根系活力的测定行业资料园艺_行业资料-园艺.pdf

根系活力的测定（TTC法）植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水本。本实验练习测定根系活力的方法，为植物营养研究提供依据。一、原理 氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为 80mV 的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以 TTC 被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的 TTC 还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以 TTC 还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、材料、设备仪器及试剂 （一）材料：水培或砂培小麦、玉米等植物根系。（二）仪器设备：1.分光光度计；2.分析天平（感量）；3.电子顶载天平（感量 0.1g）；4.温箱；5.研钵；6.三角瓶 50ml；7.漏斗；8.量筒 100ml；9.吸量管 10ml；10.刻度试管 10ml；11.试管架；12.容量瓶 10ml；13.药勺；14.石英砂适量；15.烧杯 10ml、1000ml。（三）试剂：1.乙酸乙酯（分析纯）。2.次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。TTC 溶液 准确称取 TTC1.0g，溶于少量水中。定容到 100ml。用时稀释至各需要的浓度。4.磷酸缓冲液（115mol/L，pH7）。5.1mol/L 硫酸 用量筒取比重的浓硫酸 55ml，边搅拌边加入盛有 500ml 蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至 1000ml。6.0.4mol/L 琥珀酸 称取琥珀酸 4.72g，溶于水中，定容至 100ml 即成。三、实验步骤 （1）TTC 标准曲线的制作 取TTC 溶液放入 10ml 量瓶中，加少许 Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液、置 10ml 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25g、50g、100g、150g、200g的标准比色系列，以空白作参比，在 485nm 波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品 0.5g，放入 10ml 烧杯中，加入TTC 溶液和磷酸缓冲液的等量混合液 10ml，把根充分浸没在溶液内，在 37下暗保温 13h，此后加入 1mol/L 硫酸 2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯 34ml 和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为 10ml，用分光光度计在波长 485nm 下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、结果计算 四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）四氮唑还原量（mg）/根重（g）时间(h)植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定（实验测试用）原理：过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在 470nm 处有最大吸收峰，可根据单位时间内 A470的变化值，计算 POD 活性大小。仪器：电子天平；冰冻高速离心机；可见光分光光度计；电动玻璃匀浆剂等。试剂：20mM KH2PO4；100mM PBS：取 0.2M Na2HPO4，与，混合。反应液：取 100mM PBS 50ml，加入愈创木酚 28l，搅拌溶解，待溶液冷却后加入 30%的 H2O219l，混合均匀保存于冰箱中备用。方法：1.酶液制备：取 1.0g 植物叶片剪碎，置入玻璃匀浆杯中，加入预冷的 20mM KH2PO45ml 进行冰浴研磨提取。匀浆液低温离心 8500rpm 15min，上清液为酶粗提液，定容到 50ml 供测定。2.酶活性测定：取光程为 1cm 的玻璃比色杯 2 只，一只加入反应液 3ml，20mM KH2PO41ml 作为调零管。另一只加入反应液 3ml，提取的酶液 1ml，立即开始计时，在 470nm 波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟记录一次吸光度值，共测 3min。3.计算：以每分钟 A470的化变值为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小（单位：U/g 鲜重）。状况及产量水本本实验练习测定根系活力的方法为植物营养研究提供依据一原理氯化三苯基四氮唑是标准氧化电位为的氧化还原色素溶于水中成为无色溶液但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙生成的三苯甲腙比较稳定不会被苹果酸得到增强而被二酸碘乙酸所抑制所以还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标二材料设备仪器及试剂一材料水培或砂培小麦玉米等植物根系二仪器设备分光光度计分析天平感量电子顶载天平感量温箱研钵三角瓶漏斗量于少量水中定容到用时稀释至各需要的浓度磷酸缓冲液硫酸用量筒取比重的浓硫酸边搅拌边加入盛有蒸馏水的烧杯中冷却后稀释至琥珀酸称取琥珀酸溶于水中定容至即成三实验植物组织内过氧化物酶活性的测定实验测试用原理过氧过氧化氢酶测定 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。一、原理：过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据 H2O2的消耗量或 O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的 H2O2的量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片 （二）仪器设备：1.研钵；2.三角瓶；3.酸式滴定管；4.恒温水浴；5.容量瓶。（三）试剂：1.10%H2SO4；2.0.2 mol/L 磷酸缓冲液；3.L 高锰酸钾标准液称：取 KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000ml，再用 L 草酸溶液标定；4.L H2O2市售 30%H2O2大约等于 L，取 30%H2O2溶液，稀释至1000ml，用标准 L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.L 草酸：称取优级纯2C 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至 1000ml。四、实验步骤 （一）酶液提取：取小麦叶片 2.5g 加入的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至 25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心 15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。（二）取 50ml 三角瓶 4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液，对照加煮死酶液，再加入 L H2O2，同时计时，于 30恒温水浴中保温 10min，立即加入 10%。用 L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在 30min 内不消失）为终点。五、结果 酶活性用每 g 鲜重样品 1min 内分解 H2O2的 mg 数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）（AB）VT/(W VS t)式中：A 对照 KMnO4滴定 ml 数；B 酶反应后 KMnO4滴定 ml 数；VT 提取酶液总量（ml）；VS 反应时所用酶液量（ml）；W 样品鲜重（g）；t反应时间（min）；KMnO4相当于。超氧物歧化酶（SOD）活力 状况及产量水本本实验练习测定根系活力的方法为植物营养研究提供依据一原理氯化三苯基四氮唑是标准氧化电位为的氧化还原色素溶于水中成为无色溶液但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙生成的三苯甲腙比较稳定不会被苹果酸得到增强而被二酸碘乙酸所抑制所以还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标二材料设备仪器及试剂一材料水培或砂培小麦玉米等植物根系二仪器设备分光光度计分析天平感量电子顶载天平感量温箱研钵三角瓶漏斗量于少量水中定容到用时稀释至各需要的浓度磷酸缓冲液硫酸用量筒取比重的浓硫酸边搅拌边加入盛有蒸馏水的烧杯中冷却后稀释至琥珀酸称取琥珀酸溶于水中定容至即成三实验植物组织内过氧化物酶活性的测定实验测试用原理过氧 一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在 560nm 处有最大吸收。而 SOD 可清除 O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料；水稻或小麦叶片 （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为 4000Lx）；5.试管或指形管数支。（三）试剂 1.0.05mol/L 磷酸缓冲液（）；2.130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称用磷酸缓冲液定容至 100ml；mol/L 氮蓝四唑溶液：称取用磷酸缓冲液定容至 100ml，避光保存；4.100mol/L EDTANa2溶液：称取Na2用磷酸缓冲液定容至 1000ml；5.20mol/L 核黄素溶液：称取 0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000ml 避光保存。三、实验步骤 1.酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为 5ml。取2ml 于 1000rpm 下离心 20min，上清液即为 SOD 粗提液。2.显色反应 取 5ml 指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另 2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）L 磷酸缓冲液 L Met 溶液 L 750mol/L NBT溶液 mol/L 100mol/L EDTA Na2液 mol/L 20mol/L 核黄素 mol/L 酶液支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水总体积混匀后将 1 支对照管置暗处，其它各管于4000Lx 日光下反应 20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3.SOD 活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算 已知 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50为一个酶活性单位表示，按下式计算 SOD 活性。SOD 总活性(AckAE)V/(Ack W Vt)上式中，SOD 比活力SOD 总活性蛋白质含量式中 SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位mg蛋白表示 Ack 照光对照管的吸光度 AE 样品管的吸光度 V 样品液总体积（ml）Vt 测定时样品用量（ml）W 样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg 蛋白g 鲜重。状况及产量水本本实验练习测定根系活力的方法为植物营养研究提供依据一原理氯化三苯基四氮唑是标准氧化电位为的氧化还原色素溶于水中成为无色溶液但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙生成的三苯甲腙比较稳定不会被苹果酸得到增强而被二酸碘乙酸所抑制所以还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标二材料设备仪器及试剂一材料水培或砂培小麦玉米等植物根系二仪器设备分光光度计分析天平感量电子顶载天平感量温箱研钵三角瓶漏斗量于少量水中定容到用时稀释至各需要的浓度磷酸缓冲液硫酸用量筒取比重的浓硫酸边搅拌边加入盛有蒸馏水的烧杯中冷却后稀释至琥珀酸称取琥珀酸溶于水中定容至即成三实验植物组织内过氧化物酶活性的测定实验测试用原理过氧