实验三细菌纯种分离培养和接种技术行业资料畜牧_高等教育-大学课件.pdf

实验三细菌纯种分离、培养和接种技术 一、实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测左原理和测左意义。(2)学习和掌握用稀释平板讣数法测左水中细菌总数的方法。(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。二、实验原理 水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重 要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规泄，饮用水中大肠菌群数每 升中不超过 3个，细菌总数每 mL 不超过 100 个。它反映的是检样中活菌的数量。所谓大肠菌群，是指在 37 C24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽 胞杆菌的总称。水的大肠菌群数是指 100mL 水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌 群最近似数(MPN)表示。水源中大肠菌群的数疑，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项 重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行 大肠菌群的检查。水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检 验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适 用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。三、实验材料 1、菌落总数的测定:1)培养基：牛肉膏蛋白陈琼脂培养基，无菌生理盐水。2)器材：火菌三角瓶，火菌的具塞三角瓶，火菌平皿，火菌吸管，火菌试管等。2、大肠菌群的测左：1)培养基：乳糖胆盐蛋白陈培养基：蛋白丿冻 20g,胆盐(或牛、羊胆盐)5g,乳糖 10g,0.04%浪甲酚紫水溶液 25mL,水 lOOOmL,pH7.4o 制法：将蛋白腺、胆盐、乳糖溶于水中，校正 pH,加入指示剂，分装，每瓶 50mL 或每 管 5mL,并倒置放入一个杜氏小管，1219 灭菌 15mino 伊红美蓝琼脂培养基：制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正 pH后分装.121 C 火菌 15min 备用。平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。四、实验方法 1、水样的采集：1）自来水：先将自来水龙头用洒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流 5min.以火菌 三角瓶接取水样以备分析。2）池水、河水、湖水等地而水源水：在距岸边 5m 处，取距水而 10-15cm的深层水样，先 将火菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛 满后，将瓶塞盖好，再从水中取岀。如果不能在 2h 内检测的，需放入冰箱中保存。2、细菌总数的测左：1）水样稀释及培养：按无菌操作法，将水样作 10 倍系列稀释；根据对水样污染情况的估计，选择 2-3个适宜稀释度（饮用水如自来水、深井水等，一 般选择 k 1:10 两种浓度；水源水如河水等，比较淸洁的可选择1:10、1:100、1:1000 三种 稀释度；污染水一被选择 1:100、1:1000.1:10000 三种稀释度），吸取 ImL 稀释液于火菌平 皿内，每个稀释度作 3个重复。将熔化后保温度 45 C 的牛肉膏蛋白腺琼脂培养基倒平皿，每皿约 15mL,并趁热转动 平皿混合均匀。待琼脂凝固后,将平皿倒置于 37 C 培养箱内培养 24 lh 后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得 ImL 水样中所含的细菌菌落总数。2）计算方法：作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落 数后，求岀同稀释度的各平板平均菌落数。3）计数的报告:选取菌落数在 30-300之间的平板作为菌落总数测左标准。一个稀释度使用两个重复时,应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片 状菌落生长的平板汁数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌 落分布又很均匀，可计算半个平板后乘 2 以代表整个平板的菌落数。纽 I菌的菌落数在 100 以内时，按其实有数报告；大于 100 时，用二位有效数字，在二位有 效数字后而的数字，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的 0 的个数，可用 10 的指数 来表示。3、大肠菌群的测左（多管发酵法）：初步发酵试验:和掌握用稀释平板讣数法测左水中细菌总数的方法学习和掌握水中大肠菌群的检测方法二实验原理水的微生物学的检验特别是肠道细菌的检验在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义同时也是评价水质状况的重要指标国家饮用是指在内能发酵乳糖产酸产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称水的大肠菌群数是指水检样内含有的大肠菌群实际数以大肠菌群最近似数表示水源中大肠菌群的数疑是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标目前国用多管发酵法和滤膜法多管发酵法可运用于各种水样的检验但操作繁琐需要时间长滤膜法仅适用于自来水和深井水操作简单快速但不适用于杂质较多易于阻塞滤孔的水样三实验材料菌落总数的测定培养基牛肉膏蛋白陈琼脂培养基无在 10 支装有 10mL 的乳糖胆盐的发酵试管中（内有倒置小管），以无菌操作各加入稀释后的 水样 ImL。摇匀后，37 C 培养 24h。平板分离：经 24h 培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMB 培养基）上，37 C 培养 1824h.大肠菌群在 EMB 平板上，菌落呈紫黑色，具有或略 带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行 涂片，革兰氏染色，镜检。复发酵试验：将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可 接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落 13 个，37 C 培养 24h,如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。五、实验结果 1、自来水中细菌总数计算。2、湖水水样初发酵现象观察。和掌握用稀释平板讣数法测左水中细菌总数的方法学习和掌握水中大肠菌群的检测方法二实验原理水的微生物学的检验特别是肠道细菌的检验在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义同时也是评价水质状况的重要指标国家饮用是指在内能发酵乳糖产酸产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称水的大肠菌群数是指水检样内含有的大肠菌群实际数以大肠菌群最近似数表示水源中大肠菌群的数疑是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标目前国用多管发酵法和滤膜法多管发酵法可运用于各种水样的检验但操作繁琐需要时间长滤膜法仅适用于自来水和深井水操作简单快速但不适用于杂质较多易于阻塞滤孔的水样三实验材料菌落总数的测定培养基牛肉膏蛋白陈琼脂培养基无