荧光定量PCR技术讲座：理论基础、引物及探针设计、体系优化、实 验方案.ppt

荧光定量荧光定量PCRPCR技术讲座技术讲座-分子生物学实验技术系列讲座分子生物学实验技术系列讲座张志坤张志坤 2021 2021、0909、1010大纲大纲一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论二、引物及二、引物及TaqmanTaqman探针的设计探针的设计三、内参基因的选择三、内参基因的选择四、反响体系的优化四、反响体系的优化五、实验方案的选择五、实验方案的选择六、误差分析及操作标准六、误差分析及操作标准七、实验中污染的防控七、实验中污染的防控八、实验结果的分析八、实验结果的分析一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR技术概论技术概论 荧光定量荧光定量PCRPCR技术产生并成熟于上世纪技术产生并成熟于上世纪9090年代，由于该技年代，由于该技术实现了术实现了PCRPCR从定性到定量的飞跃，能够对从定性到定量的飞跃，能够对PCRPCR反响的全过程进反响的全过程进行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR技术概论技术概论 荧光定量荧光定量PCRPCR技术是在技术是在PCRPCR反响体系中参加荧光基团，利用反响体系中参加荧光基团，利用荧光信号随着荧光信号随着PCRPCR反响的积累来实时监控反响的积累来实时监控PCRPCR反响的进程，并通反响的进程，并通过分析软件对过分析软件对PCRPCR的反响进行检测分析的技术。的反响进行检测分析的技术。系统组成：定量系统组成：定量PCRPCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念 扩增曲线、阈值、扩增曲线、阈值、CTCT值值1 1、扩增曲线及扩增曲线的两种形式、扩增曲线及扩增曲线的两种形式 左图反映的是随着PCR反响的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反响循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念2 2、阈值线、阈值线 在荧光定量在荧光定量PCRPCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念3 3、CTCT值值 PCR PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号到达设定的阈值时，所经过的过程中，各样品扩增产物的荧光信号到达设定的阈值时，所经过的扩增循环数。扩增循环数。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学根底的化学根底 荧光定量荧光定量PCRPCR是随着是随着PCRPCR循环的进行，以荧光信号强度的积循环的进行，以荧光信号强度的积累来实时反映累来实时反映PCRPCR反响进程的。理想的荧光物质需具备以下特反响进程的。理想的荧光物质需具备以下特点：点：1 1、本底低、本底低2 2、荧光强度高、荧光强度高3 3、每轮、每轮PCRPCR反响完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧反响完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧 光强度的增高和每轮循环后光强度的增高和每轮循环后PCRPCR产物的量成线性关系产物的量成线性关系4 4、没有、没有PCRPCR产物时，没有荧光产物时，没有荧光5 5、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种 荧光不会产生荧光的交叉干扰荧光不会产生荧光的交叉干扰一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学根底的化学根底目前常用的几种荧光物质目前常用的几种荧光物质1 1、TaqmanTaqman探针类探针类55端标记荧光基团，端标记荧光基团，33端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；用下，荧光基团产生荧光；探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着PCRPCR反响的进行，在反响的进行，在TaqTaq酶酶5-35-3外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学根底的化学根底TaqmanTaqman常用的荧光基团和淬灭基团常用的荧光基团和淬灭基团 荧光基团：荧光基团：55端常用荧光基团端常用荧光基团FAMFAM标记，最正确激发光波长：标记，最正确激发光波长：494-495nm494-495nm，最大，最大 发射光波长：发射光波长：518-520nm518-520nm。淬灭基团：淬灭基团：TAMRATAMRA、BHQBHQ、ECLIPSEECLIPSE等。等。TAMRA TAMRA本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，500500 560nm 560nm，最正确激发光波长在，最正确激发光波长在560nm560nm附近，对附近，对FAMFAM基团产生的发射光基团产生的发射光 具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，560650nm560650nm，当做，当做 多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已 不常用。不常用。BHQ BHQ和和ECLIPSEECLIPSE为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会 产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较 为常用，尤其在多重荧光定量为常用，尤其在多重荧光定量PCRPCR时常常被采用。时常常被采用。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学根底的化学根底TaqmanTaqman探针的特点及应用探针的特点及应用1 1、特异性强、准确性高、特异性强、准确性高 本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异 性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与PCRPCR产物产物 的量成正比关系，因此准确性极高。的量成正比关系，因此准确性极高。2 2、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使 用，普通的用，普通的TaqTaq酶就能满足实验的要求。酶就能满足实验的要求。3 3、常被用作基因含量的精确检测、常被用作基因含量的精确检测(精确度可达几十个拷贝精确度可达几十个拷贝)及基因表达变化的精确分析精确度可达倍的变及基因表达变化的精确分析精确度可达倍的变 化。化。4 4、目前价格也不是太贵，左右、目前价格也不是太贵，左右一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学根底的化学根底2 2、荧光染料类、荧光染料类 目前常用的荧光染料为目前常用的荧光染料为SYBR GreenSYBR Green、SYBR GreenSYBR Green、SYTO9 SYTO9、HRMHRM等。其共同性质为：等。其共同性质为：a a、结合于双链核酸的小沟处、结合于双链核酸的小沟处 b b、与双链、与双链DNADNA结合后受激产生荧光结合后受激产生荧光 c c、在变性条件下双链分开，荧光消失、在变性条件下双链分开，荧光消失一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学根底的化学根底荧光染料的特点及应用荧光染料的特点及应用1 1、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与 双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；2 2、可做双链核酸的熔解曲线分析；、可做双链核酸的熔解曲线分析；3 3、SYBR GreenSYBR Green染料本身价格廉价，但是做荧光定量染料本身价格廉价，但是做荧光定量PCRPCR时对引物设时对引物设 计的要求很高；对计的要求很高；对TaqTaq酶要求较高，最好是酶要求较高，最好是HotStar TaqHotStar Taq酶，或者操酶，或者操 作时需要严格的冷启动，冰上操作，否那么引物二聚体及非特异性扩作时需要严格的冷启动，冰上操作，否那么引物二聚体及非特异性扩 增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；4 4、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；5 5、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。6 6、对、对PCRPCR反响的毒性，能抑制反响的毒性，能抑制PCRPCR反响，降低反响，降低PCRPCR反响的效率。反响的效率。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论4 4、荧光定量、荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理 对于普通的对于普通的PCRPCR反响来说反响来说 n n Xn=X0Xn=X01 1E E上式中，上式中，Xn Xn为为n n轮轮PCRPCR循环后，目的基因循环后，目的基因PCRPCR产物的量；产物的量；n n为为PCRPCR循环数；循环数；X0 X0 为目的基因的初始为目的基因的初始模板量，模板量，E E为为PCRPCR的反响效率，的反响效率，0E10E1。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论4 4、荧光定量、荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理 由于由于PCRPCR反响体系中荧光物质的荧光强度与反响体系中荧光物质的荧光强度与PCRPCR产物的量成正比，所以产物的量成正比，所以用荧光强度来代替用荧光强度来代替PCRPCR产物的量，我们可以得到：产物的量，我们可以得到：Rn=RB+X0(1+E)Rs Rn=RB+X0(1+E)Rsn n总荧光信号强度总荧光信号强度=本底信号本底信号+分子数量分子数量 单位信号强度单位信号强度RnRn：第：第n n个循环时的总信号个循环时的总信号RBRB：本底：本底RSRS：单位信号强度：单位信号强度X0X0：起始：起始DNADNA数目数目E E：PCRPCR效率效率一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论4 4、荧光定量、荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理 当循环数当循环数n n等于等于CTCT值时，所有样品荧光信号强度变化量的值时，所有样品荧光信号强度变化量的对数全部一致，都到达了阈值。对数全部一致，都到达了阈值。RT=RB+X0(1+E)Rs RT=RB+X0(1+E)Rs lg(RT-RB)=lgX0+CT lg(1+E)+lg Rs lg(RT-RB)=lgX0+CT lg(1+E)+lg Rs CT lg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)lg Rs CT lg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)lg Rs 此时，此时，PCRPCR反响处于指数期阶段，所有样品的反响效率反响处于指数期阶段，所有样品的反响效率E E稳定且近似相稳定且近似相等；等；lg(RT-RB)lg(RT-RB)、RsRs也都相同，只有也都相同，只有CTCT值和值和-lgX0-lgX0为变量，且这两个变为变量，且这两个变量之间成一次性方程。量之间成一次性方程。也就是说，也就是说，所有样品的所有样品的lgX0lgX0与到达阈值时的循环数与到达阈值时的循环数n nCtCt值呈线性值呈线性关系，根据样品扩增到达域值的循环数即关系，根据样品扩增到达域值的循环数即CtCt值就可计算出样品中所含的模值就可计算出样品中所含的模板量板量CT一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论5 5、荧光定量、荧光定量PCRPCR线性关系成立的条件分析线性关系成立的条件分析CT lg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)lg RsCT lg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)lg Rs1 1、PCRPCR效率相等，在效率相等，在PCRPCR扩增的指数期，扩增的指数期，E E稳定且为常数；稳定且为常数；2 2、RT RB RT RB 要相等；也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧要相等；也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧 光本底之差要相等；光本底之差要相等；3 3、样品的单位信号强度、样品的单位信号强度RsRs要相等，用荧光染料做荧光基团时，要相等，用荧光染料做荧光基团时，Rs Rs 就就 是每条是每条PCRPCR产物结合荧光染料后所发出的荧光强度，此荧光强度和产物结合荧光染料后所发出的荧光强度，此荧光强度和 PCR PCR产物的长短有关，产物的长短有关，PCRPCR产物越长，结合的荧光染料越多，产物越长，结合的荧光染料越多，Rs Rs 值值 越大；用探针做荧光基团时，越大；用探针做荧光基团时，Rs Rs 就等于就等于PCRPCR反响时，反响时，TaqTaq酶水解掉酶水解掉 探针，探针的发光基团所发出的荧光强度，和探针，探针的发光基团所发出的荧光强度，和PCRPCR产物的长度没有产物的长度没有 直接关系。直接关系。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论5 5、荧光定量、荧光定量PCRPCR线性关系成立的条件分析线性关系成立的条件分析左图横坐标是左图横坐标是PCRPCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度循环次数，纵坐标是总的荧光强度RnRn，改图反映的是各个样品随着每轮，改图反映的是各个样品随着每轮PCRPCR反响，反响，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是PCRPCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度与荧光本底的差值循环次数，纵坐标是总的荧光强度与荧光本底的差值RT RBRT RB即即RnRn的对数，在右图中确定阈值线，该直线上所有样品的的对数，在右图中确定阈值线，该直线上所有样品的RT RBRT RB的对数都相同，荧光定量的对数都相同，荧光定量PCRPCR的线性关系才会成立。的线性关系才会成立。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论5 5、荧光定量、荧光定量PCRPCR线性关系成立的条件分析线性关系成立的条件分析 LogX0与循环数呈线性关系，通过起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据未知样品Ct值，就可以在标准曲线上计算出未知样品初始模板量。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论6 6、双链核酸的熔解曲线分析、双链核酸的熔解曲线分析 使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着PCRPCR反响的进反响的进行，双链行，双链PCRPCR产物呈指数增长，产物呈指数增长，SYBR GreenSYBR Green与双链与双链PCRPCR产物结合后荧光越产物结合后荧光越来越强，当来越强，当PCRPCR反响结束时，荧光强度到达最大，此时对反响结束时，荧光强度到达最大，此时对PCRPCR产物进行缓慢产物进行缓慢加热，从加热，从5050一直加热到一直加热到9999，在此过程中，在此过程中PCRPCR产物按照产物按照TMTM值的大小双链被值的大小双链被依次翻开，荧光强度也随着双链的翻开依次减弱，如以下图：依次翻开，荧光强度也随着双链的翻开依次减弱，如以下图：一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论6 6、双链核酸的熔解曲线分析、双链核酸的熔解曲线分析 对于核酸序列相同的对于核酸序列相同的PCRPCR产物，其产物，其TMTM值也相同，而且其值也相同，而且其TMTM值在一个很小值在一个很小的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部翻开，荧光强的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部翻开，荧光强度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，那么可得到如以下图：度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，那么可得到如以下图：一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论6 6、双链核酸的熔解曲线分析、双链核酸的熔解曲线分析 上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核酸双链，在一定的离子强度下的酸双链，在一定的离子强度下的TMTM值。核酸双链的值。核酸双链的TMTM值由双链值由双链核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其TMTM值也不值也不同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也能分析出来。能分析出来。电泳是通过核酸分子量的大小和构象来分析的，熔解曲线电泳是通过核酸分子量的大小和构象来分析的，熔解曲线是根据双链核酸的是根据双链核酸的TMTM值来分析的，这与琼脂糖电泳及值来分析的，这与琼脂糖电泳及SSCPSSCP有异有异曲同工之处。曲同工之处。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论7 7、绝对定量和相对定量、绝对定量和相对定量一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论7 7、mRNAmRNA差异表达的相对定量分析差异表达的相对定量分析 研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，RNARNA提取提取时得率不同、时得率不同、RNARNA反转录为反转录为cDNAcDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些看内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成究中都会用一些看内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基的差异。常用的内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作内参照，常用的内参基因有被用作内参照，常用的内参基因有GAPDHGAPDH基因、基因、-Actin-Actin基因，基因，18srRNA18srRNA基基因等。因等。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论7 7、mRNAmRNA差异表达的相对定量分析差异表达的相对定量分析以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的根本公式，并由此派生出两种相对定量的分析方法：以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的根本公式，并由此派生出两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和双标准曲线法和Delta-delta CtDelta-delta Ct法。法。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论7 7、mRNAmRNA差异表达的相对定量分析差异表达的相对定量分析1 1、双标准曲线法、双标准曲线法 所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的根本公式来求出目的基因的差异表达。基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的根本公式来求出目的基因的差异表达。双标准曲线法的特点：双标准曲线法的特点：a a、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效 率，最大限度的防止了误差；率，最大限度的防止了误差；b b、思路直观、条理清晰、应用简便，操作灵活，无需像、思路直观、条理清晰、应用简便，操作灵活，无需像Delta-Delta-delta CT delta CT法那样对实验进行反复的优化；法那样对实验进行反复的优化；c c、其缺乏之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲、其缺乏之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲 线；线；d d、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的根底理论技术的根底理论7 7、mRNAmRNA差异表达的相对定量分析差异表达的相对定量分析2 2、2-CT2-CT法法 该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差异，假设两者扩增效率之间的差异小于，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。该方法要求严格的重复，因为CT值的差异只要有很小的变化，测得的结果就会有很大的差异。该方法特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。二、引物及二、引物及TaqmanTaqman探针的设计探针的设计1 1、染料法引物的设计原那么：、染料法引物的设计原那么：1 1、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；2 2、防止引物自身或与引物之间形成、防止引物自身或与引物之间形成4 4个或个或4 4个以上连续配对，防止引物个以上连续配对，防止引物 自身形成环状发卡结构；自身形成环状发卡结构；3 3、检测、检测mRNAmRNA时，为防止基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显时，为防止基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子；子；4 4、引物之间的、引物之间的TMTM相差防止超过相差防止超过22；5 5、典型的引物、典型的引物1818到到2424个核苷长；个核苷长；6 6、目的基因和内参基因所扩增的、目的基因和内参基因所扩增的PCRPCR产物长度尽量一致，不大于产物长度尽量一致，不大于 300bp 300bp，这样有利于使两种基因，这样有利于使两种基因PCRPCR效率相同效率相同7 7、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLASTBLAST分析其分析其 特异性特异性 二、引物及二、引物及TaqmanTaqman探针的设计探针的设计2 2、TaqmanTaqman探针及引物的设计原那么：探针及引物的设计原那么：在在TaqmanTaqman探针法中，探针法中，TaqTaq酶除了酶除了5-35-3聚合酶作用之外，还要聚合酶作用之外，还要5-35-3外切酶外切酶的活性来切断探针链产生荧光，普通的活性来切断探针链产生荧光，普通PCRPCR的延伸温度为的延伸温度为7272，此温度为，此温度为TaqTaq酶聚合作用的最正确温度；酶聚合作用的最正确温度；TaqmanTaqman探针法反响中，在要求探针法反响中，在要求TaqTaq酶酶5-35-3聚合酶活聚合酶活性的同时，还需要性的同时，还需要TaqTaq酶酶5-35-3外切酶的活性来切断探针链产生荧光，外切酶的活性来切断探针链产生荧光，TaqTaq酶酶5-35-3外切酶活性的最正确温度为外切酶活性的最正确温度为6060，所以，所以Taqman PCRTaqman PCR反响的一般采用两步反响的一般采用两步法，即法，即9595变性，变性，6060复性延伸。复性延伸。在在TaqmanTaqman探针及引物的设计过程中，引物的探针及引物的设计过程中，引物的TMTM值已经确定为值已经确定为6060左左右，在每轮右，在每轮PCRPCR循环的复性过程中循环的复性过程中95609560，为了确保探针先于引物与，为了确保探针先于引物与模板结合，这就要求探针的模板结合，这就要求探针的TMTM值高于引物值高于引物1010左右，所以左右，所以TaqmanTaqman探针及引探针及引物一般都是引物物一般都是引物TMTM值为值为6060左右，探针的左右，探针的TMTM值为值为7070左右。左右。二、引物及二、引物及TaqmanTaqman探针的设计探针的设计2 2、TaqmanTaqman探针及引物的设计原那么：探针及引物的设计原那么：1 1、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；2 2、检测、检测mRNAmRNA时，为防止基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显时，为防止基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显 子；子；3 3、引物、引物TMTM值为值为6060左右，探针的左右，探针的TMTM值为值为7070左右；左右；4 4、探针的、探针的55端应防止使用鸟嘌呤端应防止使用鸟嘌呤G G，因为，因为5G5G会有淬灭作用，而且即使会有淬灭作用，而且即使 是被切割下来还会存在淬灭作用；是被切割下来还会存在淬灭作用；5 5、整条探针中，碱基、整条探针中，碱基C C的含量要明显高于的含量要明显高于G G的含量的含量 G G含量高会降低反响含量高会降低反响 效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；6 6、引物之间的、引物之间的TMTM相差防止超过相差防止超过22；7 7、典型的引物长度为、典型的引物长度为18-24bp18-24bp，探针长度为，探针长度为15-45bp15-45bp；8 8、PCRPCR产物长度在产物长度在50-150bp50-150bp之间，这样有利于使之间，这样有利于使PCRPCR效率相同；效率相同；9 9、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLASTBLAST分析其分析其 特异性特异性 二、引物及二、引物及TaqmanTaqman探针的设计探针的设计2 2、TaqmanTaqman探针及引物的设计原那么：探针及引物的设计原那么：探针中GC含量的差异对定量PCR反响效率的影响二、引物及二、引物及TaqmanTaqman探针的设计探针的设计3 3、TaqmanTaqman探针及引物的设计举例探针及引物的设计举例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC181 AGGGAGAAAG 181 AGGGAGAAAG TGGTTGGTTGACTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA AT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTACATGAAGCTA241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGA241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATATA ACAATCAGGACAATCAGGA A GGTAATTCCTGGTAATTCCT301 TATCAT301 TATCATCTGTCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTGCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC 361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTCCTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCAACAAGTACCA421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA 481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGACAAGAGAAGAC541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC 541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAAAGAGGAAGAA601 AAGGAACAAT TGGACAATTC 601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGAAGGATTCATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCTTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC经经OligoOligo软件验证，探针软件验证，探针TMTM值值7070左右，上下游引物的左右，上下游引物的TMTM值都为值都为60 60 左右，二级结构左右，二级结构分析，引物和探针比较理想，再经分析，引物和探针比较理想，再经BLASTBLAST分析，引物和探针特异性较好。分析，引物和探针特异性较好。二、引物及二、引物及TaqmanTaqman探针的设计探针的设计4 4、TaqmanTaqman探针及引物合成时本卷须知探针及引物合成时本卷须知1 1、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成；、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成；2 2、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR PCR，电泳检测，电泳检测PCRPCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异 性扩增情况，必要时进行性扩增情况，必要时进行PCRPCR产物的测序验证；产物的测序验证；3 3、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能防止很多以、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能防止很多以 外的损失；外的损失；4 4、探针合成好后，先检测一下探针的质量，、探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm250nm的探针终浓度，的探针终浓度，25ul 25ul水，反响体系中只有水和探针，在荧光定量水，反响体系中只有水和探针，在荧光定量PCRPCR仪上检测，仪上检测，95 95，2min;952min;95，20s20s，6060，20s20s，4040个个cyclescycles；看荧光本底和；看荧光本底和 荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCRPCR反响，荧反响，荧 光强度不会变化，假设荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量光强度不会变化，假设荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量 较差，建议重新合成。较差，建议重新合成。三、内参基因的选择三、内参基因的选择1 1、理想的内参基因具有的特点、理想的内参基因具有的特点1 1、不存在假基因；、不存在假基因；2 2、高度或中度表达，排除太高或低表达、高度或中度表达，排除太高或低表达3 3、稳定表达于不同类型的细胞和组织、稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞如正常细胞和癌细胞)，而且其，而且其 表达量是近似的，无显著性差异；表达量是近似的，无显著性差异；4 4、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；5 5、其稳定的表达水平与目标基因相似；、其稳定的表达水平与目标基因相似；6 6、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的 影响。影响。理想的内参基因很少或者说不存在，因为所有基因在不同的细胞或组理想的内参基因很少或者说不存在，因为所有基因在不同的细胞或组织中、在细胞的不同生理时期、在不同的理化等外界刺激下，其表达量都织中、在细胞的不同生理时期、在不同的理化等外界刺激下，其表达量都会有所差异，有时可以是几倍、几十倍甚至是上百倍的差异。盲目地使用会有所差异，有时可以是几倍、几十倍甚至是上百倍的差异。盲目地使用一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能引致错误甚至相反的结论。一方面可能引致错误甚至相反的结论。三、内参基因的选择三、内参基因的选择2 2、常用内参基因的表达情况、常用内参基因的表达情况1 1、GAPDHGAPDH GAPDH mRNA GAPDH mRNA在不