中药化学试验讲义.pdf

中药化学实验主 编 郭 丽 冰 陶 曙 红广东药学院中药学院中药化学与分析教研室二零零六年六月目 录目 录.I第一章中药化学实验须知.1实验要求.1.实 验 室 规 则.1三实验室安全注意事项./四.实验报告格式.2第二章中药化学实验技术.4第一节经典的提取和分离方法.4（）溶剂法.4（-）水蒸气蒸镭法.5（三）分储法.5（四）吸附法.5（五）沉淀法.5（A）盐析法.6（七）透析法.6（A）升华法.6第二节结晶和重结晶.6（一）结晶的条件.7Q结晶溶剂的选择.7制备结晶的方法.7（四）不易结晶或非晶体化合物的处理.8（）结晶纯度的判断.8第三节层析分离方法.9（一）硅胶柱层析.9（二）氧化铝层析.10（=）聚酰胺层析.11（四）活性炭层析.12（S）大孔吸附树脂层析.15第三章 实 验.1 7实验一延胡索生物碱的系统分离法.17EXPERIMENT 2 EXTRACTION,SEPARATION AND IDENTIFICATION OFANTHRAQUINONES FROM RHUBARB.21实验二大黄中葱醐类成分的提取、分离和鉴别.3 0实验三灰毛寄生叶中棚皮背和广寄生昔的提取、分离及鉴定.36EXPERIMENT 4 THE IDENTIFICATION OF RUTIN.40实验四 芸香甘的提取、分离和鉴定.46实验五桅子中京尼平甘的提取和分离纯化.52实验六 穿心莲内酯的提取、分离、鉴定.55与亚硫酸氢钠加成物的制备.55实验七 齐墩果酸的提取、分离及鉴定.62实验八茶叶中咖啡因的提取、分离及鉴定.65附录.67附录一 常用有机溶剂的物理常数和精制方法.67附 录 二 常用鉴定试剂的配制和应用.73附 录 三 中药化学成分的鉴定法.83附录四常用酸碱的密度与浓度.90附录五常用缓冲液的配制.912第一章中药化学实验须知一.实验要求1.实验前应认真预习，做好预习笔记，明确实验目的，掌握实验原理，了解实验步骤，安排好当天实验计划。2.实验时要遵守实验室制度，按照操作要求，认真操作，正确使用各种仪器，努力掌握基本操作技术。养成及时记录的习惯，观察到的现象和结果以及有关的重量、体积、温度或其它数据，应立即如实记录。3.实验室内保持安静、整洁。不许大声喧嚷，不许吸烟，不迟到、不随便离开。随时注意反应情况和做好下一步的准备工作。保持桌面、仪器、水槽、地面四洁。废弃的固体和滤纸等丢入废物缸内，绝不能丢入水槽或丢到窗外。4.实验后要认真分析实验现象，作出合理结论，写出实验报告，提取纯化产品包好，贴上标签，交给老师。必要时还需进一步查阅某些尚未理解的理论和知识。5.每次实验完毕，值日生负责整理公用仪器，将实验台、地面打扫干净，倒清废物缸，检查水电开关，关好门窗。二.实验室规则1.在实验室中要穿白大衣，实验中不准做与实验无关的事。2.必须遵守实验室的各项制度，听从教师指导，尊重实验室工作人员的职权。3.实验前应清点并检查仪器是否完整，装置是否正确，合格后才能开始实验。4.使用仪器时要轻拿、轻放，贵重仪器未经教师允许不得擅自动用。旦损坏仪器应及时报损、补领，不得乱拿，乱用别人的仪器。5.公用仪器和药品，用完后立即归还原处，不可调错瓶塞，以免污染。仪器使用完毕应清理干净。节约用水、用电，节约试剂，严格药品用量。三.实验室安全注意事项1.实验前应检查仪器是否完整无损，装置是否正确。回流、蒸储时，冷凝水是否通畅，干燥管是否阻塞，在常压下进行蒸储或回流，仪器装置必须与大气相通，不能密闭。2.回流或蒸你易燃溶剂（特别是低沸点易燃溶剂），不能使用明火加热，要根据溶剂的沸点选用水浴、油浴或电热套。液内要放几颗沸石，防止过热冲瓶或暴沸。若在加热后发现未放入沸石，则应待冷后放入，加热过程中也不得加入活性炭脱色，否则会发生暴沸。3.蒸饵、回流易燃、易挥发、有毒液体时，仪器装置切勿漏气，冷凝管流出液应用弯接管导至接收瓶中，余气应用橡皮管通往室外或水槽里。4.减压系统应装有安全瓶。加压柱色谱时，层析柱及储液瓶机械性能要高，连接要牢，注意控制压力，以防炸裂。5.使用易燃溶剂时，应在远离火源和通风的地方进行，启封易挥发溶剂瓶盖时，脸要避开瓶口，并慢慢启开，以防气体冲到脸上。6.有毒、有腐蚀性的药品应妥善保管，操作后立即洗手，勿沾及五官及伤口。7.使用电器设备及各种分析仪器时一，要事先了解电路及操作规程。使用时，注意仪器和电线不要放在潮湿处，手湿不要接触电源。8.欲将玻璃管插入塞中，可在塞孔涂些水或甘油等润滑剂，用布包住玻璃管使其旋转而入，防止折断。实验室一旦发生火灾事故，应保持镇静，并采取各种相应措施。首先，要立即断绝火源，切断电源并移开附近的易燃物质。三角瓶内溶剂着火可用石棉网或湿布盖熄。小火可用湿布或黄沙盖熄，火较大时应根据具体情况采用相应的灭火器材。四.实验报告格式中药化学实验报告的格式不是固定不变的，可以按题目的内容及要求作适当的调整。除应标明专业、班级、实验组、姓名和实验时间外，一般还包括下列内容：1.题目2.目的要求3.基本原理主要的提取分离及鉴定原理。4.操作以流程图表示，简明扼要，包括现象纪录。5.鉴定包括化学反应的试剂、现象及结论，色谱鉴定条件，结果及结论。6.产品产品颜色、晶形、重量、熔点及得率。7.讨论包括实验过程中主要注意事项、关键步骤、实验成败的原因及心得体会。8.思考题可以根据老师的要求，回答各实验中的某些思考题。实验报告要求字迹端正，图表清楚，叙述有条理；尽量做到既有观察的实验现象，又有说明和解释；既有实验数据又有2分析和讨论：既有成败的经验教训又有自己的实践体会，甚至有改进的建议。3第二章中药化学实验技术第一节经典的提取和分离方法（一）溶剂法1.基本概念有机化合物分子中，有的亲水性基团多，极性大而疏于油；有的亲水性基团少，极性小而疏于水，这种亲水性和亲脂性的程度大小与化合物的分子结构直接相关。一般来说，两种基本母核相同的成分，其分子中官能团的极性越大或极性官能团数量越多，则整个分子的极性就越大，表现亲水性强，而亲脂性就越弱；其分子非极性部分越大或碳链越长，则极性小，亲脂性强，而亲水性就越弱。各类溶剂的性质，同样与其分子结构有关。常用的甲醇、乙醇是亲水性比较强的溶剂，它们的分子比较小，并存在羟基与水分子的结构近似，可和水任意混合。丁醇和戊醇分子中虽亦都有羟基，但分子中的碳键逐渐加多，与水性质也就逐渐疏远，所以它们彼此仅能部分互溶，在它们互溶达到饱和状态后，两者都能与水分层。氯仿、苯和石油懒是煌类或氯煌衍生物，属于亲脂性强的溶剂。常见溶剂的极性度强弱顺序可表示如下：石 油 酸（低沸点一一高沸点）二硫 化 碳 四氯化碳 三氯 乙 烷 苯 二氯 甲 烷 氯 仿 乙 醛 乙 酸 乙 酯 丙 酮 乙 醇 甲 醇 乙睛 水 毗 咤 乙酸。通常按极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶齐！J，同类分子或官能团相似的彼此互溶的一般规律来选择，溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。一般对溶剂的要求是：（1）溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小，或反之。（2）溶剂不能与中药成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。（3）溶剂要经济易得，并具有一定的安全性。（4）沸点宜适中，便于回收反复使用。2.提取方法用溶剂提取中药成分时，常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。同时，原料的粉碎度、提取时间、温度以及设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑，所用容器一般为玻璃或搪瓷器皿。4（-）水蒸气蒸储法此法适用于能随水蒸气蒸储而不被破坏的中药成分的提取。这些化合物与水不相混溶或仅微溶，且 在 约1 0 0 时有一定的蒸汽压。当水蒸气加热沸腾时一，能将该物质一并随水蒸气带出。如中药中的挥发油，某些小分子生物碱，如麻黄碱、槟榔碱等，以及某些小分子的酸性物质，如丹皮酚等均可应用本法提取。对一些在水中溶解度较大的挥发性成分可采用蒸储液重新蒸储的办法，收集最先储出部分，使挥发油分层，或用盐析法将蒸微液中挥发性成分用低沸点非极性溶剂如石油蹄、乙蹄抽提出来。（三）分储法利用沸点不同进行分储，然后精制纯化，在分离毒芹总碱中的毒芹碱和羟基毒芹碱以及石榴皮中的伪石榴皮碱、异石榴皮碱和甲基异石榴皮碱时均可利用它们的沸点不同进行常压或减压分t需然后再精制纯化。（四）吸附法吸附法的目的，一种是吸附除去杂质，这常指糅质、色素；另一种是吸附所需物质。常用的吸附剂有氧化铝、氧化镁、酸性白土和活性炭等。如京尼平昔的分离，取桅子粉，用乙醇提取，提取物的水溶液加氧化镁吸附，然后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液浓缩得黄色固体粉末，再 经 乙 酸 乙 酯/丙 酮（1:1）重结晶即得到京尼平昔的纯品。（五）沉淀法利用某些中药成分与某些试剂产生沉淀的性质而得到分离或除去“杂质”的方法。但对所需成分来讲，这种沉淀反应是可逆性的。最常用的是铅盐法，利用中性乙酸铅或碱式乙酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶性的铅盐沉淀，故可利用这种性质使所需成分与杂质分离，脱铅方法常通以硫化氢气体，使其分解并转为不溶性硫化铅沉淀而除去。但溶液中可能有多余的硫化氢存在，可通入空气或二氧化碳让气泡带出多余的硫化氢气体。若对热稳定的化合物，可将溶液置于蒸发皿内，水浴上加热，浓缩除去。脱铅的方法也可用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等，但生成的硫酸铅及磷酸铅在水中有一定的溶解度，所以脱铅不彻底。但由于方法比较简便，故实验室中仍常5采用。此外，还有乙酸钾、氢氧化钢、磷铝酸、矽铝酸等沉淀剂。对多糖、蛋白质等常用丙酮、乙醇或乙醛沉淀。（六）盐析法盐析法通常是向中药水提取液中加入易溶性无机盐至一定浓度或达到饱和状态，使某些成分在水中的溶解度降低，沉淀析出或被有机溶剂提取出。常用的无机盐有氯化钠、氯化钱、硫酸镂、硫酸钠、硫酸镁等。如三颗针根粉用稀酸浸泡，稀酸液加氯化钠近饱和即析出小聚碱盐酸盐。（七）透析法利用小分子物质在溶液中可透过半透膜，而大分子不能透过半透膜的性质而达到分离的方法。常用于纯化皂甘、蛋白质、多肽和多糖等化合物。透析法可除去其中无机盐、单糖、双糖等。透析是否成功与膜孔的大小密切相关，根据欲分离成分分子的大小选择适当规格的透析膜。常用的有动物膜（如猪、牛的膀胱），火棉胶膜、蛋白质胶膜和玻璃纸膜等。在进行透析时应经常更换膜外清水，增加透析膜内外溶液的浓度差，必要时可适当加温并加以搅拌，以加快透析速度。（八）升华法固体物质加热时，直接变成气态，遇冷凝结成原来的固体，此现象称为升华。中药中凡具有升华性质的化合物，均可用此法进行纯化。例如樟木中的樟脑，茶叶中的咖啡因以及存在中药中的苯甲酸等成分。升华法简单易行，但往往不完全，常伴有分解现象，产率低，操作时采用减压下加热升华则可避免，但该法很少用于大规模制备。第二节结晶和重结晶结晶的目的在于进一步分离纯化，便于进行化学鉴定及结构测定工作。中药成分中大半是固体化合物，且具有结晶的通性，可以根据其溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。一般能结晶的化台物可望得到单纯晶体，纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学特征，这有利于化合物性质的判断，所以结晶是研究分子结构的重要步骤。6由于初析出的结晶多少总会带有一些杂质，因此需要通过反复结晶才能得到纯粹的单一晶体，此步骤称为复结晶或重结晶。有时中药中某一.成分含量特别高，找到合适的溶剂进行提取，提取液放冷或稍浓缩，便可得到结晶。(-)结晶的条件需要结晶的溶液，往往呈过饱和状态。通常是在加热的情况下，使化合物溶解，过滤除去不溶解杂质，然后浓缩、放冷，析晶。最合适的温度为510C左右。如果在室温条件下可以析晶，就不一定要放入冰箱中。放置对形成结晶来说是一个重要条件，它可使溶剂自然挥发到适当的浓度，即可析出结晶。特别是在探索过程中，对未知成分的结晶浓度是很难预测的，有时溶液太浓，粘度大就不易结晶；如果浓度适中，逐渐降温，可能析出纯度较高的结晶。X 一射线衍射用的单晶即采用此法。在结晶过程中溶液浓度高则析出结晶的速度快，颗粒较小，夹杂的杂质可能多些。有时自溶液中析出结晶的速度太快，超过化合物晶核的形成和分子定向排列的速度，往往只能得到无定形粉末。(二)结晶溶剂的选择选择合适的溶剂是形成结晶的关键。最好它能对所需成分的溶解度随温度的不同而有显著的差异，同时不产生化学反应，即热时溶解，冷时则析出。对杂质来说，在该溶剂中应不溶或难溶。亦可采用对杂质溶解度大的溶剂而对欲分离物质不溶或难溶，则可用洗涤法除去杂质后再用合适溶剂结晶。要找到合适的溶剂，一方面可查阅有关资料及参阅同类型化合物的结晶条件；另一方面也可进行少量探索，参考“相似相容原理”加以考虑。常用的结晶溶剂有甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯等。不能选择适当的单一溶剂时可选用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂，要求低沸点溶剂对物质的溶解度大、高沸点溶剂对物质的溶解度小，这样在放置时，沸点低的溶剂较易挥发，而比例逐渐减少易达到过饱和状态，有利于结晶的形成。选择溶剂的沸点不宜太高，要适中，约在60左右，沸点太低溶剂损耗大，亦难以控制；太高则不便浓缩，同时不易除去。在结晶或重结晶时要注意化合物是否和溶剂生成加成物或含有结晶溶剂的化合物。但有时也利用此性质使本来不易形成结晶的化合物得到结晶。7（三）制备结晶的方法结晶形成过程包括晶核的形成与晶体的增长两步骤。因此，选择适当的溶剂是形成晶核的关键。通常将化合物溶于适当溶剂中，过滤、浓缩至适当体积后，塞紧瓶塞，静置，如果放置一段时间后没有结晶析出，可松动瓶塞，使溶剂自动挥发，可望得到结晶；或可加入少量品种，加晶种是诱导晶核形成的有效手段。一般地说，结晶化过程具有高度的选择性，当加入同种分子，结晶便会立即增长。如没有晶种时，可用玻璃棒摩擦玻璃容器内壁，产生微小颗粒代替晶核，以诱导方式使形成结晶。有时用玻璃捧蘸取过饱和液在空气中挥发除去部分溶剂后再摩擦玻璃器壁。上述条件失败后，应考虑所用物质纯度不够，可能是由于杂质的影响所致，则需进一步分离纯化，再尝试结晶，或化合物本身就是不能形成晶体的化合物，如菸碱等。（四）不易结晶或非晶体化合物的处理化合物不易结晶，其原因一种是本身的性质所决定，另一种在很大程度上是由于纯度不够，夹杂不纯物引起的。若是后者就需要进一步分离纯化，若是本身的性质，往往需要制备结晶性的衍生物或盐，然后用化学方法处理，回复到原来的化合物，达到分离纯化的目的。如生物碱，常通过成盐来达到纯化，常用的有盐酸盐，氢浸酸盐、氢碘酸盐、过氯酸盐和苦味酸盐等。如粉末状莲心碱是通过过氯酸盐结晶而纯化的；治疗肝炎药物的有效成分垂盆草背，本身是不结晶的，其乙酰化物却具有良好的针状晶体。此外，也可利用某些化合物与某种溶剂形成复合物或加成物而结晶，如穿心莲亚硫酸氢钠加成物在稀丙酮中容易结晶；蝙蝠葛碱能和氯仿或乙醛形成加成物结晶。但有些结晶性化合物在用不同溶剂结晶时亦可形成溶剂加成物，如汉防己乙素能和丙酮形成结晶的加成物；千金藤素能与苯形成加成物结晶。结晶的形状很多，常见为针状、柱状、棱柱状、板状、方晶、粒状、簇状及多边形棱柱状晶体等，结晶形状随结晶的条件不同而异。（五）结晶纯度的判断每种化合物的结晶都有一定的形状、色泽和熔点，可以作为初步鉴定的依据，并结合薄层色谱或纸色谱，经三种以上不同展开8系统展层，均显示的单一斑点来判断结晶的纯度。而非结晶物质则不具备上述物理性质。纯结晶性化合物都有一定的晶形和均匀的色泽，通常在同一种溶剂下结晶形状是一致的，单纯化合物晶体的熔点熔距应在0.5C左右，但由于晶体结构的原因可允许在1 2内。但也有例外，特别有些化合物仅有分解点，而熔点不明显。对立体异构体和结构非常类似的混合物，如土槿皮酸从晶形、熔点、熔距来看，是纯化合物的特征，但薄层检查有三个斑点。第三节层析分离方法层析法是目前一种被广泛应用的分离纯化的方法。由于中药中的各类成分结构不同，性质各异，选择的层析法也是不同的。层析法的分类有两种：一种是根据两相所处的状态来划分，当液体作为流动相时称液相层析，气体作为流动相时称气相层析。另一种是根据层析过程的机理来分类，利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异来分离的称吸附层析；利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同而分离的称分配层析；利用分子大小不同进行分离的称排阻层析或分子筛层析；利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离的称离子交换层析等等。需要提出的是，在层析过程中并非是单因素的作用，而是多因素的作用来达到分离目的的。下面介绍实验室中常用的一些层析方法。(一)硅胶柱层析硅胶为一多孔性物质，可用通式SiO2-xH2。表示。它具有多孔性的硅氧环的交键结构，由于其骨架表面具有很多游离、键合的硅醇基基团，它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同时能吸附多量的水分。当加热活化(100110)时，硅胶表面因氢键所吸附的水分能可逆地被除去。但温度升至500C时，硅胶表面的硅醇基进一步脱水缩合转变为硅氧烷键而不再具有吸附的性质。硅胶层析适用范围广，适用于非极性和极性化合物，如赭类、笛体、生物碱、强心甘、葱醍类、酸性、酚性化合物、磷脂类，脂肪酸、氨基酸等的分离。1.层析柱的制备9硅胶装柱一般用湿法，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待溶液中气泡除去后，连同溶剂一起倾入层析柱中，层析柱中硅胶段直径与长度之比为1:201:30。若硅胶的颗粒较细，而粒度分布范围窄，则可采用短柱（1:5）,这样不仅增大了截面积，而且也增加了样品的载量。硅胶最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段现象，影响分离效果。另亦可采用干法装柱，将所需硅胶一次倾入柱中，然后墩紧至硅胶高度不改变为止。欲分离样品与吸附剂的比例约为1:301:60.2.加样样品上柱可采取二种方式，如样品能溶于流动相，可用少量流动相溶解，从柱顶加入；如样品难溶于流动相，则可溶于适当的溶剂，拌于干燥硅胶上，待溶剂挥发尽后，再上柱。最后，在柱顶覆盖一薄层层析用硅胶或棉花，然后用流动相洗脱。3.洗脱层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大，一般没有可循的规律。通常是根据物质的极性采用相应的极性溶剂来洗脱。溶剂的洗脱能力随介电常数增大而增大，在实际吸附层析中是采用逐步递增极性的梯度洗脱方式。通常，借助硅胶薄层层析的结果来摸索分离条件，基本上可以套用于柱层析。两者所不同的在于样品与硅胶的用量比例，故通常柱层析所用的溶剂比薄层层析展开剂极性略偏小。再者可参阅前人分离同类型物质时所用的溶剂系统条件。（-）氧化铝层析氧化铝层析是常用的层析方法，适用于亲脂性成分分离。广泛应用于生物碱、笛体化合物、强心昔、精油、内酯化合物等中药成分的分离。它具有价廉、分离效果好、再生容易、活性容易控制而能适应不同化合物层析要求等优点。但是氧化铝层析还有许多缺点，有部分酚性化合物（如黄酮类化合物）、部分酸性物质（如三菇酸）能与氧化铝结合而不能应用。影响氧化铝层析的因素很多，实际操作时主要是选择具有适当活性和适当酸碱度的氧化铝，以及能充分发挥其分离效能的溶剂。1.氧化铝层析柱的选择层析柱的装置，其内径与柱长的比例在1:10-1:20之间。有时由于特殊需要，例如两个或两个以上性质相近的成分的分离，为了提高分离效果，可适当采用细长的层析柱。102.层析柱的制备一般先量取一定体积的溶剂（Vo）,将层析柱的活塞稍打开，使溶剂滴入接收器中，同时将氧化铝慢慢地加入使它一面沉降，一面添加，直到加完为止。氧化铝加入速度不宜太快，否则将带入气泡而“破坏”层析柱。必要时可在层析管外轻轻给以振动，使氧化铝均匀下降，并有助于氧化铝带入的气泡外溢。当采用活性较高的氧化铝进行层析时 一，更应注意。待氧化铝加完后，仍使溶剂流动一定时间，然后将氧化铝柱上面的溶剂全部滴入接收器，量取接收器内溶剂量（1）。从VoVi之差，称为柱体积。这样，在层析过程中，我们就能主动掌握大致在什么时候开始收集流份。当变换溶剂的时候，就新换溶剂大致从何流份开始。氧化铝的用量般采用样品量的20 50倍，根据被分离化合物的性质而定。有时遇到碳氢化合物如菇烯、倍半菇烯等，氧化铝对这些化合物的吸附力较弱，层析时氧化铝用量略增，为样品量 的100 200倍，而且为了尽量减少碳氢化合物在层析柱中扩散，层析过程中不能有间歇。3.加样一般将样品溶于有机溶剂中，轻轻注入已准备好的氧化铝柱上面，勿使氧化铝柱面受到扰动，否则将影响层析效果。如果样品不易溶于开始层析时使用的有机溶剂，那么，先将样品溶于能溶的有机溶剂，以少量的氧化铝拌匀，然后将有机溶剂挥发干挣，再按氧化铝一般装柱法，将带有样品的氧化铝加入层析柱中。4.洗脱洗脱过程与氧化铝活性、被吸附物质的性质、温度及溶剂的性质及浓度有关。就溶剂而言，极性溶剂的洗脱能力较非极性溶剂大，所以逐步增加溶剂的极性，可使吸附在氧化铝柱上的不同化合物逐个洗脱，达到分离的目的。（三）聚酰胺层析聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，商品名为锦纶、尼龙。自1955年发现聚酰胺层析分离酚性物质以来，目前已发展成为分离极性和非极性物质的用途广泛的层析方法，如黄酮类、酚类、酸类、有机酸、生物碱、菇类、备体、背类、糖类、氨基酸衍生物、核甘类等。尤其是对黄酮类、酚类、醍类等物质的分离，远比其他方法优越。其特点是：对黄酮类等物质的层析是可逆的，分离效果高，可使性质极相近的类似物得到分11离；其柱层析的样品容量大，适于制备分离。聚酰胺薄膜层析则是一种用途广、快速、简便的分析、分离方法。因此，聚酰胺层析应用后，不仅为黄酮等酚性物质的分离提供了有效方法，而且也为分离其他物质增加了一种手段。1.聚酰胺粉的处理锦纶中通常有两种杂质：一种是锦纶的聚合原料单体及其小分子聚合物。另一种是蜡质（锦纶丝在制成后，表面曾涂过一层蜡）。这些杂质必须除去，否则原料单体及其小分子聚合物可与酚类物质形成复合物。蜡质能被醇液洗脱卜来，与分离物质混在一起则难以除去。除去单体及小分子聚合物的方法，具体如下：聚酰胺粉以90 95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入层析柱中。用 3 4 倍体积的90 95%乙醇洗涤，洗至洗液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣）。再依次用2 2.5倍体积的5%氢氧化钠水溶液、1倍体积的蒸储水、2 2.5倍体积的 10%醋酸水溶液洗涤，最后用蒸储水洗至中性，备用。2.层析柱的制备若用含水溶剂系统层析，常以水装柱。在以非极性溶剂系统层析时，常以溶剂组份中极性低的组份装柱。若以氯仿装柱，因其比重较大，使聚酰胺粉浮在上面，加样时应将柱底端的氯仿层放出，并立即加样，加样后顶端以棉花塞紧，在层析关闭时，应将顶端的多余氯仿液放出，否则，聚酰胺会浮起而搅乱层析带。3.加样聚酰胺的样品容量较大，一 般 每 100 m l聚酰胺粉可上样L 52.5g,可根据具体情况适当增加或减少。若利用聚酰胺除去糅质，样品上柱量可大大增加，通常观察糅质在柱上形成的橙红色色带的移动，当样品加至该色带移至柱的近底端时，停止加样。样品常用洗脱剂溶解，浓度在20 30%。不溶样品可用甲醇、乙醇、丙酮、乙醛等易挥发溶剂溶解，拌入聚酰胺干粉中，拌匀后将溶剂减压蒸去，以洗脱剂浸泡装入柱中。4.洗脱聚酰胺层析的洗脱剂常采用水一乙醇（10%、30%、50%、70%、95%）,氯仿一甲醇（19:1,10:1,5:1,2:1,1:1）依次洗脱。若仍有物质未洗脱下来，可采用3.5%氨水洗脱。洗脱剂的更换，般根据流出液的颜色，当颜色变为很淡时更换下一种溶齐!J,并以适当体积分瓶收集，分瓶浓缩。各瓶浓缩液以聚酰胺薄膜层析检查其成分，成分相同者合并。再进入下一步纯化。12（四）活性炭层析活性炭柱层析对于分离水溶性物质（如氨基酸、糖类及某些背类）是一种较好的方法，它是分离水溶性物质的主要方法之一。其特点是样品上柱量大，分离效果好，活性炭来源较易，价格便宜，适用于大量制备分离。但是，由于活性炭的生产原料不同，制备方法及规格不一，其吸附力不象氧化铝、硅胶那样易于控制。到目前为止，尚无测定其吸附力级别的理想方法，因而限制了其广泛应用。1.活性炭的来源、规格及性能活性炭的来源一般分为动物炭、植物炭和矿物（煤）炭三种，分别采用动物的骨头、木屑、煤屑高温炭化而成。目前市售的医药用活性炭及层析用活性炭多以木屑做原料，加 氯 化 锌 在700800C高温炭化、活化，经适当处理除去杂质而制成。由于植物体内含有各种金属离子及生产过程中加入氯化锌，虽在出厂前经过适当处理，但也难免含有微量重金属离子，用时应注-尼i*r.、o用于层析的活性炭，基本上可以分三类：（1）粉末状活性炭：一般为医药用或化学纯活性炭。该类活性炭颗粒极细，呈粉末状，其总表面积特别大，吸附力及吸附量也特别大，是活性炭中吸附力最强的一类。但是，由于其颗粒太细，在层析过程中流速极慢，需要加压或减压操作，手续较繁。（2）颗粒状活性炭：其颗粒较前者为大，其总表面积也相应减小，吸附力及吸附量也较次于前者。但是，在层析过程中流速易于控制，勿需加压或减压操作，克服了粉末状活性炭的缺点。（3）锦纶活性炭：这种活性炭是以锦纶为粘合剂，将粉末状活性炭制成颗粒。其总表面积较颗粒状活性炭为大，较粉末状活性炭为小，其吸附力较二者皆弱。因为锦纶不仅单纯起一种粘合作用，它也是一种活性炭的脱活性剂，因此可用于分离前两种活性炭吸附太强而不易洗脱的化合物。用其分离酸性氨基酸及碱性氨基酸，可取得很好效果。流速易控制，操作简便。2.活性炭对物质的吸附规律及应用活性炭在水溶液中的吸附力最强，在有机溶剂中吸附力较弱，故用有机溶剂脱吸附。在定条件下，对不同物质的吸附力也不一样，一般来讲：（1）对极性基团（如-COOH,-NH2，-OH等）多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。例如，活性炭对酸性氨基酸和碱性13氨基酸的吸附力大于中性氨基酸。原因就是酸性氨基酸中的竣基比中性氨基酸多，碱性氨基酸中的氨基（或其他碱性基团）比中性氨基酸多。因而，可借此性质将酸性氨基酸或碱性氨基酸与中性氨基酸分开。（2）对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，因而可借此性质将芳香族氨基酸与脂肪族氨基酸（两者的氨基和竣基数目相同）分开。也可将某些水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开。（3）对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。例如，活性炭对肽的吸附力大于氨基酸，对多糖的吸附力大于单糖。因此可利用活性炭分离氨基酸与肽，单糖与多糖。氨基酸、单糖先洗脱下来；肽、多糖后洗脱下来。3.活性炭的处理活性炭是一种强吸附剂，对气体的吸附力及吸附量都很大。气体分子占据了活性炭的吸附表面，因而造成所谓活性炭“中毒”，使其活力降低。同时，又有一些气体可引起某些副反应，如氧气可引起层析物质的氧化。为了防止该副反应的发生，最简单方便的方法就是加热烘干，可将吸附的绝大多数气体除去。一般在使用前，将活性炭在120加热干燥4 5小时即可。锦纶活性炭因锦纶受热温度高要变形，在100干 燥4 5小时即可。另外，活性炭在生产过程中曾加入氯化锌活化，生产原料木屑内也含有各种金属离子，它们对层析带来很多麻烦。特别是重金属离子，其本身具有很高的毒性，而且吸附在活性炭表面上，具有强的催化作用，致使层析物质产生某些催化反应，因此必须将其除去。医药用、化学纯活性炭在出厂前对所含杂质及重金属均经检查，符合规定要求。锦纶活性炭在制备过程中也经过大量酸洗、水洗，勿需特别处理即可应用。但是，工业用活性炭在用前必须进行严格处理，一般处理方法有二：一、将工业用活性炭置于烧瓶中，加入2 3M盐酸，水浴加热半小时，在加热过程中，间歇地振摇。然后减压滤干，如此以酸处理2至3次，再以热蒸饰水洗涤至p H 5-6,滤干，烘箱中150c干 燥8小时，置于瓶中，密塞备用。二、将工业用活性炭置于三角瓶中，加20%醋酸水溶液，煮 沸510分钟，减压滤干，以除去含氮杂质及部分金属离子。如此处理2至3次，再以热蒸储水洗至pH56,滤干。将其悬浮于水中，每100g活性炭中加入氟化钾50mg（预防重金属离子的催化作用），直火加热，在60保 持10分钟，趁热过滤，以热蒸储水洗至pH6 7,烘 箱 中100C干燥至恒重，于瓶中密塞备14用。4.柱层析的操作(1)装柱：因活性炭在水中吸附力最强，一般在水中装柱。活性炭以蒸储水浸泡1小时左右，不断搅拌除去气泡。倒入柱中，让其自然沉降，装至所需体积，备用。粉末状活性炭因流速太慢，则需与硅藻土(1:1)混合后，再用蒸储水调成糊状装柱，并月待样品上柱后，层析柱顶端连有自动控制的加压泵进行层析。(2)加样：样品一般用水溶解。浓度在2550%之间，即1 g样品溶于24 ml水中。活性炭层析的样品上柱量较大，一般每100mg活性炭可上样510 g。在某些情况下，样品的上柱量及样品浓度可适当增加或减少。例如，当欲分离之成分在样品中的相对含量较低，且易吸附于柱上，而其他成分不易吸附时，则可将上柱量增大，使大部分成分很快从柱上流下，而欲分离之成分经适当洗脱即可得到；当欲分离之成分不易被活性炭吸附且不易吸附之成分不只一个，则样品上柱量必须大大减少，才能达到分离目的。总之，具体情况具体分析，不能生搬硬套。某些样品在水中不易溶解时，可加适量甲醇、乙醇或丙酮使其溶解。但样品体积不可太大，样品上柱量也应相应减少，否则影响分离效果。(3)洗脱：洗脱溶剂一般采用水、各种浓度的乙醇液。也有人采用510%丙酮液、25%醋酸、15%苯酚水溶液等洗脱，但不常用。最常用的是水一乙醇溶液梯度洗脱，其洗脱顺序是：水、10%、20%、30%、50%、70%的乙醇溶液。若仍有部分物质未洗脱下来，最后可用适当有机溶剂或3.5%氨水洗脱。流出液以适当体积分瓶收集，分别浓缩。用过的活性炭可以用酸碱处理回收，因活性炭来源较易，价格便宜，一般不回收使用。(五)大孔吸附树脂层析大孔吸附树脂是一种不含交换基团的、具有大孔结构的高分子吸附齐!J,也是一种亲脂性物质。它可有效地吸附具有不同化学性质的各种类型的化合物，以范德华力从很低浓度的溶液中吸附有机物。大孔吸附树脂由于具有选择性好、吸附容量大、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快、解吸容易等优点，现广泛应用于工业废水的处理，维生素、抗生素的分离提纯及水溶性成分的分离纯化，近年来多用于皂普及其它甘类化合物的分离。151 .大孔吸附树脂的类型及性能大孔吸附树脂一般为白色颗粒状，理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。按性能分为极性、中极性和非极性三种类型。非极性吸附树脂是以苯乙烯为单位，二乙烯苯为交联剂聚合而成，故称为芳香族吸附剂。中极性吸附树脂是以甲基丙烯酸酯为单位和交联剂聚合而成，也称为脂肪族吸附剂。极性吸附树脂则在结构中含有硫氧、酰胺、氮氧等基团。由于树脂性质各异，使用时须加以选择。如分离极性较大的化合物应选用中极性的树脂，而极性较小的化合物则选用非极性树脂。2 .大孔吸附树脂的预处理及再生新购的树脂一般是用氯化钠及硫酸钠处理过的，同时树脂内部尚存在未聚合的单体，残余的致孔剂、引发剂、分散剂等，故用前必须除去。将新购的树脂放在烧杯中，加入足量的水，使其溶胀至体积不再增加为止，然后倒入层析柱内，使柱内树脂量不要超过柱长的1/2以上，除去悬浮于水溶液面上的树脂颗粒，再用9 5%乙醇洗柱，直至流出液加2倍水混合后不呈白色浑浊为止，最后用水洗涤除尽乙醇备用。树脂经解吸附后即需再生。再生时用甲醇或乙醇浸泡洗涤即可达至I J,必要时可用1M盐酸或氢氧化钠溶液依次洗涤，然后用水洗至中性，浸泡在甲醇或乙醇中备用，使用前用水洗涤除尽醇即可使用。3 .柱层析大孔吸附树脂采用湿法装柱，湿法上样。样品液一般为浓缩液，以澄清为好。混合组分在大孔树脂上吸附后，一 般依次用水、含水甲醇、乙醇或丙酮1 0%,2 0%（V/V）洗脱，最后用浓醇或丙酮洗脱，分别收集各部分洗脱液，经T L C或P C检测并合并相同组分。16第 三 章 实 验实验一延胡索生物碱的系统分离法实验目的(1)了解生物碱的系统分离法的原理及应用。(2)掌握生物碱的系统分离法的具体操作步骤。延胡索为罂粟科植物延胡索Cory dalis y anhu su o W.T.Wang的干燥块茎。主产于河北、山东、江苏、浙江等地。延胡索具有活血、利气、止痛的作用，用于治疗胸胁、脱腹疼痛、经闭痛经、产后淤阻、跌打疼痛等。主要的化学成分是生物碱，其中叔胺类含量为0.65%,季 胺 类 约0.3%,目前已从中分离得到近20种生物碱。1.基本原理除水溶性生物碱外，大多数生物碱溶于有机溶剂不溶于水，而生物碱的盐类能溶于乙醇及水，难溶于有机溶剂。因此，生物碱盐的水溶液用酸萃取时，生物碱盐不能自水液中提出，必须加碱碱化使生物碱游离，游离的生物碱则可溶于有机溶剂而被提出。常用的生物碱萃取溶剂为乙酸、氯仿。生物碱因其结构可分为四种类型，由于生物碱的理化性质与其结构有关，根据其理化性质不同，可将各类型生物碱进行分离(见系统分离流程)。(1)弱碱性生物碱一一因其碱性极弱，与酸结合成盐不稳固，则易自中性或酸性水溶液中转溶于有机溶剂，故 在 酸 液A中可能出现。(2)非酚性叔胺生物碱一一一般碱性较强，其盐类在碱化后，生物碱游离，转溶于有机溶剂，故在酸液B中出现。(3)酚性叔胺生物碱可 与 苛 性 碱(NaOH,KOH或Ca(OH)2)生成钠、钾或钙盐，溶于水而不溶于有机溶剂，酸化中和后再加碱(氨水或碳酸钠)则游离出生物碱，从而可溶于有机溶剂，故在酸液C中出现。(4)水溶性生物碱易溶于水，不溶于有机溶剂。它包括季钱生物碱、氮氧化物等，故保留在最后水溶液中。172.系统分离流程药材粉末95%乙醇回流提取,过滤药渣 乙醇提取液减压回收溶剂至无醇味乙醇提取物稀盐酸溶解,过滤沉淀（非生物碱）酸水液I乙 醛（或氯仿）萃取酸 液（A）（弱碱性生物碱）水 液（A）加 稀NaOH溶液至强碱性,v乙 醛（或氯仿）萃取酸 液（B）水 液（B）（非酚性叔胺生物碱）加稀HC1中和后，再加氨水使呈碱性,乙 酸（或氯仿）萃取酸 液（C）水 液（C）（酚性叔胺生物碱）（水溶性生物碱）3.操作药材选用罂粟科紫堇属植物延胡索（又名元胡、玄胡）Cory dalisy anhu su o W.T.Wang 块茎粉末。（1）预试：按“中药化学成分鉴别法中生物碱的鉴别”项下的实验方法进行，结果填入表中。（2）生物碱的系统分离及鉴定：取延胡索粉末10 g,加95%乙 醇15m l,水浴 回 流3 0分钟，将提取液转于圆底烧瓶中。药渣如前18法再提取一次，回 流 1 0 分钟，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至无醇味。用5%盐酸30ml搅拌溶解，冷却后过滤，得澄明水液。残渣用5%盐酸15 m l,同前再操作一次，水液合并。弱碱性生物碱的分离：用乙醛8 m l萃取前面所得酸水液，并按以下操作步骤检查：取酸层4 m l,再以稀酸水萃取，取酸水层分别与四种生物碱沉淀试剂作沉淀反应，然后根据沉淀产生与否决定是否再萃取，直至沉淀反应阴性为止，得酸液（A）。非酚性叔胺生物碱的分离：取水液（A）2 m l,分为四份，作沉淀反应，若产生明显沉淀，则将其余水液（A）用 2 M NaOH调至pH工1 0,用 8 m l乙醛萃取，同上法操作。得酸液（B）。酚性叔胺生物碱的分离：取水液（B）2 m l酸化至pH 3,分为四份作沉淀反应，若产生明显沉淀，向水液（B）中加2%盐酸中和，再用5%氨水调至pH9左右，同上法操作，得 酷（C）o水溶性生物碱的鉴定：取 2 ml水液（C）用2%盐酸酸化至pH5)-orange needle(acetic acid),soluble in benzene,chloroform,methyl benzene.RiR2ConstituentsnameCrystalappearancemp-H-COORhein（大黄酸）yellow needle321322-OH-CH3Emodin（大黄素）orange needle256257-H-CH2OAloe-emodin（芦荟大黄素）small orangeneedle223 224-OCH-CH3Physcion（大黄素甲酸）brick-red needle203206-H-CH3Chrysophannl(大黄酚)golden-yellowneedle196 197 cB.Anthracene derivative glycosides(combined form with sugar)(l)Ant