细胞实验方案医学心理学基础医学_医学心理学-基础医学.pdf

生科 3 班 1 组自主实验方案 外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析、实验目的 1、了解动物细胞培养、传代培养的方法以及培养过程中的无菌操作。掌握人体外 周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。2、掌握细胞染色体的制备方法，掌握人类染色体 G-带的显示方法及人类染色体 G 带在染色体识别中的意义。3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体 G 带的特征 及其识别。二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体 微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是 0.075mol/L 的 KCI）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气 干法制片，可获得较好的染色体。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经 PHA（植物血球凝集素）或 ConA 等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴 显现明暗或深浅相间的横行带纹-染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构 变化。在所有的显带技术中，G 显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本 用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用 Giemsa 染液染色，在普通显微镜下，可见深浅 相间的带纹，称 G 带（G band）。G 显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。正常人类染色体的数目为 46 条（23 对）,1960 年的 Denver 会议和 1963 年的 London 会 议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染 色体（22 对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为 122 号，性染色体用 X 和 Y 标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母 AG 表示。染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特 征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。表 1 人染色体组型及其特征 组别 染色体序号 形态，大小 着丝点位置 次缢痕 随体 鉴别程 度 A 13 最大 M;中部着丝粒（1,3）常见 1 号 无 可鉴别 B 45 次大 SM;亚中部着丝 粒 无 不易 C 612+X 中等 SM;亚中部着丝 粒 常见 9 号 无 难鉴别 D 1315 :中等 SI;近端着丝粒 偶见 13 号 有 难鉴别 E 1618 较小 16m.17m 18m;中部着丝粒 常见 16 号 无 可鉴别 F 1920 小 M;中部着丝粒 无 不易 G 2122+Y 最小 St;近端着丝粒 有 有 y 无 难鉴别 三、实验试剂与器材 试剂：培养基：RPMI1640,含有双抗（青、链霉素）和小牛血清；小牛血清；植物血球凝集素（PHA）；秋水仙素：50ug/ml;磷酸缓冲液:1/15mol/L,ph=6.8;低渗溶液:0.075mol/L 氯 化钾；Carnoy固定液：甲醇：冰乙酸（3：1）；胰蛋白酶溶液；Giemsa（姬萨姆）染液；75%勺酒精、器材：光学显微镜，离心机，恒温水浴箱，恒温箱，离心管，量简，烧杯，培养瓶，载玻片，玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，天平，普通冰箱，立式染缸、染色架、镊子，直头小吸管、橡皮吸头、吸水纸 若干，香柏油，擦镜纸，剪子，胶水。正常人类染色体 G 带核型图，核型报告纸 四、实验方法（一）培养液配制 实验室配好（二）采血与培养：抽取男生和女生外周静脉血 2ml。常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净 工作台，在火焰旁将血液滴入 2 个盛有 5ml 培养液的培养瓶内，每瓶 0.3ml，加入 100ulPHA,盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在 37C恒温箱内静置培养 72h。（每 天摇动培养瓶一次）（三）秋水仙素处理：向经恒温培养 68-72 小时（细胞生长到繁殖期即可）的外周血淋巴细胞培养液中加入 22ul 秋水仙素，使其终浓度为 0.6ug/ml,轻轻将液体摇匀，继续恒温培养 3-6小时。（四）标本的制备：1、收集细胞：终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内，离心沉淀 8 分钟（1000r/min）,弃去上清液。2、低渗处理：先加入 1ml 0.075mol/l 的 kcl 溶液，轻轻吹打，使细胞重悬。然后补加 6ml kcl 溶液，37 摄氏度低渗 20 分钟。3、预固定：低渗处理完毕后，直接加入新配的 Carnoy 固定液 1 m1 进行预固定，混匀 后，离心 8 分钟（1000r/min），去除上清液。4、固定：沿离心管壁缓慢加入固定液 6m1，轻轻吹打混匀，置室温 20 分钟，离心去除 养的方法以及培养过程中的无菌操作掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备掌握细胞染色体的制备方法掌握人类染色体带的显示方法及人类染色体带在染色体识别中的意义熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法初步掌水仙素使纺锤体微管解聚这样细胞停留在中期可以获得大量的分裂细胞用低渗盐溶液一般是的处理使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞除去最后以气干法制片可获得较好的染色体人类外周血细胞本来是终末分化细胞一般没序处理并用特定染料染色使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹染色体带这种技术称为染色体显带技术通过显带人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段并可发现染色体上较细微的结构变化在所有的显带上清液。5、重复固定一次。6、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多少加入适量固定液（0.30.6m1）,轻轻吹打成 细胞悬液。7、滴片：沉淀物中加入 0.2-0.5ml 固定液，用吸管吹打使其成为细胞悬液，用镊子取预 先冰冻的干净载玻片，迅速滴上 2-3滴细胞悬液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均 匀，干燥（五）染色：1、将载玻片反扣在染色板上，使板和片之间有一缝隙，将稀释后的 Giemsa 染液滴在片 隙中，染色 20 分钟，自来水冲洗，吹干。2、镜下观察染色体分带及染色情况。（六）染色体核型分析 1、在显微镜下找出染色体分散良好，长度适中，姐妹染色单体清楚地中期分裂相进行显拍 摄 2、将显微镜拍摄的放大照片上的一个细胞的全部染色体一条一条的剪下来 3、根据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的配对。4、测量出每条染色体的长度，计算相对长度、着丝粒指数、臂指数，记录数据。5、根据数量数据校正排列结果，调整。6、将染色体按 1-23 号的顺序一对一对的排列，断臂向上，长臂向下，性染色体单独排列，贴成完整的染色体核型图。五、实验结果 这里就是女生的效果明显，男生的不明显。原因多多分析 养的方法以及培养过程中的无菌操作掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备掌握细胞染色体的制备方法掌握人类染色体带的显示方法及人类染色体带在染色体识别中的意义熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法初步掌水仙素使纺锤体微管解聚这样细胞停留在中期可以获得大量的分裂细胞用低渗盐溶液一般是的处理使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞除去最后以气干法制片可获得较好的染色体人类外周血细胞本来是终末分化细胞一般没序处理并用特定染料染色使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹染色体带这种技术称为染色体显带技术通过显带人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段并可发现染色体上较细微的结构变化在所有的显带