【生物】基因工程的基本操作程序第1课时课件 2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序课前回顾课前回顾课前回顾课前回顾1.1.重组重组DNADNA技术的基本工具？工具酶？技术的基本工具？工具酶？2.2.限制酶的来源？本质？限制酶的来源？本质？作用？作用的化学键？结果？作用？作用的化学键？结果？3.3.DNADNA连接酶的本质？作用？连接酶的本质？作用？作用的化学键？作用的化学键？种类？种类？4.4.载体的种类？载体的种类？5.5.什么是质粒？什么是质粒？作为载体需要的条件？作为载体需要的条件？6.6.DNADNA粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第三章基因工程第三章基因工程第第3.23.2节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 19971997年，我国政府首次批准商业化种植转基因年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉抗虫棉。到。到20152015年，年，我国已育成转基因抗虫棉新品种我国已育成转基因抗虫棉新品种100100多个，减少农药用量多个，减少农药用量4040万吨，增收万吨，增收节支社会经济效益节支社会经济效益450450亿元。亿元。转基因抗虫棉与普通棉花转基因抗虫棉与普通棉花转基因抗虫棉与普通棉花转基因抗虫棉与普通棉花棉花的抗虫基因哪里来的？主要是棉铃虫基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序资资料料：苏苏云云金金杆杆菌菌通通过过产产生生苏苏云云金金杆杆菌菌伴伴胞胞晶晶体体蛋蛋白白（BtBt抗抗虫虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。将将“杀虫基因杀虫基因”转入棉花中，棉花产生转入棉花中，棉花产生BtBt抗虫蛋白抵抗虫害。抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因目的基因BtBt抗虫蛋白基因抗虫蛋白基因BtBt基因基因BtBt基因基因补充：当BtBt抗抗虫虫蛋蛋白白被分解为多肽后,多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。BtBt抗抗虫虫蛋蛋白白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性,而人和牲畜的胃液呈酸性,肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响表达(转录、翻译)Bt抗虫蛋白基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序与载体与载体拼接拼接普通棉花（无抗虫特性）（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉（有抗虫特性）（有抗虫特性）导入导入抗虫基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定从社会中来基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的筛选与获取目的基因：用于用于改变受体细胞性状改变受体细胞性状或或获得预期表达产物获得预期表达产物等的基因等的基因。主要是主要是编码编码蛋白质蛋白质的的基因基因 根据不同的需要，根据不同的需要，目的基因是不同的目的基因是不同的 资料一资料一 棉花本身不具有抗虫基因棉花本身不具有抗虫基因。苏云金杆菌有一种抗虫基因，能。苏云金杆菌有一种抗虫基因，能 表达出抗虫蛋白来杀死棉铃虫。利用表达出抗虫蛋白来杀死棉铃虫。利用基因工程将抗虫基因导基因工程将抗虫基因导 入棉花细胞，培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种入棉花细胞，培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种。资料二资料二 胰岛素是治疗糖尿病的特效药。健康人含有胰岛素基因，能胰岛素是治疗糖尿病的特效药。健康人含有胰岛素基因，能 表达胰岛素，从而降低血糖浓度。表达胰岛素，从而降低血糖浓度。大肠杆菌本身不具有胰岛大肠杆菌本身不具有胰岛 素基因素基因。19781978年，科学家年，科学家将编码人胰岛素的基因导入大肠杆将编码人胰岛素的基因导入大肠杆 菌细胞中，使大肠杆菌表达重组人胰岛素菌细胞中，使大肠杆菌表达重组人胰岛素。什么是目的基因？基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的筛选与获取实例实例如生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。如生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。人胰岛素基因、人胰岛素基因、人干扰素基因等人干扰素基因等抗虫基因、抗虫基因、抗病基因、抗病基因、抗除草剂基因等抗除草剂基因等基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的筛选与获取如何筛选目的基因？苏云金杆菌的杀虫作用与苏云金杆菌的杀虫作用与BtBt基因有关基因有关掌握了掌握了BtBt基因的序列信息基因的序列信息对对BtBt基因的表达产物基因的表达产物-BtBt抗虫蛋白有较为深入了解抗虫蛋白有较为深入了解苏云金杆菌制成的生物杀苏云金杆菌制成的生物杀虫剂可防治棉花虫害虫剂可防治棉花虫害BtBt基因是培育转基因基因是培育转基因抗虫棉的目的基因抗虫棉的目的基因基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。DNA测序仪测序仪核苷酸序列比对核苷酸序列比对氨基酸氨基酸序列比对序列比对序列数据库序列数据库明确了目的基因后，该怎么获得它?第一步：目的基因的筛选与获取u越来越多基因的越来越多基因的结构结构和和功能功能被分析。被分析。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的目的基因的获取获取人工合成人工合成目的基因获取方法：目的基因获取方法：利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增（常用）（常用）构建基因文库构建基因文库p82p82基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的目的基因的获取获取利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因提取提取提取提取苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌抗虫基因抗虫基因？快速获得大量抗虫基因快速获得大量抗虫基因PCRPCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应 PCRPCR是是一一项项根根据据DNADNA半半保保留留复复制制的的原原理理，在在体体外外提提供供参参与与DNADNA复复制制的的各各种组分与反应条件种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序12345 C12345 GTGCCGTAA5353基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序体内体内DNADNA复制要点回顾复制要点回顾条件条件原料：游离的原料：游离的4 4种脱氧核苷酸（种脱氧核苷酸（A A、T T、G G、C C）模板：模板：DNADNA的两条链的两条链酶：解旋酶、酶：解旋酶、DNADNA聚合酶等聚合酶等能量：能量：ATPATP复制原则：复制原则：碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的获取获取获取获取利用利用利用利用PCRPCRPCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因1 1、概念：概念：参与的组分参与的组分在在DNADNA复制中的作用复制中的作用解旋酶（体外用解旋酶（体外用高温高温代替）代替）打开打开DNADNA双链（断开氢键）双链（断开氢键）DNADNA母链母链（2 2条）条）提供提供DNADNA复制的模板复制的模板4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸合成合成DNADNA子链的原料子链的原料耐高温耐高温DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）催化合成催化合成DNADNA子链（形成磷酸二酯键）子链（形成磷酸二酯键）引物引物（2 2种，分别与两条母链结合种，分别与两条母链结合）使使DNADNA聚合酶能够从引物聚合酶能够从引物3333端连接脱氧核苷酸端连接脱氧核苷酸缓冲溶液（缓冲溶液（MgMg2+2+）激活激活DNADNA聚合酶的活性聚合酶的活性2 2、条件条件:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序引物引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为2030个核苷酸。体内复制的引物为体内复制的引物为RNARNA单链（复制结束后被降解）单链（复制结束后被降解）使DNA聚合酶从引物3端开始连接脱氧核苷酸，延伸形成子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)a.什么是引物b.引物的作用基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序使DNA聚合酶从引物3端开始连接脱氧核苷酸，延伸形成子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)b.引物的作用535353引物引物子链延伸子链延伸35基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的获取获取获取获取利用利用利用利用PCRPCRPCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）DNADNA模板模板引物引物稳定的缓冲溶液稳定的缓冲溶液（一般添加（一般添加MgMg2+2+）四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸激活激活真核细胞和细菌的真核细胞和细菌的DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR条件条件:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的获取获取获取获取利用利用利用利用PCRPCRPCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因PCRPCR过程过程335 5335 5335 5335 5A.A.变性变性 当温度上升到当温度上升到9090以上以上时，时，双链双链DNADNA解聚为单链解聚为单链B.B.复性复性当温度下降到当温度下降到5 500左右左右时，时，两种引物通过两种引物通过碱基互补配对碱基互补配对与两条单链与两条单链DNADNA结合结合C.C.延伸延伸当温度上升到当温度上升到7272左右左右时，时，溶液中溶液中的的4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸在在耐高温的耐高温的DNADNA聚聚合酶合酶的作用下，根据的作用下，根据碱基互补配对碱基互补配对原则原则合成新的合成新的DNADNA链链335 5335 5335 5335 5335 5335 5335 5335 5基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的获取获取获取获取利用利用利用利用PCRPCRPCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因第一轮循环的第一轮循环的产物产物作为第二轮反应的作为第二轮反应的模板模板，经过，经过变性、变性、复性复性和和延伸延伸三步产三步产生第二轮循环的产生第二轮循环的产物；物；第二轮循环的第二轮循环的产物产物作为第三作为第三轮反应的轮反应的模板模板，经过经过变性、复变性、复性和延伸性和延伸三步三步产生第三轮的产生第三轮的产物；产物；第二轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物第三轮的产物完成以后，完成以后，常采用常采用琼脂琼脂糖凝胶电泳糖凝胶电泳来鉴定来鉴定PCRPCR的的产物产物PCRPCR过程过程基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序问问1 1：1 1个模板个模板DNADNA分子经过分子经过n n轮轮PCRPCR，可以扩增出，可以扩增出 个个DNADNA片段，片段，即即以以_形式扩增形式扩增。指数指数2 2n n问问2 2：1 1个模板个模板DNADNA分子经过分子经过n n轮轮PCRPCR，则共需消耗多少个引物？则共需消耗多少个引物？共需消耗2 2n n1 12 2个引物个引物 =2n1对引物。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序DNA解聚为单链引物结合到互补DNA母链Taq酶从引物3端延伸合成子链PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。PCRPCR过程过程基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序比较项目比较项目细胞内细胞内DNADNA复制复制PCRPCR技术技术区区别别解旋解旋方式方式解旋酶催化边解旋边复制DNA在高温下变性解旋全部解旋后再复制场所场所主要在细胞核内体外(主要在PCR扩增仪内)酶酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶温度温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果结果合成整个DNA分子大量特定DNA片段或基因联系联系模板模板:均需要DNA两条链作为模板原料原料:均为四种脱氧核苷酸酶酶:均需DNA聚合酶引物引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3端连接脱氧核苷酸基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序用用PCRPCR可以扩增可以扩增mRNAmRNA吗吗？不可以（不可以（TaqTaq酶以酶以DNADNA为模板，且为模板，且RNARNA不稳定，需要不稳定，需要逆转录逆转录成成cDNAcDNA再进行再进行扩增。扩增。1.1.逆转录酶逆转录酶以以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补的互补的DNADNA链链，形成，形成RNA-DNARNA-DNA杂杂交分子交分子；2.2.核酸酶核酸酶H H降解降解RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链链，使之变成，使之变成单链单链DNADNA；3.3.以单链以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下合成另一条互补的的作用下合成另一条互补的DNADNA链，链，形成形成双链双链DNADNA分子分子基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序A ACGGC T T A AT T1.用于PCR扩增的DNA片段往往为了保证目的基因的完整，经切割后目的基因的两端会有一小段非基因序列，其也可能随目的基因一起扩增。PCR技术扩增目的基因时至少要经过几次循环才能从中分离两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第一次循环90以 上，DNA双链解开(变 性)50左右，引物与DNA结合（复性）72左右，新DNA合成（延伸）355355基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第二次循环535535高温变性低温复性中温延伸高 温 变 性基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第三次循环35低 温 复 性中 温 延 伸基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序A ACGGC T T A AT Tl用于PCR扩增的DNA片段往往为了保证目的基因的完整，经切割后目的基因的两端会有一小段非基因序列，其也可能随目的基因一起扩增。PCR技术扩增目的基因时至少要经过几次循环才能从中分离两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？3次基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2.2.设计引物是设计引物是PCRPCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部只标注了部分碱基序列分碱基序列)都不合理都不合理(如下图如下图)，请分别说明理由。，请分别说明理由。(1 (1）第）第1 1组：组：；第第2 2组：组：。引物引物和引物和引物局部发生碱基互补配对而失效局部发生碱基互补配对而失效引物引物自身内部部分碱基发生互补配对而失效自身内部部分碱基发生互补配对而失效