(6)--《兽医产科学》第6章教学课件.ppt

第六章第六章 辅助繁殖技术辅助繁殖技术Assisted reproduction technology第一节第一节 人人工授工授精技术精技术第二节第二节 胚胎移植技术胚胎移植技术第三节第三节 胚胎及卵母细胞冷冻保存胚胎及卵母细胞冷冻保存第五节第五节 细胞核移植与克隆技术细胞核移植与克隆技术第四节第四节 胚胎分割与融合技术胚胎分割与融合技术目目 录录第九节第九节 猫和犬的节育技术猫和犬的节育技术 第十节第十节 繁殖技术与疫病控制繁殖技术与疫病控制 第八节第八节 转基因技术转基因技术第七节第七节 胚胎体外生产技术胚胎体外生产技术第六节第六节 性别控制技术性别控制技术目目 录录一一 人工授精技术的意义人工授精技术的意义二二 鲜精人工授精鲜精人工授精三三 冻冻精人工授精精人工授精技术技术四四 影响影响人工授精效果的因素人工授精效果的因素第一节第一节第一节第一节 人工授精人工授精人工授精人工授精第一节第一节 人工授精技术人工授精技术一、人工授精技术的意义一、人工授精技术的意义(一一)充分利用优良公畜的繁殖潜能充分利用优良公畜的繁殖潜能从一头公牛一年可采得1 500 000106精子，按每头母牛每次输精剂量为15106精子，受胎率为50%计算，可以得到50 000头后代，如果采用鲜精人工授精，可配母羊300500头；如果采用冷冻精液技术，公羊可以全年采精，其冷冻精液可供2 000头以上母羊输精。种公畜利用率的提高，不但可以充分利用公畜的遗传价值，还可减少种畜饲养量，降低生产成本。第一节第一节第一节第一节 人工授精人工授精人工授精人工授精4(二二)加速家畜品种改良加速家畜品种改良4 通过对公畜进行选择可以使优良遗传基因的作用迅速扩大，加快品种改良速度。此外，采用人工授精技术可以提供完整的配种记录、保证配种计划的实施。4(三三)控制某些疾病的传播控制某些疾病的传播4 采用人工输精技术可以减少和防止因本交引起的生殖系统传染性疾病，如布鲁氏杆菌病、毛滴虫病、胎儿弧菌病、传染性流产、马媾疫等的传播。一、人工授精技术一、人工授精技术一、人工授精技术一、人工授精技术一、人工授精技术的意义一、人工授精技术的意义4(四四)提高母畜的受胎率提高母畜的受胎率4通疾病；可以克服因公、母畜体格相差太大或因生殖道异常造成交配困难过发情鉴定可以掌握合适的配种时机并及时发现及治疗某些生殖引起的不孕。4(五五)不受时间和地域限制使用精液不受时间和地域限制使用精液4优良公畜的精液可以长期冷冻保存，而且便于运输，因此可以在任何时间(即使在公畜死后)、任何地点选用某头公畜的精液输精。4一、人工受精的概述一、人工受精的概述一、人工受精的概述一、人工受精的概述一、人工授精技术的意义一、人工授精技术的意义(六六)促进其它繁殖技术的发展促进其它繁殖技术的发展 人工授精技术的发展为其它繁殖技术，如同期发情、胚胎移植、性别控制、基因导入等提供了必要的技术保证。一、人工受精的概述一、人工受精的概述一、人工受精的概述一、人工受精的概述一、人工授精技术的意义一、人工授精技术的意义二、鲜精人工授精二、鲜精人工授精 (一一)公畜的管理和采精公畜的管理和采精41.公畜的管理4 使公畜保持中等能量饲养水平对精子活率、采精量及精子对冷冻的抵抗力均有一定益处。长期饲喂能量过高的饲料可导致公畜肥胖、反应迟钝、繁殖能力下降；能量过低则会使初情期延迟，睾丸和附睾变小，精子产量下降。增加蛋白质饲料的比例、补饲维生素A并适当进行运动可改善精子发生并增加精子的抗冻能力。(二二)采集技术采集技术二、采精二、采精二、采精二、采精2.1 采精前准备2.2 公畜采精调教法2.3采精须知2.4 采精频率42.1 采精前准备场地：采精室要求宽畅、明亮、地面平整，安静，清洁，设有采精架、台畜、假台畜和精液操作室等必要设施二、采精二、采精二、采精二、采精台畜台畜1 1、健康、温、健康、温顺、卫生顺、卫生2 2、设计合、设计合理、方便理、方便假阴道：假阴道：公畜性欲公畜性欲体况适中体况适中定期检疫定期检疫定期清洗定期清洗饲料全价饲料全价适当运动适当运动二、采精二、采精二、采精二、采精（2.2）公畜采精调教法公畜采精调教法外外 激激 素素 法法偷偷 梁梁 换换柱柱 法法榜榜 样样 示示 范范 法法二、采精二、采精二、采精二、采精2.3 采精须知采精须知 采精者在公畜的右后侧（站住）；马性反射慢，压力重要；牛、羊性反射快，温度重要，勿触及阴茎，可触包皮；猪性反射慢，压力为节律性收缩；兔可用羊假阴道，倒向一侧并叫一声，表示 射精。二、采精二、采精二、采精二、采精2.4 采精频率采精频率 马、牛和猪每周2-6次，鸡每3天停1天，羊在春分之前最差，秋分时可达714次/周。牛：每周牛：每周牛：每周牛：每周2 2 2 2天采精，当日采天采精，当日采天采精，当日采天采精，当日采2 2 2 2次次次次 猪：隔日一次，最好猪：隔日一次，最好猪：隔日一次，最好猪：隔日一次，最好3 3 3 3天一次天一次天一次天一次 羊：每周羊：每周羊：每周羊：每周3 3 3 3天，当日采天，当日采天，当日采天，当日采2 2 2 2次。次。次。次。犬：隔日一犬：隔日一犬：隔日一犬：隔日一次次次次 主要根据精液品质与公畜的性机能状况而定。二、采精二、采精二、采精二、采精 在人工授精技术中，我们要采集公畜的精液，并在体外进行一系列的处理。那么精液的质量必然要受到公畜本身的生精能力、健康状况，以及采集方法、处理方法的影响。因此，检查精液品质是人工授精技术中一个非常重要的技术环节。（三）精液三）精液品质检查品质检查第一节第一节第一节第一节 人工授精人工授精人工授精人工授精（一）重要性（一）重要性（二）精液品质检查项目（二）精液品质检查项目（三）精液品质检查方法（三）精液品质检查方法第一节第一节第一节第一节 人工授精人工授精人工授精人工授精（三）精液（三）精液品质检查品质检查 （一）重要性一）重要性 1.检查种公畜的配种能力 2.公畜的饲养水平和性机能 3.确定精液可稀释的倍数 4.检查精液的处理方法是否正确 5.检查精液产品的质量 6.反映技术操作水平三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查（二）精液品质检查的项目（二）精液品质检查的项目1.1.直观直观项目项目 2.2.微观微观项目项目三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查1.1.直观检查项目直观检查项目1.1 1.1 射精射精量量1.2 1.2 色泽色泽1.3 1.3 云雾状云雾状三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查A A 射精量的测定方法射精量的测定方法B B 射射精量不正常的原因精量不正常的原因1.1 1.1 射精量射精量三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查 A A 射精量的测定方法射精量的测定方法概念:射精量是指每次射精的体积测定:以连续3次以上正常采集到的精液的平均 值代表测定方法:可用体积测量容器如刻度试管或量筒,也可 用电子秤称重近似代表体积三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查B B 射精量不正常的原因射精量不正常的原因现象原因过少采精过频、性机能衰退、睾丸炎、发育不良过多副性腺发炎、假阴道漏水、尿潴留、采精操作不熟练三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查1.2 1.2 色色 泽泽正常精液特征依从浓到稀：乳黄-乳白-白色-灰白淡红（鲜红）生殖道下段出血或龟头出血淡红（暗红）副性腺或生殖道出血绿副性腺或尿生殖道化脓褐混有尿液三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查1.3 1.3 云雾状分级标准云雾状分级标准+翻明显而且较快+翻明显但较慢+仔细看才能看到精液的移动-无精液移动三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查2.2.微观检查项目微观检查项目2.1 精子活力估测2.2 密度测定:计数板计数、比色计测定2.3 畸形率：形态畸形率、顶体畸形率三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查2.1 2.1 活力的估测活力的估测A 概念:37下,精液中前进运动精子占总精子数的百分率B 主要测定方法:估测法三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查活力测定时精液的稀释用品活力测定时精液的稀释用品例：牛精子活力检查的程序例：牛精子活力检查的程序载玻片预温载玻片预温精液稀释精液稀释取样检查取样检查镜检镜检活力估测活力估测活力记录活力记录将恒温加热将恒温加热板放在载物板放在载物台上，打开台上，打开电源并调整电源并调整控制温度至控制温度至3737，然后，然后放在载玻片放在载玻片 将生理盐将生理盐水与精液水与精液等温后，等温后，按按1:101:10稀稀释释 取取10ul10ul精液于预温后载玻片中，盖上盖玻片精液于预温后载玻片中，盖上盖玻片 用用100100倍和倍和400400倍观察倍观察 判断视野中判断视野中前进运动精前进运动精子占的百分子占的百分率率 按按1010级制级制评分和记评分和记录录 三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查2.2 2.2 密度测定密度测定A A 密度的概念及表示方法密度的概念及表示方法4单位体积精液中所含的精子数4表示方法:个/ml 或亿/ml,也可以用个/ul表示B B 各种家畜精液的精子密度各种家畜精液的精子密度 畜种牛羊猪鸡密度亿/ml8-1220-302-330-50三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查C C 精子密度的测定方法精子密度的测定方法a.精子密度计数板(器)简介b.精液的稀释c.精液注入计数室d.精子计数e.精子密度计算三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查a a 精子密度计数精子密度计数1精子计数室长宽各1mm,面积1mm2高度0.1mm,体积0.1mm32由双线或三线组成25个(5X5)中方格3每个中方格内有16个小方格(4X4)4共计400个小方格三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查精子计数室及一个中方格精子计数室及一个中方格三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查a)将精液注入计数室前必须对精液进行稀释,以便于计数b)稀释的比例根据动物精液的密度范围确定c)稀释方法:用5-25ul移液器和100-1000 ul移液器,在小试管中进行组合不同的稀释.如牛精液稀释100倍,为5ul原精+500ul稀释液d)稀释液:3%氯化钠溶液,用以杀死精子,便于计数三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查b b、精液的稀释、精液的稀释注入注入计数室前各种家畜精液建议稀释比例室前各种家畜精液建议稀释比例畜种牛羊猪马鸡稀释倍数10020040404003%氯化钠ul原精液 ul500510005200-55200-5520005b b、精液的稀释、精液的稀释三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查c c、精液注入计数室、精液注入计数室a)将洁净的计数板放在载物台上固定好,盖上干净的盖玻片b)取25ul稀释后的精液,将吸咀放于盖玻片与计数板的接缝处c)缓慢注入精液,使精液依靠毛细作用吸入计数室三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查注意：让稀释后的精液通过毛细作用自行吸入！用吸管稀释后精用吸管稀释后精液注入计数室液注入计数室共有两个对称的计数室用移液器注入精液b b、精液的稀释、精液的稀释三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查d d、精子计数、精子计数a)将计数板固定在显微镜的推进器内，用100倍放大找到计数室，再用400倍找到计数室的第一个中方格。b)计数左上角至右下角五个中方格的总精子数，以精子的头部为准，依数上不数下，数左不数右的原则进行计数格线上的精子。三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查进行精子计数进行精子计数的中方格数可的中方格数可以是四角一中以是四角一中心共心共5个中方格个中方格也可也可以是以是从左从左角到角到右下右下角五角五个中个中方格方格以图示次序以图示次序计数，精子计数，精子的头部为准，的头部为准，依数上不数依数上不数下，数左不下，数左不数右的原则数右的原则进行计数格进行计数格线上的精子。线上的精子。白色精子不白色精子不计数计数三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查精子密度=5个中方格总精子5101000 稀释倍数e e、计算计算精子密度精子密度三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查例：牛精子密度测定程序例：牛精子密度测定程序例：牛精子密度测定程序例：牛精子密度测定程序放计数板于载物台上取样稀释精液精液注入计数室镜检精子计数密度计算计数板和盖玻片一定要清洁取500ul3%氯化钠于小试管中,加入5ul原精液,混合均匀。取25ul精液加入计数板与盖玻片的接缝中用100倍和400倍计数五个中方格的总精子数,计数以头部为准,精子密度=5个中方格总精子数5101000100将载玻片放在400或600倍的显微镜下进行观察，共记录若干个视野100-200个左右的精子。正常精子的结构模式图正常精子的结构模式图畸形率畸形率畸形率畸形率=畸形精子数畸形精子数畸形精子数畸形精子数/总精子数总精子数总精子数总精子数2.3 2.3 畸形率畸形率三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查畸形精子畸形精子三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查三、精液品质检查正常精子正常精子2.3 2.3 畸形率畸形率视野中的畸形精子视野中的畸形精子四、精液的稀释四、精液的稀释第一节第一节第一节第一节 人工授精人工授精人工授精人工授精（1 1）精液稀释的目的）精液稀释的目的 （2 2）精液稀释液的成分及作用）精液稀释液的成分及作用 （3 3）稀释液的配制方法）稀释液的配制方法（4 4）稀释倍数和稀释方法）稀释倍数和稀释方法 精液稀释是向精液中加入适宜于精子存活的稀释液。其目的有两个：1.扩大精液容量，从而增加输精头数，提高公畜利用率。2.延长精子的保存时间及受精能力，便于精液的运输，使精液得以充分利用。四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释（1 1）精液的稀释）精液的稀释目的目的（2 2）精液稀释液的成分及作用）精液稀释液的成分及作用 1营养物质 2保护性物质 1)缓冲剂：柠檬酸盐，磷酸盐2)防冷抗冻物质：卵黄，甘油 3)抗菌物质：短期保存，青霉素，链霉素；长期，庆大霉素，先锋，头孢3.稀释剂：氯化钠4.其它添加剂 1)酶类 2)激素类 3)维生素类：VB12，VB6，VE 4)有机酸、二氧化碳等四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释（3 3）稀释液的配制方法）稀释液的配制方法1.用品的清洗与消毒2.药品的称量、水的量取3.基础液的配制：溶解过滤消毒（水浴或直接加热）放凉4.稀释液的配制：基础液按比例加入抗生素、卵黄 液：按比例加入卵黄和抗生素的稀释液 液：按比例加入抗冻剂四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释（4 4）稀释倍数和稀释方法）稀释倍数和稀释方法 四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释1稀释倍数确定 2.普通稀释倍数的计算3.冷冻精液稀释倍数的计算 4稀释方法 5.冷冻精液稀释1 1稀释倍数确定稀释倍数确定 精液适宜稀释倍数与家畜种类和稀释液种类有关。确定稀释倍数应根据原精液的质量，尤其是精子的活率和密度、每次输精所需的精子数、稀释液的种类和保存方法。一般牛4-6倍，猪1-3倍，兔3-5倍，鸡5-10倍。四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释 正正确的表示方法：确的表示方法：N倍稀释：即1份精液:N份稀释液1:N稀释：意思同上 实实际应用表示方法际应用表示方法：稀释后体积是原精液体积的多少倍。因此所谓的N倍稀释，实际上是1:(N-1)，但这种方法有利于进行相关计算。如N倍稀释后，精子密度为原来的1/N，体积为原精液体积的N倍，可分装的份数为：原原精液体积精液体积稀释倍数稀释倍数/每份精液体积每份精液体积四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释1 1稀释倍数确定稀释倍数确定 2.2.普通稀释倍数的计算普通稀释倍数的计算稀释倍数=原精液精子密度原精液活力稀释后每份精液的体积/稀释后每份精液中所含的有效精子数四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释3.3.冷冻精液稀释倍数的计算冷冻精液稀释倍数的计算四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释4 4稀释方法稀释方法 1）精液经检查合格后应立即进行稀释，越快越好。2）稀释时，稀释液的温度和精液的温度必须调整一致，以30-35为宜。3）稀释时，将稀释液沿精液瓶或插入的灭菌玻璃棒缓慢 倒入，防止剧烈震荡。4）若作高倍稀释，应先低倍后高倍，分次进行稀释。5）稀释后立即镜检，活力应和稀释前一样。6）稀释后精液立即进行分装（一般按一头母畜的输精量）保存。四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释 5.5.冷冻精液稀释冷冻精液稀释第第一次稀释倍数的计算：一次稀释倍数的计算：应为最终稀释后体积的50%。第第二次稀释为二次稀释为1:11:1稀释稀释意义：意义：总稀释倍数受总有效精子密度的影响，第二次稀 释时，稀释液中含有防冻剂，而防冻剂应在稀释 后在精液中含有固定的浓度。最后一次稀释时，1:1稀释，可以保证稀释后防冻剂的浓度为液的 1半。这样无论总稀释倍数是多少，最终精液中含 的防冻剂浓度是不变的。四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释四、精液的稀释五五、冻精人工授精技术冻精人工授精技术第一节第一节第一节第一节 人工授精人工授精人工授精人工授精(一一)精液冷冻技术精液冷冻技术(二二)冷冻精液的保存冷冻精液的保存(三三)冷冻精液的解冻和输精冷冻精液的解冻和输精(一一)精液冷冻技术精液冷冻技术1.1.1.1.精液冷精液冷精液冷精液冷冻冻冻冻的原理的原理的原理的原理 水在逐渐降温的过程中将形成冰晶，但如果以很快的速度(5 000/s)降温至-130以下，则可以跨越结晶过程而呈现一种非结晶固态，即玻璃态。目前冷冻精液的速度一般都比较快，但仍不足以直接形成玻璃态，而可能出现冰晶。大的晶体会对生物细胞造成物理伤害，因此冷冻精液成败的关键是控制降温速度，使可能出现的晶核形成很小的微晶而避免大晶体的出现。(一一)精液冷冻技术精液冷冻技术 精液成分十分复杂，冰晶形成还可能导致盐溶液浓缩、脱水、蛋白质变性和细胞膜损伤。可能发生强烈结晶过程的温度区域称为危险温区，冷冻精液的危险温区大约是0-60，最显著的有害温区是-15-25。加入冷冻保护剂的主要目的就是减缓水的结晶过程，缩小危险温区的范围。各种家畜精子对温度变化的反应是不同的，因此采用的冷冻稀释液和降温程序应有区别，只要能有效地避免冰晶出现和精子脱水，迅速将精液冷冻至-130以下即可投入液氮(-196)中长期保存。2.2.2.2.冷冷冷冷冻冻冻冻精液的稀精液的稀精液的稀精液的稀释释释释液液液液 除了供给能量、维持渗透压和抑菌的物质外，冷冻精液的稀释液中还应含有防冻保护剂和低温保护剂。常用的防冻保护剂为甘油和DMSO。糖类不但可为精子提供能量，也可作为防冻害保护剂。精液采出后，在常温下随着温度的下降，精子的活率降低，从10降至0时，如果温度下降过快，还会引起精子死亡，即所谓冷休克。为了防止冷休克的发生，在稀释液中还需加入卵黄、奶及奶制品等低温保护剂。(一一)精液冷冻技术精液冷冻技术3.3.3.3.精液的精液的精液的精液的冻冻冻冻前前前前处处处处理理理理 (1)1)精液的稀释精液的稀释 经过冷冻后的精液，其中约有半数以上的精子受冻害而死亡，因此在决定精液的稀释倍数时应根据原精液的品质和每头份冷冻精液的剂量来确定，以保证每个输精剂量都含有足够能呈直线前进运动精子。五、精液保存五、精液保存五、精液保存五、精液保存 (一一)精液冷冻技术精液冷冻技术(2)(2)冻前降温和平衡冻前降温和平衡 五、精液保存五、精液保存五、精液保存五、精液保存 (一一)精液冷冻技术精液冷冻技术4 4 为了防止冷休克对精子的不利影响，需要使精液逐渐冷却到05的速度不宜过快，一般约需1h的时间。稀释的精液在低温区(05)放置一定的时间可以改进冷冻的效果，称平衡。平衡一般是在第二次加入含甘油稀释液后进行，持续数小时，在这段时间内甘油充分渗透进入精子内，精子内在低温下重新建立离子平衡，有利于增强精子的抗冻性。4 每批冷冻的精液均应抽样检查质量，对合乎要求者进行分装，包装袋上须标明品种、畜号、生产日期、精子活率及数量等，然后浸入液氮中贮存。精液保管要有专人负责，随时检查和补充液氮罐中的液氮量，长期贮存的冻精，应定期抽样检查精液品质。每次用精液时，冻精脱离液氮的时间不得超过10s。运输时应防止震动，严禁撞击，避免液氮罐翻倒。(二二)冷冻精液的保存冷冻精液的保存(三三)冷冻精液的解冻和输精冷冻精液的解冻和输精 冷冻精液在解冻时仍然要使其快速通过危险温区，解冻温度一般为40，也可用较高的温度，但必须严格控制解冻的时间，使解冻后精液温度维持在58左右，避免精液输入母体前温度反复波动。细管和安瓿精液可直接投入处于解冻温度的水浴中，待其融化1/2时取出，完全融解后即可用于输精。颗粒精液需在解冻液中解冻，这实际上也是精液的一次再稀释过程，解冻液可事先配制并分装于安瓿中备用。六六、影响人工授精效果的因素、影响人工授精效果的因素(一一)精液品精液品质质(二二)母畜的状态和输精时间及输精次数母畜的状态和输精时间及输精次数(三三)输精技术和输入的有效精子数输精技术和输入的有效精子数(一一)精液品精液品质质 影响精液品质的主要因素是公畜的体况和遗传性能，对公畜加强管理和进行科学地饲养是保证获得优良精液的先决条件。鲜精品质的好坏与受胎率的高低有直接的关系，不同品种甚或同亦品种的不同个体之间精液抗冻能力也有差异。掌握正确的采精、稀释、降温、冷冻、保存和解冻的方法和技术是减少精子死亡和损伤、保证精液品质优良的重要环节。(二二)母畜的状母畜的状态态和和输输精精时间时间及及输输精次数精次数体况良好的适龄母畜一般发情明显，排卵正常，容易确定输精时间，也容易受胎，不易发生早期胚胎死亡。在母畜排卵前合适的时间输精可以提高受胎率。(三三)输输精技精技术术和和输输入的有效精子数入的有效精子数除马和猪应将精液直接输入子宫体外，对反刍动物也应尽可能将精液(特别是冷冻精液)输入子宫颈深部或子宫体内。每次输入的精子数直接与输精部位有关。Embryo transfer第二节第二节 胚胎移胚胎移植植一一 胚胎移植概述胚胎移植概述二二 胚胎移植的原理胚胎移植的原理三三 胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序第二节第二节第二节第二节 胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述1.胚胎移植的历史胚胎移植的历史2.胚胎移植技术的胚胎移植技术的意意义义1.1.胚胎移植的历史胚胎移植的历史一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述 1.1 初始阶段：初始阶段：1890-1900 W.Heape将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只。1.2 初级阶段：初级阶段：1900-1950 主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右。一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述 1.3 发展阶段：发展阶段：1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手术法移植成功。胚胎移植成功率达70-80%。一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述 1.4 实用化初始阶段：实用化初始阶段：1970-1980 加美开始成立牛胚胎移植公司，1973年牛冻胚移植成功（英）。一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述 1.5 实用化研究阶段：实用化研究阶段：1982大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述 2 2 胚胎移植技术的胚胎移植技术的意义意义一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述 从低产母畜得到高产后代。加速引进品种的繁殖和新品种的培育，比用现有品种进行长期杂交育种更为经济有效。加速家畜改良进度，通过超数排卵和胚胎移植技术可使供体繁殖的后代增加7-10倍。增加双胎率，加速繁殖。使不孕母畜获得生育能力，对因解剖或内分泌缺陷而不能妊娠的母畜，可以根据具体情况专门作为供体或受体，继续发挥其繁殖作用。促进基础理论方面的研究，为繁殖生理学、生物化学、遗传学、细胞学、胚胎学、免疫学、动物育种和进化等方面开辟了新的试验研究途经。满足畜牧业现代化的需要。2 2 胚胎移植技术的意义胚胎移植技术的意义一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述 挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越越来发挥出重要作用。胚胎移植技术是许多现代技术的基础：如克隆技术、试管婴儿、转基因及动物生物反应器研究。2 2 胚胎移植技术的胚胎移植技术的意义意义一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述一、胚胎移植概述 二、胚胎移植的原理二、胚胎移植的原理1.胚胎移植的生理学基础胚胎移植的生理学基础2.胚胎移植的基本原则胚胎移植的基本原则第二节第二节第二节第二节 胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植1 1 胚胎移植的生理学基础胚胎移植的生理学基础 成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十数个。早期胚胎处于游离状态。胚胎发育不存在免疫问题。胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组织上的联系。胚胎的遗传性不受受体的影响。二、胚胎移植的原理二、胚胎移植的原理二、胚胎移植的原理二、胚胎移植的原理2 2 胚胎移植的基本原则胚胎移植的基本原则 胚胎移植前后所处的环境的同一性供体和受体在分类学上的相同属性动物生理上的一致性；受体和供体在发情时间上的同期性动物解剖位置上的一致性；空间环境的一致性胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响二、胚胎移植的原理二、胚胎移植的原理二、胚胎移植的原理二、胚胎移植的原理 三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序 1.供体和受体的选择供体和受体的选择 2.供体的超数排卵供体的超数排卵 3.同期发情同期发情 4.供体母畜的配种供体母畜的配种 5.收集胚胎收集胚胎 6.移植胚胎移植胚胎第二节第二节第二节第二节 胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植1 1 供体和受体的选择供体和受体的选择 供体应具有相当高的育种价值。供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健。受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种。受体健康状况良好，已进入发情季节。供受体发情时间应接近或一致。三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序 2 2 供体的超数排卵供体的超数排卵通常用于单胎家畜，其主要目的是让优良母畜排出大量卵子，充分发挥繁殖潜能。通常采用PMSG或FSH，以促进卵泡的发育。第一次配种后静脉注射hCG或LH，可排出多数卵子。三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序 3 3 同期发情同期发情 为了胚胎移植成功，使供体受体发情同期化，让两者的生殖器官处于相同的生理阶段是必须的步骤。发情时间应该控制在12h之内。诱发同期发情的首选理想药物为PGF2及其类似物。三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序 4 4 供体母畜的配种供体母畜的配种 必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束。配种前应对种公畜的精液进行质量检查。当优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序5 5 收收集集胚胎胚胎 胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布林斯特液SOF合成输卵管液。手术法收集胚胎输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚子宫角冲胚非手术法收集胚胎二路法三路法三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序 收集到的冲洗液静置，冲洗液分离。拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中。胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别。三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序 6 6 移植胚胎移植胚胎三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序1.1.受体牛的选择标准受体牛的选择标准2.2.受体牛的饲养管理受体牛的饲养管理3.3.供体牛、受体牛的同期发情供体牛、受体牛的同期发情 4.4.发情观察发情观察5 5.器械准备器械准备6.6.移植移植前胚胎装管前胚胎装管7.7.受体牛的准备受体牛的准备8.8.移植移植6.1 6.1 受体牛的选择标准受体牛的选择标准 年龄在38岁，健康，无疾病，体格较大，膘度好。繁殖性能正常，产后60d以上，并有两次以上的正常自然发情记录。泌乳性能好，无难产史。不使用两次人工授精未孕的牛。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植6.2 6.2 受体牛的饲养管理受体牛的饲养管理 做到精心管理，合理饲养，环境清洁，饲草、饲料、饮水要新鲜，补充食盐和必要的添加剂。组成一定数量的牛群。圈舍内防止过挤，以便于发情观察。农户长期舍饲的母牛要注意加强运动。防止在移植前后因饲料及环境改变造成的应 激反应。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植6.3 6.3 供体牛、受体牛的同期发情供体牛、受体牛的同期发情 自然发情自然发情 根据受体牛的发情观察，与供体牛发情前后相差一天内的牛，可作为受体。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植 使用使用使用使用PGF2(PGF2(PGF2(PGF2(一次宫注一次宫注一次宫注一次宫注)诱发发情诱发发情诱发发情诱发发情 一般在供体牛注射PGF2前一天，给处于情期815d且直检黄体好的受体牛一次宫注PGF22mg诱发发情。两次两次PGF2PGF2处理处理 在不考虑发情周期的情况下，可间隔11d，前后两次宫注PGF2，受体牛的处理日程安排应与供体牛超排处理相吻合。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植 6.4 6.4 发情观察发情观察 原则上根据母牛接受爬跨确认发情，早、晚各观察30min发情情况。对发情牛需做直检以确认卵泡，次日上午或晚上确定是否排卵。若在发情后36h以后排卵的牛不能用作受体。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植 供体牛、受体牛的发情日差供体牛、受体牛的发情日差供体牛、受体牛的发情日差供体牛、受体牛的发情日差 移植胚胎时，如果供体和受体牛的发情周期不一致，则难以受胎。要求两者的子宫环境相一致。受体牛的发情日比供体牛早一天为+1，晚一天为-1，同日发情为0。超过2d不能用于移植。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植 按胚胎发育情况选受体牛的发情日差按胚胎发育情况选受体牛的发情日差按胚胎发育情况选受体牛的发情日差按胚胎发育情况选受体牛的发情日差 可将致密桑椹胚移植给发情6d的受体牛，将早期囊胚移植给发情7d的受体牛，将囊胚和扩大囊胚移植给发情8d的受体牛。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植 6.5 6.5 器械准备器械准备 仿西德式金属移植器，先将移植枪、枪头及金属保护外套分别用纸包扎好，高压消毒。塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。移植时，先用70%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料细管，然后剪掉封口一端，装入移植枪内，套上保护外套。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植 6.6 6.6 移植前胚胎装管移植前胚胎装管 胚胎移植时可用0.25ml细管分三段吸入PBS保存液，中间由两个气泡隔开，中段含有胚胎。也可用小气泡分成多段装管，胚胎在中段。一步细管法解冻脱甘油后，用酒精棉球多次消毒细管，剪去封口即可用于移植。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植 胚胎装管示意图胚胎装管示意图胚胎装管示意图胚胎装管示意图四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植 6.7 6.7 受体牛的准备受体牛的准备 将受体牛保定，清除粪便，肌注2%静松灵lml或用2%的普鲁卡因3ml在1、2尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉球消毒。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植 6.8 6.8 移植移植 术者用左手压开外阴，右手持移植器插入阴道。然后左手伸进直肠，移植器到达子宫颈口时，右手用力将移植枪捅破外套，插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体侧子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植冲胚冲胚四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植胚胎移植产出的犊牛胚胎移植产出的犊牛胚胎移植产出的犊牛胚胎移植产出的犊牛四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植四、牛的胚胎移植第三节第三节 胚胎及胚胎及卵母细胞卵母细胞 冷冻保存冷冻保存技术技术三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序三、胚胎移植的技术程序一、一、冷冻原理冷冻原理三、三、胚胎冷冻保存胚胎冷冻保存二、二、卵母细胞冷冻保存卵母细胞冷冻保存四、四、解冻解冻一、冷冻原理一、冷冻原理 胚胎细胞内的水分含量在80%以上，冷冻过程中，有90%的水分形成游离水而冻结成冰晶。细胞内冰晶的形成，使蛋白质结构发生不可逆转的变化，导致细胞死亡。但只要细胞内的冰晶维持在微晶状态，细胞将不会受到损害。胚胎及卵母细胞的冷冻保存实际上是一个脱水过程，冷冻保存最为关键的是设法减少因细胞内冰晶形成所引起的损伤。冰晶首先在细胞外的保存液中形成，此时冰晶与溶质分离，在盐溶液中，冰晶形成越多，未冻结部分的盐溶液浓度就越高，使细胞脱水而产生所谓的溶液效应。继续降温时，胞外冰晶形成加快，使细胞内过冷胞质与胞外逐渐浓缩的溶质之间的化学能必然出现很大差异，其结果可使胞质水分渗出并在细胞外冻结，或者使胞质水分在胞内冻结，导致胞质浓缩。如果降温速度很慢，细胞膜两侧的渗透压差和化学能差导致细胞质水分跨膜向细胞外渗透，引起细胞内进行性脱水，因此细胞内不能形成冰晶。1、卵母细胞的获得、卵母细胞的获得 （1）抽吸法：用5ml或10ml注射器配上12号或18号针头，从直径为27mm的卵泡中抽吸卵泡液，注入灭菌试管内，或直接注入检卵皿内沉淀数分钟后检卵。该方法简便、快速，缺点是易出现不完整的卵丘卵母细胞复合体(COC)及裸卵。二、二、卵母细胞冷冻保存卵母细胞冷冻保存（2）切割法用薄刀片切割卵巢，然后用洗卵液冲洗卵泡腔，回收COC。（3）剥离法剥离突出于卵巢表面的卵泡，置于卵母细胞培养液中，用针或眼科剪刺破卵泡，冲出COC。该法回收率高，但较麻烦费时，已不常用。2、卵母细胞的分级与筛选根据卵母细胞在光镜下的形态，牛的卵母细胞可分为：A级：外周有3层以上致密卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀 并充满于透明带内；B级：外周有13层卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀；C级：卵丘细胞扩散，卵母细胞胞质不均匀；D级：无卵丘细胞的裸卵，细胞质不均匀，且有暗班。3、冷冻方法卵母细胞的冷冻有