(3)--2.1 微生物菌种的选育.ppt

微生物微生物菌种的选育菌种的选育 潍坊医学院2主要内容主要内容q 菌种的分离与筛选菌种的分离与筛选q 诱变育种诱变育种q 代谢调节与微生物育种代谢调节与微生物育种q 基因重组育种基因重组育种潍坊医学院3一一 微生物的分离与筛选微生物的分离与筛选根本来源是自然环境，微生物根本来源是自然环境，微生物分布广泛，是菌种来源的宝库。分布广泛，是菌种来源的宝库。自然环境下微生物混杂生长，自然环境下微生物混杂生长，怎样得到理想的菌株？怎样得到理想的菌株？潍坊医学院4v菌种的分离筛选的步骤菌种的分离筛选的步骤 1 1、采样采样 2 2、富集培养、富集培养 3 3、微生物分离、微生物分离 4 4、微生物筛选与目的产物的鉴定、微生物筛选与目的产物的鉴定潍坊医学院5v采样采样从自然界中采集含有目的菌的样品从自然界中采集含有目的菌的样品土壤是采样的主要目标土壤是采样的主要目标（1 1）土壤特点和气候条件）土壤特点和气候条件（2 2）微生物营养类型和生理特点）微生物营养类型和生理特点（3 3）局部环境和极端条件）局部环境和极端条件潍坊医学院6v根据土壤特点根据土壤特点 耕作土耕作土 菜园土菜园土 细菌细菌 放线菌放线菌森林土森林土 霉菌霉菌 酵母菌酵母菌沙土沙土 贫瘠土贫瘠土 微生物较少微生物较少1-5cm 微生物少微生物少5-25cm 微生物较多微生物较多25cm以下以下 微生物少微生物少 偏碱偏碱 细菌细菌 放线菌放线菌 偏酸偏酸 霉菌霉菌 酵母菌酵母菌潍坊医学院7v根据地理位置和气候条件根据地理位置和气候条件根据地理位置根据地理位置根据气候条件根据气候条件秋季为采集土样最理想的季节秋季为采集土样最理想的季节潍坊医学院8v根据微生物营养类型和生理特点根据微生物营养类型和生理特点根据对碳源和氮源的需求不同根据对碳源和氮源的需求不同纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖、果胶酶纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖、果胶酶根据微生物独特的生理特性根据微生物独特的生理特性潍坊医学院9极端环境潍坊医学院10v采土样的方法采土样的方法选好采样地点选好采样地点,用取样铲将表层用取样铲将表层5cm左右的左右的浮土除去浮土除去,取离地面取离地面5-25cm出的土样出的土样10-25g,装入预先消毒的牛皮纸袋、塑料袋或装入预先消毒的牛皮纸袋、塑料袋或玻璃瓶等容器中，密封好后，编号并记录玻璃瓶等容器中，密封好后，编号并记录时间、地点、土壤质地、植被名称及其他时间、地点、土壤质地、植被名称及其他环境条件。环境条件。潍坊医学院11v富集培养富集培养定义定义：在目的微生物含量较少时，根据微生物的：在目的微生物含量较少时，根据微生物的特点，制定特定的环境条件，使目的微生物在该特点，制定特定的环境条件，使目的微生物在该条件下迅速生长，从而增加样品中的目的微生物条件下迅速生长，从而增加样品中的目的微生物的数量和比例，以利于分离到所需要的目的菌株。的数量和比例，以利于分离到所需要的目的菌株。富集培养的条件主要根据目的微生物对营养、富集培养的条件主要根据目的微生物对营养、pHpH、温度、氧气、光照等方面的需求而确定。、温度、氧气、光照等方面的需求而确定。潍坊医学院12v控制营养成分控制营养成分 碳源碳源自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源有机氮源有机氮源无机氮源无机氮源生长因子、无机盐生长因子、无机盐潍坊医学院13v控制培养条件控制培养条件通过对微生物的通过对微生物的pHpH、温度及通气量等其他一些条件、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制，达到有效分离目的的特殊要求加以控制，达到有效分离目的pH:pH:细菌和放线菌细菌和放线菌 中性或碱性中性或碱性 霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌 偏酸性偏酸性温度：嗜热微生物温度：嗜热微生物 嗜冷微生物嗜冷微生物 产芽孢菌产芽孢菌好氧菌好氧菌厌氧菌厌氧菌潍坊医学院14v使用抑制剂使用抑制剂通过加入一些选择性抑制剂来减少非目的微生物的数量通过加入一些选择性抑制剂来减少非目的微生物的数量适量胆盐和十二烷基磺酸钠抑制革兰氏阳性菌适量胆盐和十二烷基磺酸钠抑制革兰氏阳性菌酚抑制霉菌和细菌酚抑制霉菌和细菌抗生素抑制细菌和放线菌抗生素抑制细菌和放线菌不同浓度硫乙醇酸钠利于厌氧菌的生长不同浓度硫乙醇酸钠利于厌氧菌的生长潍坊医学院15v微生物的分离微生物的分离 经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。因此，经即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。最需要的菌株直接从样品中分离出来。潍坊医学院E-mail:16稀释倒平板法稀释倒平板法 1.1.常规分离法常规分离法潍坊医学院17平板划线分离法（平板划线分离法（平板划线分离法（平板划线分离法（Streak PlateStreak Plate）特点：快速、方便。特点：快速、方便。An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.潍坊医学院18组织分离法组织分离法组织分离法组织分离法 切除小块含菌组织，用干净水洗去组织表面污物。切除小块含菌组织，用干净水洗去组织表面污物。以以1010漂白粉或漂白粉或0.10.1升汞浸泡升汞浸泡2 25 5分钟进行表面消分钟进行表面消毒，无菌水冲洗。将消毒后的组织移到平皿培养基毒，无菌水冲洗。将消毒后的组织移到平皿培养基上，置于适宜温度（上，置于适宜温度（25252626）培养一定时间，即）培养一定时间，即可在组织周围长出微生物。用肉眼或显微镜观察菌可在组织周围长出微生物。用肉眼或显微镜观察菌落，基本确认后挑入斜面培养基中培养。由这种方落，基本确认后挑入斜面培养基中培养。由这种方法挑选的菌株往往不纯，必须在琼脂平板上再分离法挑选的菌株往往不纯，必须在琼脂平板上再分离纯化，然后挑取单个菌落于斜面，进一步筛选。纯化，然后挑取单个菌落于斜面，进一步筛选。潍坊医学院192.2.平皿生化反应分离法平皿生化反应分离法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的量性状转化成可见的“形态形态”变化。变化。潍坊医学院20饱浸含某种指示饱浸含某种指示剂的固体培养基剂的固体培养基的滤纸片变色圈的滤纸片变色圈 指示剂直接掺入或喷洒固体指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液碘液 固体培养基中渗入溶解性固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。质形成透明圈。利用一些有特别营养要利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物物的前体转化成营养物能力，工具菌就能围绕能力，工具菌就能围绕该菌生长该菌生长 待筛选的菌株能待筛选的菌株能分泌产生某些能分泌产生某些能抑制工具菌生长抑制工具菌生长的物质的物质 潍坊医学院E-mail:21潍坊医学院22微生物筛选和目的产物的鉴定微生物筛选和目的产物的鉴定微生物筛选和目的产物的鉴定微生物筛选和目的产物的鉴定v在实际工作中，一般认为应采用把筛选工程分为初筛与复筛两个在实际工作中，一般认为应采用把筛选工程分为初筛与复筛两个阶段的筛选方案为好。前者以量（选留菌株的数量）为主，后者阶段的筛选方案为好。前者以量（选留菌株的数量）为主，后者以质（测定数据的精确度）为主。以质（测定数据的精确度）为主。潍坊医学院23v二、诱变育种二、诱变育种 选择合适的诱变因素处理微生物选择合适的诱变因素处理微生物选择合适的诱变因素处理微生物选择合适的诱变因素处理微生物,诱发基因诱发基因诱发基因诱发基因发生突变发生突变发生突变发生突变,然后根据育种目标然后根据育种目标然后根据育种目标然后根据育种目标,运用合适的筛选运用合适的筛选运用合适的筛选运用合适的筛选方法从多种多样的变异体中获得符合要求的突方法从多种多样的变异体中获得符合要求的突方法从多种多样的变异体中获得符合要求的突方法从多种多样的变异体中获得符合要求的突变菌株变菌株变菌株变菌株.基因突变基因突变基因突变基因突变 人工诱变人工诱变人工诱变人工诱变（多数育种）（多数育种）（多数育种）（多数育种）人工诱变人工诱变人工诱变人工诱变:方法简单、投资少、收获大方法简单、投资少、收获大方法简单、投资少、收获大方法简单、投资少、收获大 缺乏定向性缺乏定向性缺乏定向性缺乏定向性潍坊医学院24诱变育种的基本过程：诱变育种的基本过程：选择选择合适的出发菌株选择选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液制备待处理的菌悬液诱变处理诱变处理筛选筛选保藏和扩大试验保藏和扩大试验潍坊医学院251.1.1.1.出发菌株的选择出发菌株的选择出发菌株的选择出发菌株的选择1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4出发菌株开始时可以同时选34株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。潍坊医学院26 5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。6根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择菌株，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。潍坊医学院272.2.2.2.制备细胞悬液制备细胞悬液制备细胞悬液制备细胞悬液要求：要求：菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；细胞分散且为单细胞，以避免细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象表型迟延现象（phenotypic lagphenotypic lag）;方法：方法：玻璃珠打散玻璃珠打散10-15min;10-15min;加加.3%.3%吐温吐温8080（表面活性剂）（表面活性剂）用无菌脱脂棉过滤。用无菌脱脂棉过滤。制备：物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl)化学诱变剂缓冲液 浓度：细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml潍坊医学院283.3.3.3.诱变处理：诱变处理：诱变处理：诱变处理：诱变剂的作用：提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在7080%）潍坊医学院29l选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG（亚硝基胍）。诱变处理方式：诱变处理方式：单一因子处理：单一因子处理：复合因子处理：复合因子处理：两种以上因素两种以上因素先后使用先后使用 同时使用同时使用 单一因子重复使用单一因子重复使用潍坊医学院30 4 4 4 4突变株的分离与筛选突变株的分离与筛选突变株的分离与筛选突变株的分离与筛选 整个筛选工作分两步比较好。整个筛选工作分两步比较好。第一步为初筛阶段第一步为初筛阶段:选出菌株数目要多选出菌株数目要多,但准确性要但准确性要求不高，基本可以不让高产变异菌株遗漏求不高，基本可以不让高产变异菌株遗漏,又可以减又可以减少许多工作量。少许多工作量。第二步为复筛阶段第二步为复筛阶段:测定的菌株数目较少测定的菌株数目较少,准确性要准确性要求高求高,这样可以通过重复测定这样可以通过重复测定,从中选出最好的菌株。从中选出最好的菌株。复筛常采用摇瓶或台式发酵罐进行放大试验复筛常采用摇瓶或台式发酵罐进行放大试验,以进行以进行接近实际的生产性能测定。接近实际的生产性能测定。经筛选后获得的优良菌株经筛选后获得的优良菌株,进行保藏进行保藏,供生产需要时供生产需要时用。用。潍坊医学院31可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。极其重要。以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：潍坊医学院32v三、原生质体融合育种三、原生质体融合育种将遗传性状不同的两种菌将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属包括种间、种内及属间间)融合为一个新细胞的技术。融合为一个新细胞的技术。优点优点1.1.重组率高重组率高2.2.受接合性或致育性的限制小，无供体受体之分受接合性或致育性的限制小，无供体受体之分3.3.传递更完整传递更完整4.4.类型多类型多5.5.提高诱变频率或助于基因转化提高诱变频率或助于基因转化潍坊医学院33微生物原生质体融合的一般原理和过程微生物原生质体融合的一般原理和过程 潍坊医学院34 选择亲株选择亲株 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株 为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等缺陷型或抗药性等 原生质体制备原生质体制备 去除细胞壁是制备原生质体的关键去除细胞壁是制备原生质体的关键 潍坊医学院35潍坊医学院36原生质体融合原生质体融合 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）能有效地促进原生质体融合）能有效地促进原生质体融合一般一般PEGPEG的使用浓度范围在的使用浓度范围在25-40%25-40%采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合孔来进行融合原生质体再生原生质体再生 使原生质体重新长出细胞壁使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细，恢复完整的细胞形态结构胞形态结构不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压最重要的一个共同点是都需要高渗透压 潍坊医学院37融合重组子的筛选融合重组子的筛选通过两亲株遗传标记的互补而得以识别通过两亲株遗传标记的互补而得以识别 潍坊医学院38重组子的检出方法有两种：重组子的检出方法有两种：直接法直接法 将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子 间接法间接法 把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将它们复制到，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。选择培养基上检出重组子。潍坊医学院39v蜘蛛能够吐出蛛丝资料一：蛛丝是自然资料一：蛛丝是自然界最奇特的物质之一，界最奇特的物质之一，它具有极强的韧度，它具有极强的韧度，其韧度是同样直径钢其韧度是同样直径钢材的好几倍。但与家材的好几倍。但与家蚕不同，蜘蛛不能家蚕不同，蜘蛛不能家养，因为它们会互相养，因为它们会互相吞食，所以不可能建吞食，所以不可能建立人工饲养蜘蛛的农立人工饲养蜘蛛的农场。场。30多年来，科学多年来，科学家们一直试图找到利家们一直试图找到利用其他生物体来制造用其他生物体来制造蛛丝的办法。蛛丝的办法。潍坊医学院E-mail:40 资料二资料二 以往，治疗糖尿病的以往，治疗糖尿病的胰岛素是从动物胰腺胰岛素是从动物胰腺中提取的，从中提取的，从100千千克猪、牛等动物的胰克猪、牛等动物的胰腺只能提取腺只能提取34克胰克胰岛素，治疗一个患者岛素，治疗一个患者需宰杀需宰杀4050头牛，头牛，这种药物的造价就可这种药物的造价就可想而知了。想而知了。微生物可以有分泌产物，且微生物繁殖速率快潍坊医学院41能否让细菌能否让细菌能否让细菌能否让细菌“吐出吐出吐出吐出”蛛丝？蛛丝？蛛丝？蛛丝？设想一设想一能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？素等珍贵的药物？素等珍贵的药物？素等珍贵的药物？设想二设想二经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程。潍坊医学院42从细胞中分从细胞中分从细胞中分从细胞中分离出离出离出离出DNADNADNADNA限制酶截取限制酶截取限制酶截取限制酶截取DNADNADNADNA片断片断片断片断分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒 DNA DNA DNA DNA重组重组重组重组用重组质粒用重组质粒用重组质粒用重组质粒转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因潍坊医学院43基因工程的应用1、基因工程与作物育种：转基因抗虫棉、耐贮存番茄、基因工程与作物育种：转基因抗虫棉、耐贮存番茄、耐盐碱棉花、抗除草作物、转基因奶牛、超级绵羊等等耐盐碱棉花、抗除草作物、转基因奶牛、超级绵羊等等2、基因工程与药物研制：干扰素、白细胞介素、溶血、基因工程与药物研制：干扰素、白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子、疫苗栓剂、凝血因子、疫苗3、基因工程与环境保护：超级细菌、基因工程与环境保护：超级细菌潍坊医学院44v育种技术的不断完善与发展的动力和原因是 超越已有技术的局限性 。育种学家将如何突破“不能实行种间的基因交流”这一育种技术的局限呢？选择育种选择育种基因重组育种基因重组育种诱变育种诱变育种特点：在自然产生的变异中选择特点：在自然产生的变异中选择局限：不能把位于两个品种的优良性状集局限：不能把位于两个品种的优良性状集 于一身于一身主要优点：有目的地把位于两个品种的优主要优点：有目的地把位于两个品种的优 良性状集于一身良性状集于一身局限：不能产生新的基因局限：不能产生新的基因主要优点：能产生新基因主要优点：能产生新基因局限：该方法具有一定的盲目性局限：该方法具有一定的盲目性均均不不能能实实行行种种间间的的基基因因交交流流潍坊医学院45基因重组基因重组育种育种诱变育种诱变育种多倍体育多倍体育种种单倍体育单倍体育种种处处理理原原理理优优点点缺缺点点潍坊医学院46基因重组基因重组育种育种诱变育种诱变育种多倍体育种多倍体育种 单倍体育种单倍体育种处处理理杂交杂交辐射、射线辐射、射线化学试剂化学试剂秋水仙素秋水仙素花药离体培养花药离体培养原原理理基因重组基因突变染色体变异优优点点可以集中可以集中两个亲体两个亲体的优良性的优良性状状育种年限缩育种年限缩短，改良某短，改良某些性状些性状果大，茎秆果大，茎秆粗，营养物粗，营养物丰富丰富年限短，易年限短，易稳定稳定缺缺点点时间长时间长有利不多，有利不多，需大量处理需大量处理发育迟，结发育迟，结实低实低高度不育，高度不育，弱小弱小