(12.7.2.2)--2010 转基因与基因敲除.ppt

转基因基因敲除动物的制作及其应用转基因基因敲除动物的制作及其应用IntroductionA:Searching reasons of disease,eg.cancerB:Mechanism of basic physiologyC:Molecular function of some important proteinsD:Searching for new drugsMedical research work in the world including:Gene function analysisHow to analyze gene functionUV irradiationChemical drug inducing1Gene mutationPhenotype easily getDifficultly pick up which gene23Target knock out(homologue recombination)Phenotype get?known geneGene trap(Integrated mutation)Phenotype easily getEasily find gene(how much time?)(about 4 years)(about 2.5 years)Each geneEach known geneExpression geneAnimal model5 RNA interference,RNAi:in vitro4 Transgenic animal(overexpression)Phenotype easily getknown gene(about 1-2 years)Phenotype easily getknown gene一概念一概念转基因转基因(Transgene):将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。转基因动物转基因动物(Transgenic Animal)符号符号:+gene所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。定整合并能遗传给后代的一类动物。基因敲除（基因敲除（Gene knock out)符号符号:-gene:-gene采用同源重组的方法采用同源重组的方法采用同源重组的方法采用同源重组的方法,用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因,再应用转基因方法孵育出转基因动物再应用转基因方法孵育出转基因动物再应用转基因方法孵育出转基因动物再应用转基因方法孵育出转基因动物,即为基因敲除动物。即为基因敲除动物。即为基因敲除动物。即为基因敲除动物。世界第一只转基因动物绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠HBV转基因动物树鼩 二为什么要制作转基因和基因敲除动物？1.研究基因功能的最好模式研究基因功能的最好模式。转基因动物过度表达某基因，研究过多的基因产物在生物体内的作用基因敲除动物抑制某基因的表达，研究没有某基因时，生物体出现的异常2.建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。如糖尿病小鼠，帕金森病模型小鼠，HBV转基因小鼠等 3.改善生物生产性能，提高生物育种效率。改善生物生产性能，提高生物育种效率。美国，转基因作物产量居世界第一，美国种植的75的大豆、34的棉花和71的玉米都是转基因作物。转基因牛：改变牛奶成分及提高产奶 转基因羊：改良羊毛生长 转基因鱼：生长速度提高，以及导入抗冻蛋白基因、珠蛋白基因的鱼 转基因鸡：改良现有品种的遗传特性，增强鸡对于感染的抵抗能力，降低对疾病的易感性，还可以将母鸡产 生的外源蛋白收集到蛋内，以供医疗和保健之用。1.4.作为医用或食用蛋白的生物反应器。作为医用或食用蛋白的生物反应器。生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白(Simmons et al,1987,Nature.Sheep beta-lactoglobulin in mouse milk;Gordon et al,1987,Biotechnol.1.Human tPA(tissue-type plasminogen activator)in the milk of mouse)。用于表达的生物反应器包括动物用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等。血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等。其中动物乳腺生物反应器是目前国际上唯一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器。其中动物乳腺生物反应器是目前国际上唯一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器。1.1.据预测，据预测，20102010年世界上动物乳腺生物反应器的年产值将达到年世界上动物乳腺生物反应器的年产值将达到500500亿美元以上。亿美元以上。三哺乳动物转基因技术的研究概况哺乳动物转基因技术的研究概况 19741974年，美国科学家年，美国科学家JaenischJaenisch等人最早把猿猴病毒害等人最早把猿猴病毒害4040（SV40SV40）注入小鼠）注入小鼠囊胚腔中，得到部分体组织中含有囊胚腔中，得到部分体组织中含有SV40DNASV40DNA的嵌合体小鼠。的嵌合体小鼠。19801980年，年，GordonGordon等把等把SV40DNASV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。19821982年，年，PalmiterPalmiter和和BrinsterBrinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照组小鼠卵，获得了成年体重是对照组小鼠2 2倍的倍的“超级鼠超级鼠”。19871987年，年，SimonsSimons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的-球蛋白球蛋白。19881988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了抗胰蛋白酶。年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了抗胰蛋白酶。19891989年，一篇论文宣告：人类用胚胎干细胞培育出第一只基因打靶小鼠，即年，一篇论文宣告：人类用胚胎干细胞培育出第一只基因打靶小鼠，即基因被特定修饰的小鼠。美国科学家马里奥基因被特定修饰的小鼠。美国科学家马里奥卡佩基和奥利弗卡佩基和奥利弗史史 密斯共同发明了打靶修饰基因的技术，英国科学家马丁密斯共同发明了打靶修饰基因的技术，英国科学家马丁埃文斯在埃文斯在 小鼠的胚胎中发现了具有生殖能力的胚胎干细胞。小鼠的胚胎中发现了具有生殖能力的胚胎干细胞。他们分享了他们分享了20072007年度的诺贝尔生理学和医学奖。年度的诺贝尔生理学和医学奖。至至20042004年年1010月，约月，约10%10%的的mouse genomemouse genome实现了实现了KnockoutKnockout 四、哺乳动物转基因技术的制作程序四、哺乳动物转基因技术的制作程序(一一)目标基因克隆和体外重组目标基因克隆和体外重组 目标基因是准备导入受体的目标基因是准备导入受体的DNADNA序列，目前获序列，目前获得目标基因的途径有三条：得目标基因的途径有三条：1.1.人工合成人工合成它是用它是用DNADNA合成小片段碱基序列，一般不超过合成小片段碱基序列，一般不超过100100个碱基。个碱基。2.2.互补互补DNADNA（cDNAcDNA）的克隆的克隆 通过提取组织中的通过提取组织中的mRNAmRNA，用反转录酶合成用反转录酶合成cDNAcDNA，建立建立cDNAcDNA文库，再克隆目标蛋白的文库，再克隆目标蛋白的cDNAcDNA。3.3.DNADNA克隆克隆 首先建立动物的首先建立动物的DNADNA文库，再通过基因克隆技术文库，再通过基因克隆技术获得编码目标蛋白的基因，这是获得目标基因最常获得编码目标蛋白的基因，这是获得目标基因最常用的方法。用的方法。目标基因被克隆以后需与表达载体相连结，形目标基因被克隆以后需与表达载体相连结，形成一个独立表达的调控单元，再通过扩增和纯化，成一个独立表达的调控单元，再通过扩增和纯化，使使DNADNA达到一定浓度就可用于基因导入。达到一定浓度就可用于基因导入。以山羊乳腺特性表达载体以山羊乳腺特性表达载体pBC1为例为例G418启动子(二二)外源基因的导入外源基因的导入 外源基因的导入方法主要有五种：外源基因的导入方法主要有五种：1.1.显微注射法显微注射法它借助显微操作仪，把它借助显微操作仪，把DNADNA分子直接注入到受精分子直接注入到受精卵的原核中，通过胚胎卵的原核中，通过胚胎DNADNA在复制或修复过程中造成在复制或修复过程中造成的缺口，把外源的缺口，把外源DNADNA整合到胚胎基因组中。它是哺乳整合到胚胎基因组中。它是哺乳动物最常见的转基因方法，效果稳定，导入时不受动物最常见的转基因方法，效果稳定，导入时不受DNADNA分子量的限制。但是，这种方法操作复杂，转基分子量的限制。但是，这种方法操作复杂，转基因效率低。因效率低。优缺点：优缺点：1.1.可靠性高、重复性好可靠性高、重复性好2.2.对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高3.3.导入导入DNADNA片段的大小和类型不受限制片段的大小和类型不受限制4.4.转基因在代与代之间传递的稳定性好转基因在代与代之间传递的稳定性好5.5.整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响6.6.可能会出现不希望的插入突变可能会出现不希望的插入突变7.7.开发装置和技术的花费大时间长开发装置和技术的花费大时间长 2.2.反转录病毒感染体反转录病毒感染体反转录病毒是双链反转录病毒是双链RNARNA病毒，它侵染细胞后可通病毒，它侵染细胞后可通过自身的反转录酶以过自身的反转录酶以RNARNA为模板在寄主细胞染色体为模板在寄主细胞染色体中反转录成中反转录成DNADNA。在利用病毒载体转基因时，首先在利用病毒载体转基因时，首先要对病毒基因组进行改造，将外源基因插入到病毒要对病毒基因组进行改造，将外源基因插入到病毒基因组致病区，然后用此病毒感染胚胎细胞，即可基因组致病区，然后用此病毒感染胚胎细胞，即可对胚胎细胞进行遗传转化。如果在第一次卵裂之前对胚胎细胞进行遗传转化。如果在第一次卵裂之前外源外源DNADNA整合到胚胎基因组中，可获得转基因动物，整合到胚胎基因组中，可获得转基因动物，在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，其第二代在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，其第二代可能出现转基因动物。可能出现转基因动物。3.3.胚胎干细胞法胚胎干细胞法 这种方法首先是用外源基因转化胚胎干细胞，这种方法首先是用外源基因转化胚胎干细胞，通过筛选，把阳性细胞注入受体动物的囊胚中，生通过筛选，把阳性细胞注入受体动物的囊胚中，生产嵌合体动物，当胚胎干细胞分化为生殖干细胞时产嵌合体动物，当胚胎干细胞分化为生殖干细胞时外源基因可通过生殖细胞遗传给后代，在第二代获外源基因可通过生殖细胞遗传给后代，在第二代获得转基因动物。这种方法可对阳性细胞进行选择，得转基因动物。这种方法可对阳性细胞进行选择，实现外源实现外源DNADNA的定点整合。缺点是第一代是嵌合体，的定点整合。缺点是第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长。获得转基因动物的周期较长。Pigmented strain:色素种Albino strain:白化种Chimeric mouse from one tan(褐色)and one black mouse embryo.4.4.精子载体法精子载体法它是利用哺乳动物的获能精子能结合外源它是利用哺乳动物的获能精子能结合外源DNADNA的特性，通过受精过程把外源的特性，通过受精过程把外源DNADNA导入受精卵，导入受精卵，获得转基因动物。它的优点是方法简单，转基因获得转基因动物。它的优点是方法简单，转基因效率高。缺点是效果不稳定，外源效率高。缺点是效果不稳定，外源DNADNA分子可能会分子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能。受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能。Clam egg:蛤卵（三）外源整合、转录及表达的分子检测（三）外源整合、转录及表达的分子检测 1.1.外源基因的整合检测外源基因的整合检测 它是检测动物基因组中是否携带外源它是检测动物基因组中是否携带外源DNADNA。常常用的方法是由用目标基因的一段序列作引物，用用的方法是由用目标基因的一段序列作引物，用聚合酶链式反应仪（聚合酶链式反应仪（PCRPCR仪），扩增目标仪），扩增目标DNADNA，再再通过电泳初步检测是否含有目标基因。然后，用通过电泳初步检测是否含有目标基因。然后，用SouthernSouthern杂交检测杂交检测PCRPCR阳性个体是否含有目标基因，阳性个体是否含有目标基因，如果出现阳性，就可以断定为转基因阳性动物。如果出现阳性，就可以断定为转基因阳性动物。SA-5 LoxpBSA-5 LoxpBPCR法鉴定转基因的存在BrainHeartLungLiverSpleenKidneyStomachMuscleThymusTestisMOazinLacZG3PDH（细胞水平）（组织水平）SA-5 LoxpBprobeSouthern BlottingSouthern Blotting法证明转基因的存在法证明转基因的存在 2.2.外源基因的转录检测外源基因的转录检测 它是用它是用NorthernNorthern杂交法对转基因动物某一杂交法对转基因动物某一组织的组织的mRNAmRNA进行分析检测，出现阳性表明外源进行分析检测，出现阳性表明外源基因具有转录活性。基因具有转录活性。-geo gene probeG3PDH转基因Northern Blotting Northern Blotting 法证明转基因的法证明转基因的mRNAmRNA的存在的存在3.外源基因的表达检测它是检测转基因动物组织中是否含有目标基因编码的外源蛋白质，常用的方法有酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法。X-gal 染色法鉴定转基因的表达Testis Kidney Heart BrainE13.5E10.5GFP(GFP(GreenGreen Fluorescent Protein,Fluorescent Protein,绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白)证明转基因的表达证明转基因的表达 Heart Kidney Liver400X400X100X酶联免疫法CAT检测免疫组织化学染色抗体鉴定转基因在组织中的表达Westernblotting鉴定转基因在组织中的表达Liver Lung Skin(四四)基因动物品系或品种的建立基因动物品系或品种的建立 第一代转基因动物是半合子转基因动物（杂第一代转基因动物是半合子转基因动物（杂合子），因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合子），因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源转基因动物家系，外源DNADNA才能在后代中稳定遗传才能在后代中稳定遗传（=1:1）1:2:1-3:1:五、哺乳动物转基因技术存在的主要问题五、哺乳动物转基因技术存在的主要问题（一）效率低，成本高（一）效率低，成本高在家畜转基因研究中，显微注射后的胚胎不在家畜转基因研究中，显微注射后的胚胎不足足1%1%能发育为转基因后代，小鼠和大鼠等实验动能发育为转基因后代，小鼠和大鼠等实验动物的转基因阳性率也只有物的转基因阳性率也只有3%3%左右，而且转基因阳左右，而且转基因阳性动物中仅性动物中仅50%50%左右能表达外源基因。左右能表达外源基因。（二）外源基因的随机整合和异常表达（二）外源基因的随机整合和异常表达 人们对外源人们对外源DNADNA整合机理的研究发现外源整合机理的研究发现外源DNADNA是随机整合到胚胎基因组中。由于外源是随机整合到胚胎基因组中。由于外源DNADNA自身的自身的重排、突变或受到整合位点附近基因的影响，常重排、突变或受到整合位点附近基因的影响，常出现异位和异时表达或者表达水平低，有的甚至出现异位和异时表达或者表达水平低，有的甚至不表达。有的外源不表达。有的外源DNADNA整合到胚胎的功能基因中，整合到胚胎的功能基因中，影响胚胎发育或导致遗传缺陷。这些问题的出现影响胚胎发育或导致遗传缺陷。这些问题的出现给转基因技术的发展带来了很大障碍。给转基因技术的发展带来了很大障碍。此外，外源此外，外源DNADNA能否稳定遗传也是转基因技术能否稳定遗传也是转基因技术面临的严重问题。面临的严重问题。五五 基因敲除小鼠的制作基因敲除小鼠的制作1 1 传统的基因敲除小鼠的制作传统的基因敲除小鼠的制作目的基因的准备阳性细胞的筛选Injection of ES cells into blastocysts要敲除的基因外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。定点准切地敲除某基因优点：优点：缺点：缺点：ES细胞系建立及培养困难（花费大）维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体（耗时间）只能产生一种基因敲除动物不一定获得有意义的表型 目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。ENUENU诱变小鼠诱变小鼠ENU致突变技术是高通量大规模筛选新基因及发育突变技术的化学方法：当人们还不能获得ES细胞时，小鼠遗传学家最常用的方法是用乙烷基亚硝基脲（ENU)处理公鼠（ENU为一种致癌剂及生殖细胞致突变剂），然后在后代中筛选显性或隐性突变的小鼠。随着越来越多的基因和微卫星标记被定位，突变基因的定位也随之变得容易；因此对小鼠进行化学诱变将越来越变得低成本而高效益。（一）、（一）、ENU诱变的技术路线诱变的技术路线 1）.ENU诱变的简单流程 ENU处理雄性C57BL/6小鼠，10周后与同品系母鼠配种，Fl离乳时筛查，阳性突变小鼠留种，与同品系正常母鼠配种，Fl有亲代突变表型者留种(为显性遗传)，基因定位、培育新的模型、基因克隆、基因功能研究。隐性突变筛选需由Fl互交或F2回交Fl，发现突变表型者留种，进行进一步的研究。2）显性突变的筛选 10周龄的雄性小鼠按150mg/kg体重的剂量腹腔注射ENU，60天后待处理公鼠恢复生殖能力后与野生型雌性配种，通过对F1代小鼠进行形态学、行为学、血液学、生理生化等指标的检测，可筛选基因的显性突变。3）隐性突变的筛选 基因隐性突变的筛选需将F1代的雄性鼠与野生型雌性小鼠交配，再将F1代雌性小鼠与F1代雄性鼠回交或F2代雌、雄鼠交配，获得F3代小鼠，并将F3代小鼠用于大规模筛选。）ENU突变表型筛选 ENU诱导突变表型的筛选包括形态异常表型、行为和神经功能异常、血液学和临床生化指标和老年症状筛选等。形态异常表型的筛选通常在小鼠分窝时进行。行为和神经功能异常筛选包括肌肉缺陷和运动神经元低下、感官缺陷、精神、小脑平衡、自律行为方面的缺陷等。ENU诱变的最终目的是为了鉴定导致表型的突变基因，发现新的基因和新的代谢途径，促进人类对哺乳类动物基因功能的了解。位置候选基因法是鉴定突变基因的首选方法：用50只突变回交小鼠做连锁分析。突变大致可定位在1020cM的范围内。分析500只回交小鼠可将突变定位在1cM的范围内。基因驱动法与表型驱动法相结合的ENU诱变筛选的小鼠，其突变已被定位在特定的染色体组区域内，因而不用再作连锁分析。（二）、（二）、ENU诱导点突变的鉴定诱导点突变的鉴定 在突变基因被精确地定位后，结合突变小鼠的表型进行候选基因的预测。候选基因的线索可从多方面的分析获得。比如小鼠表型是否与某种已知突变基因的人类疾病相似；小鼠的表型与候选范围内某些基因的表达模式具有相关性；候选范围内某些基因的功能与小鼠表型可能相关等。小鼠基因组已定位近7000多个微卫星，使得染色体上大约每0.35cM便有一个标记。可以根据已知微卫星的位置定位突变基因，相信随着技术的进步，稳定的高通量基因型鉴定方法将会极大地发展。优点缺点ENU诱变可以在短时间内产生大量的突变体小鼠突变性状容易得到点突变的鉴定依然是费时费力的工作转基因动物、基因定点突变动物都是有计划、有目的地研究已知基因的表达、功能及互作效应，而ENU诱变小鼠出发点不是任何特定的基因，而是从大量的随机突变中筛选感兴趣的表型，或获得与人类疾病临床症状相似的模型动物，再利用此模型动物进行定位、克隆，鉴定新的基因。在此基础上，还可以再通过转基因技术和基因敲除技术来验证该基因的功能、作用以及在个体发育中的表达，从而揭开模型性状的形成机制。-geopApSP73Lox71LoxPLox2272Lox511SAConstruction of trap vector-geo:show blue color and anti-Neo for screening PolyA:stop signalpSP73:plasmid vectorLox sites:DNA fragments can exchange-geo report gene-geo 3 Gene trapping(3 Gene trapping(基因捕获基因捕获)变异小鼠变异小鼠Gene TrappingTrapping vectorSplicing acceptor-geopAReport geneES cellpromoterIntegration of trapping vector into endogenous genepromoterTranscription productCCCCCAAAAAAAA5RACEcDNA clonePlasmid rescueCharacterization of the gene which containing the trapping vector NeoPApSP-73SA+/+-/-X-gal stainingPhenotype analysisTT2 ES cellsG418 selectionelectroporationPositive coloniesGene searching5RACE,single copy,Deletion analysisThe process of this experimentQuestions and methods1:Which gene is trapped?-5RACE2:Where does the trapping vector locate in this gene?-5plasmid rescue,3plasmid rescue,PCR3:Does the trapping vector integrate other locus of the genome?(single copy?)-Southern blot4:Does the vector make a large deletion of the genome when it integrate with the gene?-sequence,PCR5:Does this gene be knock out?-Northern blot,RT-PCR6:What is the phenotype?-Mice mating,prepare homozygous mice,section,HE staining and immunostaining5RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)AAAAAAAAAAcccccZ1 Z2First PCR:UAP/Z2 primerAAAAAcccccUAP AUAPZ1 Z2Second PCR:AUAP/Z1 primerAUAPZ2SequenceZ1 Z21234GGGGGadd tail1 4042722 4276297 35542819 43075359 49147378 47511 60391 60539460 60864 323323 4595RACE EST sequenceTrapping vectorPositive recombined ES colony selection by PCRE n 2S Ap p S S P P-7 7 3 3SA-5Sp6 ForPCR primers:SA-5,Sp6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 P MCM1:HindIII2:SphI3:XhoI4:SalI5:XbaI6:BamHI7:SacISelection of suitable restriction enzyme for 5plasmid rescueE n 2S AEn23aSA-5Sp6 For RevHindIII SphIHindIII SphI XhoI SacI BamHI XbaI SalICMprobeBamHIXbaIXhoISacI +/+/-/-+/+/-/-The transcriptions of AZI RNA being suppressed in homozygous micegene probeG3PDH28S18S1:alive2:dead 3:alive1 2 3Newborn stage Mutant mice have normal morphology but die at newborn stageE13.5 2 10 2 14Newborn 6 2 2(2D)10(2004.3.11)2weeks 10 12 2 243weeks 11 23 0 34 2 4 1 7 11 20 0 31(2003.8.5)13 15 0 28(2003.12.24)5 13 1 19(2004.2.25)Newborn dead 0 8 6 14(update)Stage Wild Hetero Homo total E20 mice liver HE staining+/+-/-4x40 xAlive mice liver HE staining20 x40 x+/+-/-三种分析基因功能方法的比较三种分析基因功能方法的比较 类型制作变异动物所需时间变异个体表现型的获得变异基因的克隆定位变异基因是否为已知鉴定基因的表达方式理化诱变短获得率高复杂不容易均可不容易基因定点敲出长不确定复杂不容易必须为已知不容易基因捕获短获得率较高容易均可很容易Differential effects of an erythropoietin receptor gene disruption on primitive and definitive erythropoiesis Analysis of erythropoiesis in EpoR-/-and wild-type embryos.(A)Litter of embryos at E9.5,in which the two homozygous mutant embryos(arrows)appear normal.(D,G)A mutant E11.5 embryo left)and a wild-type littermate(right)before(D)and after(G)removal of the yolk sacs,showinga greatly reduced number of circulating red blood cells in the mutant.Chyuan-Sheng Lin,et al.,GENES&DEVELOPMENT,1996.10:154-164基因敲除小鼠在研究基因功能的应用Inactivation of erythropoietin leads to defects in cardiac morphogenesisHong Wu,Development.126,3597-3605(1999)Lack of EPO or EPOR affects heart development.(A)External appearance of the wild-type(+/+)and the EPOR null mutant(-/-)embryos at E14.0.Homozygous mutant embryo appears pale with no visible liver(position indicated by arrow in wild type),and edema in the pericardial space(arrowhead).(B)Heart development at different gestation stages.Hearts from wild-type andmutant embryos were dissected and photographed at E11.5(left panel),E12.5(middle panel)and E13.5(right panel),respectively.Morphological differences between the wild-type and mutant hearts are evident at E12.5 and become obvious at E13.5.The wild-type hearts show clear interventricular sulcus(arrows)which is almostabsent in mutant hearts(E12.5-13.5).(C)Histological analysis of wild-type(+/+)and EPOR null mutant(-/-)embryos at E12.5.T,trabeculae;arrows,compact layer;and S,ventricular septum转基因动物在医药行业中转基因动物在医药行业中的应用的应用人类疾病造模药物产品的生产异种移植人类疾病造模动物模型对疾病产生机理和治疗是必不可少的工具利用转基因动物可以创造出多种动物模型转基因动物用于发病机理研究的例子：Alzheimers disease(AD)阿尔茨海默病(早老性痴呆)对AD患者死亡后脑部解剖发现脑部存积了一种淀粉状蛋白的蛋白质将人类淀粉状蛋白的基因转到大鼠体内使其发病，再清除淀粉状蛋白，发现确实能够减慢甚至停止病情。(1991)Science 253,323325(2004)Mol.Psychiatry 9,664683动脉粥样硬化动脉粥样硬化(Atherosclerosis，属于综合性病变，属于综合性病变)多种与脂代谢有关的基因多种与脂代谢有关的基因(Miller&Rubin,1997;Brousseau&Hoeg,1999)Cell death(apoptosis)该项技术已经确认了至少该项技术已经确认了至少25个基因个基因(Ranger et al,2001)Cancer Mammary tumors C-myc,erbB2,cyclin D1 Seigel et al,2000;Yu et al,2001 Neu,ras,or Wnt 1-Akt-Schwertfeger et al,2001 Lung cancer K-ras:Johnson et al,2001炎症性疾病炎症性疾病-肺炎肺炎药物产品的生产2005 DDT 10,757-767 Traditional pharmacopoeia (传统药典传统药典)crude plant extracts Chemical synthesisProtein pharmaceuticals(蛋白药物蛋白药物)extracted proteins from human or animal organs advantage:native state and quite active，drawbacks:产量低，产量低，contamination(virus,prions)例如例如:Insulin-pig pancreasGrowth HormoneCoagulation factors(凝血因子凝血因子)AntibodiesBSA 现代药物生产现代药物生产 Recombination proteinsGenetic engineering 1：用细菌或酵母生产：用细菌或酵母生产 Genetically modified bacteria or yeast 优点：纯度较高，活性接近自然；优点：纯度较高，活性接近自然；缺点：部分蛋白不能合成、纯化困难、不能糖基缺点：部分蛋白不能合成、纯化困难、不能糖基化、不化、不 能翻译后加工能翻译后加工 例如例如:Human insulin,human GH 2：用动物细胞生产：用动物细胞生产 Genetically modified animal cells 优点：质量好，自然活性优点：质量好，自然活性 缺点：产量低，缺点：产量低，10 kg/年年)例如例如:Hybridomas(mAb，产量高，产量高);CHO(Human FSH;EPO)3：用转基因动物生产：用转基因动物生产 Transgenic animals 优点：质量好，产量高；优点：质量好，产量高；缺点：技术难度大，风险高缺点：技术难度大，风险高 转基因动物的血液（转基因动物的血液（Blood）或乳液（）或乳液（milk）动物乳腺生物反应器 乳腺生物反应器的研制，就是通过基因转移技术，将外源基因导入动物体内，通过乳腺特异启动子的控制，获得乳腺生产外源蛋白质的转基因动物。Gordon et al,1987,Nature Biotechnology,human tPA/mouse milk乳腺产品的优越性1.产物多样：多肽到大分子蛋白分泌性蛋白到内膜蛋白多聚体（二价抗体、三价 纤维蛋白原）2.质量好（糖基化、磷酸化、天然折叠等）3.安全，不会引起抗药性4.产量高5.纯化简单6.成本低动物种类的选择动物种类的选择血液蛋白质用动物乳腺生产产品举例产品类别产品类别举例举例产品开发公司产品开发公司抗体抗体BR 96GenzymePPL Therapeutics药物药物疫苗疫苗组织修复物组织修复物营养药营养药InterferonCalcitoninGrowth HormoneInsulinProteinase InhibitorSoluble CD4TPAMalariaCollagen乳白蛋白胆盐刺激性脂酶岩藻糖转移酶 乳铁蛋白溶菌酶GenzymeGenzyme GenzymeGenzyme GenzymeGenzyme GenzymeGenzymeCollagen CorpAbbott labAstra Hassle ABPPLPharmingPharming异种移植猪的脏器移植给人，会