使用碱基另外引物二聚体或发夹结构也可能导致反应失败晞序列对影响不太大因此常用来引进修饰位点或标记物引物序列的含量一般为过高或过引物 3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为 A 时，即 使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降 低，G、C 错配的引发效率介于 A、T 之间，所以 3端最好选择 To 6.碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3端相似性较高的序列，否则容易 导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基 的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3端不应超过 3 个连续的 G 或 C,因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。7.引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本 身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连 续 4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免 3端的互补重叠以防止引物二聚体（Di mer 与 Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其 G 值不要过高（应小于 4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能 正常进行。8.引物 5端和中间厶 G 值应该相对较高，而 3端厶 G 值较低。G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定 性，G 值越大，则双链越稳定。应当选用 5端和中间厶 G 值相对较高，而 3端厶 G 值 较低（绝对值不超过 9）的引物。引物 3端的 G 值过高，容易在错配位点形成双链结 构并引发 DNA 聚合反应。（不同位置的厶 G 值可以用 Oligo6 软件进行分析）9.引物的 5端可以修饰，而 3端不可修饰 引物的 5端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰 而不再次引物不能在模板的非目的位点引发聚合反应错配即具体实现这条基本原则需要考虑到诸多因素如引物长度产物长度序列值引物与模板形成双链的内部稳定性用值反映形成引物二聚体及发夹结构的能值在错配位点的引发效率引物践中的总结引物设计应注意如下要点引物的长度一般为常用的是但不应大因为过长会导致其延伸温度大不适聚合酶进行反应引物序列在模板内应当没有相似性较高尤其是端相似性较高的序列否则容易导致错配引物端出现个以上的连导致不同的扩增效率末位碱基为的错配效率明显高其他个碱基因此应当避免在引物的端使用碱基另外引物二聚体或发夹结构也可能导致反应失败晞序列对影响不太大因此常用来引进修饰位点或标记物引物序列的含量一般为过高或过影响扩增的特异性。引物 5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启 动子序列等。引物的延伸是从 3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构 可能。10.扩增产物的单链不能形成二级结构 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避 开二级结构区域。用有关软件（比如 RNAstructure）可以预测估计 mRNA 的稳定二级结 构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往 往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功 是有帮助的。11.引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可 以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的 PCR,因 为产物序列相对固定，弓|物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量 去满足条件。做 RealTime 时,用于 SYBRGreenl法时的一对引物与一般 PCR 的引物,在引物设计上 所要求的参数是不同的。引物设计的要求：1）避免重复碱基，尤其是 G.2)Tm=58-60 度。3）GC=30-80%.再次引物不能在模板的非目的位点引发聚合反应错配即具体实现这条基本原则需要考虑到诸多因素如引物长度产物长度序列值引物与模板形成双链的内部稳定性用值反映形成引物二聚体及发夹结构的能值在错配位点的引发效率引物践中的总结引物设计应注意如下要点引物的长度一般为常用的是但不应大因为过长会导致其延伸温度大不适聚合酶进行反应引物序列在模板内应当没有相似性较高尤其是端相似性较高的序列否则容易导致错配引物端出现个以上的连导致不同的扩增效率末位碱基为的错配效率明显高其他个碱基因此应当避免在引物的端使用碱基另外引物二聚体或发夹结构也可能导致反应失败晞序列对影响不太大因此常用来引进修饰位点或标记物引物序列的含量一般为过高或过4）3端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C.5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。6）PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在 80-250bp 之间都可；80 150bp 最为合适（可以延长至 300bp）o 7）引物的退火温度要高，一般要在 60 度以上；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组 DNA 污染影响的能力，即引物应该 跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组 DNA 污染的 影响。至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的 做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有 从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备-寻找合适的引物非常不容易。关于 BLAST 的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在 G ENEBANK 中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物 种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能 扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。再次引物不能在模板的非目的位点引发聚合反应错配即具体实现这条基本原则需要考虑到诸多因素如引物长度产物长度序列值引物与模板形成双链的内部稳定性用值反映形成引物二聚体及发夹结构的能值在错配位点的引发效率引物践中的总结引物设计应注意如下要点引物的长度一般为常用的是但不应大因为过长会导致其延伸温度大不适聚合酶进行反应引物序列在模板内应当没有相似性较高尤其是端相似性较高的序列否则容易导致错配引物端出现个以上的连导致不同的扩增效率末位碱基为的错配效率明显高其他个碱基因此应当避免在引物的端使用碱基另外引物二聚体或发夹结构也可能导致反应失败晞序列对影响不太大因此常用来引进修饰位点或标记物引物序列的含量一般为过高或过