(4)--2.2 发酵过程的生物学基础.ppt
1第二章发酵过程的生物学基础 2本章的教学内容发酵过程与微生物发酵过程与微生物现代微生物菌种改造技术现代微生物菌种改造技术高浓度微生物的培养3第一节第一节第一节第一节 发酵过程与微生物发酵过程与微生物发酵过程与微生物发酵过程与微生物 微生物与发酵微生物细胞工厂4一、微生物与发酵发酵工程是以微生物的发酵工程是以微生物的生命活动为中心生命活动为中心的的 微生物的生物学性状和发酵条件决定了其相应产物的微生物的生物学性状和发酵条件决定了其相应产物的生成生成工业上用的全部微生物都称为工业上用的全部微生物都称为工业微生物工业微生物，工业生产，工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌 5二、微生物细胞工厂裂解裂解生物生物燃料燃料C1-C6平台平台化合物化合物高分子高分子聚合物聚合物芳香族芳香族化合物化合物C2 酸酸C2 醇醇C2 CoAC3 酮酸酮酸C2 醛醛C2 P转移转移ADPATP还原还原NADHNAD+氧化氧化Pi+O2CO2还原还原NADHNAD+C1 酸酸氧化氧化CO2NADHNAD+转移转移C3 酮酸酮酸PC3酸酸P转移转移裂解裂解H2OC3 醛醛P异构异构NAD+NADH ADPATP转移转移氧化氧化ADPATPC3 羟酮羟酮P异构异构C3 二醇二醇裂解裂解NADHNAD+还原还原ADPATP转移转移NADHNAD+还原还原H2O生物质生物质粗原料粗原料C6 糖糖P裂解裂解转移转移ADPATPC5 糖糖PC7 糖糖PC4 糖糖P转移转移ADPATP转移转移转移转移还原还原NADPHNADP+苯苯 C3 酮酸酮酸裂解裂解异构异构C3 羟酸羟酸还原还原裂解裂解C3 烯酰烯酰CoANADHNAD+裂解裂解C3 烯酸烯酸氧化氧化CO2H2合成合成C4 CoAC3 酮酮C3 醇醇裂解裂解还原还原还原还原NADHNAD+C4 醇醇聚酮聚酮合成合成转移转移聚羟基聚羟基烷酸烷酸C4 酸酸C6 酸酸C5 酮酸酮酸C4 CoA合成合成CO2转移转移氧化氧化NAD+NADHCO2氧化氧化CO2合成合成六碳糖六碳糖(葡萄糖葡萄糖甘露糖甘露糖)五碳糖五碳糖(木糖、木糖、阿拉伯糖阿拉伯糖)转移转移分解分解酶系酶系水解水解水解水解将生物质原料各类组分，将生物质原料各类组分，高效、定向高效、定向合成燃料、材料与各类化学品合成燃料、材料与各类化学品6减减压压精精馏馏氧氧化化氧氧化化丙烯酸 建筑、纺织、包装建筑、纺织、包装 目前国内需求目前国内需求55万万吨，吨，产值产值88亿亿生物质生物炼制生物炼制细胞工厂细胞工厂细胞工厂的生产模式细胞工厂的生产模式实现实现One-Pot反应，缩短石油化学品生产的工艺流程，反应，缩短石油化学品生产的工艺流程，减减少原油资源消耗，降低投资成本，减少污染与少原油资源消耗，降低投资成本，减少污染与CO2排放。排放。分分离离裂裂化化分分离离分分离离分分离离选择性选择性高效性高效性含氧原料含氧原料手性特征手性特征3-羟基丙酸羟基丙酸石油7“微生物细胞工厂微生物细胞工厂”概述概述所谓“工厂”，就是能够生产或制造某种产品，或者进行某种处理程序的场所。因此,一般意义上的“工厂”应该具备特定的生产线，以及相应的动力等辅助系统，并且需要在一定的管理程序下才能正常运转。“细胞工厂”也具备相应的组成要素，同样地，对于“细胞工厂”而言，其“可设计性”也是最重要的。这就首先需要了解菌体的遗传操作背景及原有的代谢途径或网络，因此细胞工厂的构建多在遗传背景相对清楚的模式菌的基础上进行。8“微生物细胞工厂微生物细胞工厂”概述概述“工厂工厂”组织和调控要素组织和调控要素相应的细胞结构或调控要素相应的细胞结构或调控要素生产线产物合成/底物降解途径动力等辅助系统胞内能量及辅因子系统管理程序胞内复杂的调节控制系统和对外界调控的响应能力根据需求设计生产线,并调控生产进度在遗传背景相对清楚的模式菌中构建新的代谢途径或进行代谢调控9“微生物细胞工厂微生物细胞工厂”概述概述野生型的菌株通常不能被称之为细胞工厂，主要是因为：野生型菌株代谢速率和产物积累浓度低;野生型菌株的代谢产物往往是多种产品的混合物，直接用于工业生产时产品分离难度较大;野生型菌株主要依靠自然进化，速度慢，随机性强，不适合用于工业生产;多数微生物底物谱较窄，而生物质成分复杂，难以被一种微生物全部利用。10细胞工厂的挑战细胞工厂的挑战复杂原料复杂原料大量合成大量合成定向合成定向合成微量合成微量合成不能合成不能合成木糖木糖阿拉伯糖阿拉伯糖半乳糖半乳糖甘露糖甘露糖葡萄糖葡萄糖(淀粉淀粉)产品合成能力产品合成能力精细原料精细原料目前生物炼制的经济竞争力与市场影响力有限目前生物炼制的经济竞争力与市场影响力有限原料利用能力原料利用能力葡萄糖葡萄糖时间时间浓度浓度(g/L)100木糖木糖利用速率利用速率:葡萄糖葡萄糖1/4转化率转化率:10-40%木糖木糖微微生生物物产量产量(g/L)130150时间时间乙烯乙烯(?)3-羟基丙酸羟基丙酸(?)丙烯酸丙烯酸(?)丁二酸丁二酸乙醇乙醇谷氨酸谷氨酸柠檬酸柠檬酸丁醇丁醇11细胞工厂的构建遗传修饰遗传修饰设计策略设计策略代谢分析代谢分析出发菌株出发菌株细胞工厂细胞工厂高效利用生物质高效利用生物质高效生产目的产物高效生产目的产物细胞工厂构建的策略12细胞工厂的构建基于基因组序列数据、代谢组分析和通量组计算重构代谢网络，是构建生物炼制细胞工厂的基础。在此基础上，利用计算生物学的方法，整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学所产生的数据，理解微生物对不同的细胞内和环境刺激的应答情况，利用适当的算法解析代谢网络结构，确定其中的关键节点，可以设计出新的代谢工程策略，设法调节代谢流向目标产物产量最大化的方向流动，从而构建高效的细胞工厂。13第二节 现代微生物菌种改造技术为什么要改造微生物菌种？为什么要改造微生物菌种？14 发酵工程的基本思路：为了实现某种发酵工程的基本思路：为了实现某种工业目的工业目的(生产某种产品或降解有毒物质生产某种产品或降解有毒物质)，从自然界中，从自然界中筛选微生物并通过遗传手段筛选微生物并通过遗传手段改善其工业性能改善其工业性能。15mutation传统的微生物菌种改造技术16传统菌种改造技术的缺陷会产生大量你不需要的突变缺乏针对性费时、费力、费钱：每轮诱变育种可能要筛选 105 突变株17菌种改造的新技术代谢工程系统生物学18代谢工程的构建微生物生产菌种19代谢工程Metabolic engineeringTargeted improvement of cellular activities by manipulation of enzymatic,transport,and regulatory functions of the cell with the use of rDNA technology.Jay Bailey 1991.Toward a science of metabolic engineering.Science 252:.16681675 基本思想是：基本思想是：根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤，根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤，进行遗传操作进行遗传操作20代谢工程：定向改造微生物的自然能力代谢工程：定向改造微生物的自然能力以生产以生产(降解降解)某种物质为目标的工业生物技术，需要某种物质为目标的工业生物技术，需要 拓展底物利用能力和范围拓展底物利用能力和范围 引入新的合成途径，或延伸已有途径引入新的合成途径，或延伸已有途径 减少副产物形成；提高产量、产率和生产强度减少副产物形成；提高产量、产率和生产强度 改善细胞生理功能改善细胞生理功能传统育种传统育种：随机突变，非理性设计：随机突变，非理性设计代谢工程代谢工程：定向遗传修饰，理性设计：定向遗传修饰，理性设计 21代谢工程代谢工程策略策略碳水化合物碳水化合物原料原料丙酮丙酮丁醇丁醇C2 酸酸C2 醇醇C2 CoAC3 酮酸酮酸C2 醛醛C2 PC3 酮酸酮酸PC3酸酸PC4 CoAC3 酮酮C4 醇醇C6 糖糖PC3 醛醛PC6 糖糖PC6 糖糖P 利用系统生物学手段，发现新利用系统生物学手段，发现新的的支路途径和调控位点支路途径和调控位点 酸酸PC3 二醇二醇C3 羟酮羟酮PC4 酸酸C5 酮酸酮酸C4 CoAC6 酸酸 设计新的代谢工程策略设计新的代谢工程策略22C3 烯酰烯酰CoAC3 羟酸羟酸C3 烯酸烯酸代谢工程代谢工程策略策略碳水化合物碳水化合物原料原料C2 酸酸C2 醇醇C2 CoAC3 酮酸酮酸C2 醛醛C2 PC3 酮酸酮酸PC3酸酸PC4 CoAC3 酮酮C4 醇醇C6 糖糖PC3 醛醛PC6 糖糖PC6 糖糖P 酸酸PC3 二醇二醇C3 羟酮羟酮PC4 酸酸C5 酮酸酮酸C4 CoAC6 酸酸 C3 烯酰烯酰CoAC3 羟酸羟酸C3 烯酸烯酸丙烯酸丙烯酸实现代谢实现代谢途径重构途径重构丙酮丙酮丁醇丁醇 23遗传修饰遗传修饰设计策略设计策略代谢分析代谢分析出发菌株出发菌株高效生产菌株高效生产菌株代谢工程的基本思路代谢工程的基本思路 设计策略是基础设计策略是基础 遗传修饰是关键遗传修饰是关键24设计策略设计策略：正向：正向(Constructive)代谢工程代谢工程 1991年在年在Science上正式提出，基本思想是：上正式提出，基本思想是：根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤，进行遗传操作根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤，进行遗传操作25正向代谢工程：重新分配中心途径代谢流PyruvateLactateSugarldhNADHNAD+XNADHNAD+L-alaninealad from BacillusNH4+Alanine racemaseX乳酸乳球菌以同型发酵乳酸乳球菌以同型发酵方式，将方式，将95%以上的葡以上的葡萄糖转化为萄糖转化为L-乳酸乳酸将乳酸脱氢酶（将乳酸脱氢酶（LDH）敲除，然后再表达丙氨敲除，然后再表达丙氨酸脱氢酶，并敲除丙氨酸脱氢酶，并敲除丙氨酸消旋酶，可以将原来酸消旋酶，可以将原来到到L-乳酸的碳流重新分乳酸的碳流重新分配到配到L-丙氨酸（甜味剂）丙氨酸（甜味剂）实现同型乳酸发酵到同实现同型乳酸发酵到同型丙氨酸发酵。型丙氨酸发酵。26设计策略设计策略：反向：反向(Inverse)代谢工程代谢工程 1996年首次提出，基本思想是：年首次提出，基本思想是：对实验室菌株（或野生型）的突变、定向进化和定向筛选，获得预期的表对实验室菌株（或野生型）的突变、定向进化和定向筛选，获得预期的表型，并确定其基因型型，并确定其基因型 选择工业菌株并对其相应基因进行遗传操作，以期获得同样的表型选择工业菌株并对其相应基因进行遗传操作，以期获得同样的表型27反向代谢工程：基因组测序发现新靶点反向代谢工程：基因组测序发现新靶点日本学者对两株谷氨酸棒日本学者对两株谷氨酸棒杆菌（一株是生长较差但杆菌（一株是生长较差但能高产赖氨酸的突变株、能高产赖氨酸的突变株、另一株为生长良好的野生另一株为生长良好的野生型）进行全基因组测序型）进行全基因组测序找出突变株与野生型不同、找出突变株与野生型不同、且有可能影响赖氨酸生产且有可能影响赖氨酸生产的突变基因的突变基因然后将这些突变导入野生然后将这些突变导入野生型，结果获得了迄今为止型，结果获得了迄今为止最高水平的赖氨酸生产率最高水平的赖氨酸生产率3 g L-1 h-1这是利用组学进行反向代这是利用组学进行反向代谢工程研究的第一个例子谢工程研究的第一个例子28遗传修饰遗传修饰：基因敲除：基因敲除DNAGene 1Gene 2Gene 3 Enzyme 1 Enzyme 2 Enzyme 3ABCDADNAXX X29遗传修饰遗传修饰：基因表达：基因表达DNAGene 1Gene 2Gene 3 Enzyme 1 Enzyme 2 Enzyme 3ABCDADNAXX XGene 4 Enzyme 4E30代谢工程设计改变代谢流扩展代谢途径构建新的代谢途径311，改变代谢途径改变代谢途径是指改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成，以达到提高目标产物的目的。改变代谢途径有各种方法，如加速限速反应、改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法。32（1）加速限速反应最成功的一个例子是头孢霉素C的代谢工程菌的构建。青霉素N是头孢霉素合成的中间体。当用顶头孢霉发酵时，发现了青霉素N的积累，这表明下一步酶反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤。因此克隆了编码脱乙酰氧基头孢霉素C合成酶基因cefEF，并导入顶头孢中，所得转化子的头孢霉素C产量提高了25，而青霉素N的积累量减少至原来的1/16。33-氨基己二酸氨基己二酸氨基己二酸氨基己二酸头孢霉素C的代谢工程菌的构建 中间产物中间产物中间产物中间产物克隆了编码克隆了编码克隆了编码克隆了编码脱乙酰氧基脱乙酰氧基脱乙酰氧基脱乙酰氧基头孢霉素头孢霉素头孢霉素头孢霉素C C合成酶基因合成酶基因合成酶基因合成酶基因cefEFcefEF青霉素青霉素青霉素青霉素N N头孢霉素头孢霉素头孢霉素头孢霉素C C限速步骤限速步骤限速步骤限速步骤所得转化子头孢霉素所得转化子头孢霉素所得转化子头孢霉素所得转化子头孢霉素C C产量提高了产量提高了产量提高了产量提高了2525，而青霉素，而青霉素，而青霉素，而青霉素N N的积累量减少至原来的的积累量减少至原来的的积累量减少至原来的的积累量减少至原来的1/161/16。34（2）改变分支代谢途径流向是指提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性，在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势，亦可提高目的末端代谢产物的的产量。35如：赖氨酸合成，选育解除反馈抑制和缺失高丝氨酸脱氢酶的突变株，提高了赖氨酸的产量。而为了获得苏氨酸的高产菌株，以解除了反馈抑制的赖氨酸产生菌棒状杆菌为宿主，转入高丝氨酸脱氢酶基因，结果使原来不产生苏氨酸的赖氨酸产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至4g/L，而苏氨酸产量增加到52g/L，使赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。36高丝氨酸脱氢酶基因赖氨酸产生菌棒状杆菌产生菌的赖氨酸产量由产生菌的赖氨酸产量由65g/L65g/L下下降至降至4g/L4g/L，苏氨酸产量增加到，苏氨酸产量增加到52g/L52g/L，赖氨酸产生菌转变成苏，赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。氨酸产生菌。372，转移或构建新的代谢途径将催化一系列反应的多个酶基因，克隆到不能产生某种新的化学结构的代谢产物的微生物中，使之获得产生新的化合物的能力；利用基因工程手段，克隆少数基因，使细胞原有无关的两条代谢途径联结起来，形成新的途径，产生新的代谢产物；将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。38PyruvateLactateSugarldhNADH NAD+XNADHNAD+L-alaninealad from BacillusNH4+Alanine racemaseX乳酸乳球菌以同型发乳酸乳球菌以同型发酵方式，将酵方式，将95%以上的以上的葡萄糖转化为葡萄糖转化为L-乳酸乳酸将乳酸脱氢酶将乳酸脱氢酶（LDH）敲除，然后）敲除，然后再表达丙氨酸脱氢酶，再表达丙氨酸脱氢酶，并敲除丙氨酸消旋酶，并敲除丙氨酸消旋酶，可以将原来到可以将原来到L-乳酸的乳酸的碳流重新分配到碳流重新分配到L-丙氨丙氨酸（甜味剂）酸（甜味剂）实现同型乳酸发酵到实现同型乳酸发酵到同型丙氨酸发酵。同型丙氨酸发酵。393，扩展代谢途径定义：指在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物。或使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料合成代谢产物。40Strategies of modifying pathways for improved production of chemicals41例一、例一、1,3-丙二醇生产菌的改造丙二醇生产菌的改造421，3-丙二醇（1，3PDO）是无色透明无味液体，与水、醇、醚等互溶，难溶于苯、氯仿。1，3PDO与与对苯二酸反应生成1，3PDO对苯二酸酯(PTT)。研究表明PTT较聚对苯二甲酸乙二酯（PET）、聚对苯二甲酸丁二酯（PBT）具有更加独特的性质。43PTT纤维柔软，具有良好的弹良好的弹性回复性和回弹率性回复性和回弹率，伸长20%后的PTT纤维可恢复至原状，性能明显优于PET、PBT等纤维；在全色范围内无需添加特殊化学品即能呈现良好的连续印染特性和良好良好的着色性，色度牢固，的着色性，色度牢固，染色成本较低，环境污染少；具有良好的抗紫外、抗静电、良好的抗紫外、抗静电、抗臭氧、耐污、耐磨洗性质抗臭氧、耐污、耐磨洗性质；以PTT为原料生产的薄膜还具有良好的生物降解性良好的生物降解性。照片图示：这件体恤是由玉米制造的！照片图示：这件体恤是由玉米制造的！441,3-PDO的发酵生产1,3-PDO可以通过发酵甘油来生产，并在多种细菌中，例如克雷伯氏菌（Klehsiella）、柠檬酸菌（Citrobacter）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、肠杆菌属、乳杆菌属发现了能够生产1,3-PDO的菌株。451,3-PD在在K.pneumoniae中的合成途径中的合成途径Glycerol3-羟基丙醛(3-HPA)1,3-PDPEPPyruvateSuccinateAcetyl-CoAFormateAcetateEthanolNADHNAD+NAD+NADHNAD+NADH2NAD+2NADHNADHNAD+NADHNAD+NADHNAD+NAD+NADHLactate2,3-BDNADHNAD+甘油脱水酶1,3-PD氧化还原酶46用代谢工程手段提高用代谢工程手段提高1,3-PDO产量的策略产量的策略优化主要代谢途径：改善限速途径，提高关键酶的表达量；对竞争性途径的遗传性阻断(Genetic blockage)；加强碳源向主要代谢途径的转移；根据需要修改次级代谢途径，以加强能量代谢和增加必需的酶活辅助因子。47两种辅酶调控策略对两种辅酶调控策略对K.pneumoniae生长代谢的影响生长代谢的影响K.pneumoniae YMU2出发菌株出发菌株K.pneumoniae OF-1导入了甲酸导入了甲酸/甲酸甲酸脱氢酶：脱氢酶：NADH再生系统再生系统K.pneumoniae DA-1HB醛脱氢酶失活醛脱氢酶失活48优化条件下结果比较优化条件下结果比较 菌株菌株YMU2OF-1DA-1HB发酵时间发酵时间/h666666生物量生物量/g/l3.633.472.33胞内胞内NADH/NAD/mol/mol0.51.00.51.02.53.5甘油消耗量甘油消耗量/mmol/l2171.82837.61478.81,3-PD/mmol/l 或或 g/l786.2(60)1092.5(83)1026.3（78）乙醇乙醇/mmol/l227.7266.436.8乙酸乙酸/mmol/l42.143.9149.8乳酸乳酸/mmol/l80.188.254.92,3-丁二醇丁二醇/mmol/l56.655.849.4琥珀酸琥珀酸/mmol/l27.737.69.61,3-PD比合成浓度比合成浓度/mmol/g细细胞胞216.6314.8440.51,3-PD合成速率合成速率/mmol/l/h11.9116.5515.551,3-PD得率得率/mol/mol0.3620.3850.69449综合设计策略：综合设计策略：1,3-丙二醇丙二醇3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛丙酮酸丙酮酸葡萄糖葡萄糖TCA循环循环磷酸二磷酸二羟丙酮羟丙酮3-磷酸磷酸甘油甘油甘油甘油酵母的甘油途酵母的甘油途径径大肠杆菌自身的代谢途径大肠杆菌自身的代谢途径1,3-丙二醇丙二醇3-羟基羟基丙醛丙醛肺炎杆菌的肺炎杆菌的1,3-丙二醇途径丙二醇途径 修饰了修饰了70个基因，最后工程菌中有个基因，最后工程菌中有18个基因被敲除或过量表达个基因被敲除或过量表达 1,3-丙二醇产量丙二醇产量135 g/L，生产率，生产率3.5 g/L/h50代谢工程的局限Although clear breakthroughs have been achieved in the past,progress in metabolic engineering has been largely limited to individual pathways or relatively simple networks.Engineering of complex metabolic networks has been hampered by the insufficient biological information and global analytical tools.系统生物学系统生物学51谢谢！谢谢！52
