动物组织中硝呋索尔代谢物残留量的液相色谱串联质谱法测定.docx

动物组织中硝呋索尔代谢物残留量的液相色谱串联质谱法测定赵凤娟;肖陈贵;岳振峰;张毅;欧阳姗;康海宁;韩瑞阳【摘 要】建立了动物组织中硝呋索尔代谢物二硝基水杨酸肼(DNSAH)残留量的高效液相色谱-串联质谱检测方法(HPLC-MS/MS).动物组织中的硝呋索尔代谢物在酸性条件下水解过夜,同时参加 2-硝基苯甲醛进展衍生化反响,经乙酸乙酯提取浓缩,正己烷净化后.承受 Thermo Hypersil Gold C18(100 mm ×2.1 mm i.d.,1.9 m)反相色谱柱进展分别,以甲醇-水为流淌相,梯度洗脱,流速为 0.3 mL/min,用高效液相色谱-串联质谱仪以负离子多反响监测模式测定.结果显示,在动物组织中,DNSAH 的定量下限为 0.5g/kg；线性范围为 0.5 5.0 g/kg,加标回收率为 91 103,相对标准偏差为 3.713.6.该方法简便、快速、准确,各项技术指标满足国内外法规的要求,适用于动物组织中硝呋索尔代谢物残留量确实证与检测.%A high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric( HPLC - MS/MS) method was developed for the determination of nifursol metabolite 3, 5-dinitrosalicylic acid hydrazide (DNSAH) residue in animal tissues. The sample was extracted with ethyl acetate after hydrolysised and derivatized, then cleaned up by n-hexane. The condensed sample solution was separated on a reversed-phase column of Thermo Hypersil Gold C18(100 mm ×2. 1 mm i. d. , 1. 9 m)by gradient elution with methanol - water as mobile phase at a flow rate of 0. 3 mL/min. The quantitation detection was performed by HPLC -tandem MS using multiple reaction monitoring ( MRM) under negative ion electrospray ionization. The calibration curve of DNSAH was linear in the range of 0. 5 -5. 0 g/ kg. The limit of quantitation was 0. 5 |xg/kg. The recoveries at three spiked levelswere between 91% and 103% with RSDs(n =6) of 3. 7% -13.6%. Themethod was sensitive and accurate, and could meet the requirements of the domestic and international legislations. Therefore, the method was suitable for the determination and confirmation of residue of nifursol metabolite in animal tissues.【期刊名称】分析测试学报【年(卷),期】2023(031)011【总页数】5 页(P1416-1420)【关键词】液相色谱-串联质谱;硝呋索尔;动物组织;残留【作 者】赵凤娟;肖陈贵;岳振峰;张毅;欧阳姗;康海宁;韩瑞阳【作者单位】深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,广东深圳 518045;深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,广东深圳 518045;深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,广东深圳 518045;深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,广东深圳 518045;深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,广东深圳 518045;深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,广东深圳 518045;深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,广东深圳 518045【正文语种】中 文【中图分类】O657.63;TQ455.5硝呋索尔(Nifursol)，又称硝呋柳肼，是硝基呋喃类抗菌药，在国外作为饲料添加剂用于预防和治疗家畜原虫感染。在使用过程中，硝呋索尔原药在动物体内会很快代谢，生成代谢产物 3，5-二硝基水杨酸肼(3，5-Dinitrosalicylic acid hydrazide ，DNSAH)和 5-硝基-2-糠酸，二者均可作为硝呋索尔的残留标志物12，图 1为硝呋索尔及 DNSAH 的分子构造。此类代谢物在动物体内能与蛋白严密结合， 形成稳定的结合态残留物，可在体内存在相当长时间，具有肯定的毒性。欧盟1756/2023/EC 和 90/2377/EC 指令中附录 IV 公告中制止使用硝呋索尔作为兽药添加剂34，我国目前也打算对此工程进展监控。由于硝呋索尔是以代谢物形式在动物体内残留，其残留水平低，基质简单。对于低残留水平的兽药残留测定多使用高灵敏度和高选择性的技术，如 LC/UV、LC MS、LCMS/MS 等。目前国内尚未见硝呋索尔代谢物的残留量检测的报道。国外关于动物组织中硝呋索尔代谢物的残留检测有少量报道，方法多为液质联用法12，56，而对与硝呋索尔性质接近的硝基呋喃类药物的检测报道较多711。本方法基于液质联用法高选择性和较强抗干扰力量的特点，将样品水解、衍生，承受乙酸乙酯提取浓缩后，用液相色谱串联质谱检测方法(LCMS/MS) 进展测定，实现了动物组织中硝呋索尔代谢物残留量的高灵敏度确证与检测，其定量下限达 0.5 g/kg，可满足禁用物质残留的分析要求。1.1 仪器与试剂TSQ Vantage 型串联质谱仪，配电喷雾离子源(Thermo Fisher 公司)，UPLC 超高压液相色谱仪(Waters 公司);Hitachi TF-123 组织切碎机(日本 Hitachi 公司);漩涡振荡混合器(美国 Thermo 公司);Sigma 低温离心机(最大转速 10 000 r/min， 美国 Sigma 公司);Caliper TurboVap LV 型吹氮浓缩仪;Gilson 移液器(可调范围:10100、20200、101 000、1 0005 000 L，法国 Gilson 公司)。3，5-二硝基水杨酸肼(DNSAH，纯度 93.0%，购自 LGC);2-硝基苯甲醛(2-NBA， Sigma 公司);甲醇、乙酸乙酯、乙酸(HPLC 纯，德国 Merck 公司);盐酸、磷酸二氢钠均为分析纯;鸡肉、鸡肝、鱼肉均为市购。1.2 样品前处理由于硝呋索尔代谢物 DNSAH 的性质与硝基呋喃类药物的代谢物构造性质比较相近，本争论承受 GB/T 21311202312中的样品前处理步骤对样品进展处理。定容液承受乙腈水溶液(5050)。1.3 色谱与质谱条件Thermo Hypersil Gold C18 色谱柱(100 mm×2.1 mm i.d.，1.9 m);进样量:10 mL;流淌相为甲醇水;流速:0.3 mL/min;洗脱梯度:在 3 min 内甲醇由 30%线性升至 90%，保持 3 min，柱平衡时间 3 min。ESI离子化模式:质量区分率:单位区分率;质谱扫描方式:多反响监测(MRM);电喷雾电压:3 000 V;碰撞气:氩气;碰撞气压力:1.5 mTorr;毛细管温度:350;鞘气压力:44 psi;定量离子对:374/183(m/z)，碰撞能量 29 eV;定性离子对:374/226(m/z)，碰撞能量 24 eV。参考保存时间 3.17 min。2.1 试验条件的优化2.1.1 样品的前处理方法 DNSAH 的分子量较小，从构造上看无法直接电离产生较好的质谱信号，给定量定性带来困难，本争论承受 2-硝基苯甲醛对其支链上的自由氨基进展衍生化，形成一个具有较好质谱特性的化合物。由于硝呋索尔进入动物体后会很快代谢，产生与蛋白严密结合的有毒代谢产物 protein-DNSAH13， 因而在提取前，需将结合态的 DNSAH 水解为游离态，再进展衍生化反响，因而本试验在 0.2 mol/L 的盐酸中水解 16 h(过夜)，同时参加衍生试剂进展衍生反响， 生成衍生化的物质，其衍生反响如图 2 所示。衍生化产物 NPDNSAH 在中性条件下易溶于乙酸乙酯，因而在衍生完成后，参加缓冲溶液，用 NaOH 溶液将试液调整至 pH 7.07.2，用乙酸乙酯进展提取， 浓缩，并经正己烷脱脂净化，完成代谢物 DNSAH 的提取。2.1.2 质谱条件的优化 取 1 mg/L 的 DNSAH 标准溶液 5 mL，参加 100 L 30 g/L 2-NBA 溶液，充分振荡反响后得到 1 mg/L NPDNSAH 标准溶液，将该溶液以流淌注射的方式在正离子和负离子模式下进展母离子全扫描，确定分子离子。结果显示，NPDNSAH 在负离子条件下有较强的分子离子峰，以此分子离子为母离子，对其子离子进展全扫描，选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为定性离子。优化碰撞能量、毛细管电压、碰撞气压力等，使分子离子和特征碎片离子强度到达最大。优化后的质谱条件见“1.3”。2.1.3 流淌相的选择 硝呋索尔代谢物的前处理检测与呋喃西林等 4 种药物的代谢物检测全都，在日常检测中可将 5 种化合物一起承受正负离子切换的模式进展检测。试验在梯度洗脱条件下考察了分别以甲醇水、乙腈水及不同浓度和不同 pH 值的乙酸铵溶液为流淌相时化合物的峰形及分别状况。结果说明，用乙酸铵溶液作为流淌相并转变 pH 值进展试验时，酸性条件下乙酸铵的存在有助于呋喃西林等 4 种药物代谢物的电离，但由于 NPDNSAH 是在负离子模式下进展扫描检测，随着pH 值的降低，NPDNSAH 的信号渐渐减弱，且当 pH 值低于 4.5 时，会消灭严峻的峰拖尾现象。而承受甲醇水或乙腈水体系作为流淌相，梯度洗脱均能得到锋利对称的峰形，满足质谱检测的要求，考虑到甲醇水体系同时有助于在正离子模式下检测物质的电离，本试验最终承受甲醇水体系作为流淌相。2.2 线性关系与定量下限取 5 个不含硝呋索尔代谢物的样品，分别 加 入 0.5、1.0、2.0、5.0 g/kg DNSAH 标准溶液，依据上述试验步骤操作，以浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准工作曲线。结果显示，待测物在 0.55.0 g/kg 范围内与对应的峰面积呈良好线性关系，不同样品基质中的线性方程、相关系数见表 1。方法的定量下限为 0.5 g/kg，满足禁用物质检测法规要求。2.3 回收率与周密度以不含硝呋索尔代谢物残留的鸡肉、鸡肝和鱼肉为空白样品，进展 0.5、1.0、2.0 g/kg 3 个水平的加标回收试验，方法的回收率及相对标准偏差见表 2。鸡肉样品的回收率为 91%94%，相对标准偏差为 3.7%11.3%;鸡肝样品的回收率为97%101%，相对标准偏差为 12.6%13.6%;鱼肉样品的回收率为 96%103%， 相对标准偏差为 4.0%7.2%。试验结果满足国内外对残留分析的要求。图 3 为空白及加标鸡肝样品的多反响监测色谱图。2.4 实际样品分析应用本方法的检测步骤和仪器条件，对鸡肉、鱼肉等进出口动物组织样品进展检测， 共检测样品 63 份，其中在 1 份鸡肉样品中检出硝呋索尔代谢物，含量为 0.972 g/kg。本争论建立了鸡肉、肝脏及鱼肉中硝呋索尔代谢物残留量确实证检测方法，并对方法的准确性、重现性等进展了验证。试验证明，本方法灵敏、准确，填补了国内该药物检测的方法空白，完全满足国内外对该药物的监控及检测要求。【相关文献】1 Vahl MFood Addit.Contam.，2023，22(2):1201272 Mulder P P J，Zuidema T，Keestra N G M，Kooij P J F，Elbers I J W，van Rhijn J AAnalyst，2023，130:7637713 EU Council Regulation No.1756/2023/EC Off.J.Eur m.，2023，L265，14 EU Council Regulation No.2377/1990/EC Off.J.Eur m.，1990，L224，15 Verdon E，Couedor P，Sanders PAnal.Chim.Acta，2023，586:336 3477 Steven J L，Kyung Ae S，Hyeyoung K，Urairat K，Wusheng F，Katerina M，Eunha H，Natchanun LJ.Chromatogr.A，2023，(1217):254825606 Hoogenboom L A P，Berghmans M C J，Polman T H G，Parker R，Shawb I CFood Addit.Contam.，1992，9(6):6236307 Horne E，Cadogan A，O”Keeffe M，Hoogenboom L A PAnalyst，1996，121:146314688 Cooper K M，Mulder P P J，Rhijn J A，Kovacsics L，McCracken R J，Young P B， Kennedy D GFood Addit.Contam.，2023，22(5):4064149 Mottier P，Khong S P，Gremaud E，Richoz J，Delatour T，Goldmann T，Philippe AJ.Chromatogr.A，2023，1067(1/2):859110 Finzi J K，Donato J L，Sucupira M，Nucci GJ.Chromatogr.B，2023，824(1/2):303511 Conneely A，Nugent A，O”Keeffe M，Mulder P P J，van Rhijn J A，Kovacsics L， Fodor A，McCracken R J，Kennedy D GAnal.Chim.Acta，2023，483(1/2):919812 GB/T 213112023Determination of Residues of Nitrofuran Metabolites in Foodstuffs of Animal OriginHPLC MS/MS MethodNational Standards of the People”s Republic of China( 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱串联质谱法)13 Hoogenboom L A P，Kammen M，Berghmans M C J，Koeman J H，Kuiper H AFood Chem.Toxicol.，1991，29(5):321328