DB35∕T 2132-2023 实验用秀丽隐杆线虫 饲育技术(福建省).pdf

ICS 07.080 CCS B 44 35 福建省地方标准 DB35/T 21322023 实验用秀丽隐杆线虫 饲育技术 Experimental Caenorhabditis elegansRearing technique 2023-10-25 发布 2024-01-25 实施福建省市场监督管理局 发 布DB35/T 21322023 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 人员.1 5 环境与设施.2 6 引种与保种.2 7 繁育.3 8 饲养.4 9 消毒与感染防控.6 10 废弃物处理.6 11 记录与档案.6 附录 A（资料性）仪器设备及耗材.7 附录 B（资料性）培养基及试剂.9 附录 C（资料性）雄虫及雌雄同体虫的形态结构图.11 附录 D（资料性）线虫的生长周期.13 附录 E（资料性）OP50 的培养.14 附录 F（资料性）线虫易感染的微生物和寄生虫.15 参考文献.16 DB35/T 21322023 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由福建上源生物科学技术有限公司提出。本文件由福建省科技厅归口。本文件起草单位：福建上源生物科学技术有限公司、福建农林大学、福建师范大学。本文件主要起草人：赵培、张壬辉、陈岚彬、张积森、林晨韬、郑惠、卞文印、蔡栋灵。DB35/T 21322023 1 实验用秀丽隐杆线虫 饲育技术 1 范围 本文件规定了实验用秀丽隐杆线虫（以下简称“线虫”）饲育过程中人员、环境与设施、引种与保种、繁育、饲养、消毒与感染防控、废弃物处理、记录与档案等技术要求。本文件适用于实验用秀丽隐杆线虫的饲育。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和实验方法 GB 149252010 实验动物 环境及设施 GB/T 347912017 实验动物 质量控制要求 JG/T 292 洁净工作台 SN/T 4835 实验室生物废弃物管理要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans 秀丽隐杆线虫属于线形动物门（Nemathelminthes），线虫纲（Nematoda），小杆线虫目（Rhabditida），广杆线虫属（Caenorhabditis），食细菌的线形动物，对人体无毒无害，安全的实验动物。大肠埃希氏菌 OP50 Escherichia coli OP50（E.coli OP50）尿嘧啶缺陷型大肠杆菌。幼虫期线虫 larval phase Caenorhabditis elegans 未性成熟的线虫，分为一龄（L1）、二龄（L2）、三龄（L3）、四龄（L4）四个时期。耐受期线虫 dauer phase Caenorhabditis elegans L2时期线虫在逆境条件下发育而成的滞育线虫。4 人员 一般要求 DB35/T 21322023 2 按照GB/T 347912017中规定的人员技术指标执行。管理人员 包括设施负责人、技术负责人和质量负责人，应经过专业培训，掌握线虫的生理、生态习性和专业知识，满足岗位技能要求。饲育人员 身体健康，并接受过专业培训，熟练掌握操作技能。5 环境与设施 设施 设施的外部环境、工艺布局及其暖通空调、给排水、供电照明、通讯监控、消防等按GB 149252010中普通环境的要求执行。设备及试剂耗材 饲育所需的仪器设备及耗材见附录A。区域布局 5.3.1 布局 各区域之间应规定合理的人员流动路线，辅助功能区和饲育区应分开。5.3.2 辅助功能区 包括称量区、灭菌区、制板区、食物制备区、废弃物品处理区等。5.3.3 饲育区 用于线虫饲养繁育的区域。环境 5.4.1 技术指标 饲育区环境指标按照GB 149252010的相关规定执行。5.4.2 监测方法 设施环境指标监测方法按照GB 149252010的相关规定执行。6 引种与保种 引种 满足以下要求：DB35/T 21322023 3 应从正规种质资源库进行引种，以获取遗传背景明确的线虫种质资源；引种过程应建立包括种名、来源、引种日期等信息的档案；境外引种时应按国家相关规定执行。保种 6.2.1 线虫的选取 应选取L1幼虫期线虫或耐受期线虫进行长期保种。6.2.2 保种条件 温度低于80。6.2.3 保种方法 线虫的保种应采用超低温冻存技术，应满足以下要求：冻存液选用 S 缓冲液 1 和含有 30甘油的 S 缓冲液 2，详细配方见附录 B；冻存器材选用冻存管、梯度降温盒；冻存液中收集的线虫密度宜为每 1 ml 冻存液中包含 6001 000 只线虫，每支冻存管中分装 1 mL；冻存管在80 冰箱的临时保存区梯度降温至80；冻存管梯度降温完成后转移至80 冰箱或液氮罐的长期保存区。6.2.4 冻存合格检测标准 冻存24 h后，取同一批次冻存的线虫，在37 半融化后，迅速转移到线虫生长培养基（NGM）培养皿中观察，复苏后的线虫存活率应高于20。6.2.5 保种年限 根据需求，宜选择以下方式进行保存：在80 冰箱能保存 10 年；在液氮中能长期保存。7 繁育 自体受精繁育 线虫有雄性及雌雄同体两种性别。雌雄同体虫既能产生精子，又能产生卵子，可以在无雄虫存在的情况下进行自体受精繁育。交配繁育 7.2.1 交配线虫的选取 7.2.1.1 雄虫 DB35/T 21322023 4 体长约为0.8 mm，在22 培养条件下培养3天的年轻雄虫（附录C）。在正常培养条件下，雄虫在群体中的比例为13。为获取足够的交配雄虫，宜将L4幼虫期线虫中的雌雄同体线虫置于30 条件下热激6 h8 h，后代中将产生23的雄虫。7.2.1.2 雌雄同体 整体外观符合线虫的显微形态学表型的年轻雌雄同体成虫（附录 C）。7.2.2 交配原则 应满足以下要求：雄虫和雌雄同体的比例按为 11 或 21；交配两天后，待培养皿中的子代发育到 L4 时期之前，将用于杂交的亲本雄虫尽数挑出。7.2.3 交配成功的判定 交配成功时，后代中应有至少3雄虫。繁育合格指标 7.3.1 卵的质量 卵为颗粒状，钝椭圆形，饱满且富有光泽；卵内幼胚应具备与发育时期一致的正常的显微形态学特征。7.3.2 生长周期 22 且相对湿度范围为4080培养条件下线虫的生长周期如附录D所示。7.3.3 特征及表型 繁育合格的线虫应满足以下要求：整体外观符合线虫的显微形态学表型（附录 C 和附录 D）；无行动障碍，爬行轨迹呈正弦曲线；L4 阶段的雌雄同体线虫在腹侧中心能看到一个清晰的半圆形亮斑；L4 阶段的雄虫尾部尖端向前扩展，至成虫发育为带交配器官的独特扇形尾部。7.3.4 繁殖能力 每只雌雄同体虫自交产250300只后代，雄虫和雌雄同体虫杂交产9501 050只后代。8 饲养 固体饲养 8.1.1 培养基及食物 培养基及食物的要求如下：固体饲养应用 NGM 培养基（见附录 B）；线虫以大肠埃希氏菌 OP50（以下简称 OP50）为食，培养方法见附录 E。DB35/T 21322023 5 8.1.2 线虫转板 根据需要，宜采用以下方式进行线虫转板：使用挑虫器在固体培养基上挑取线虫至新的 OP50-NGM 培养皿中；用灭菌的解剖刀，从 OP50-NGM 培养皿中切取带线虫的琼脂块，置于新的 OP50-NGM 培养皿中。8.1.3 容器选择 根据实验需求，宜选3.5 cm、6 cm、9 cm等大小的培养皿。8.1.4 饲养密度 每1 cm2 OP50菌苔上饲养的线虫数量宜为2只，培养3 d5 d 后（食物耗尽前）进行转板。液体饲养 8.2.1 培养液及食物 培养液及食物的要求如下：液体饲养应用 S 培养基（见附录 B）；线虫以 OP50 为食，培养方法见附录 E。8.2.2 线虫转移 应使用移液器进行转移，且移液器的吸头宜为玻璃材质。8.2.3 容器选择 根据实验需求，宜选无菌三角瓶、无菌24孔板、96孔板等。8.2.4 饲养密度 饲养密度满足以下要求：每 1 mL S 培养基中添加 50 mg 的 OP50，能供 2 只线虫生长 3 d5 d；培养过程应注意观察线虫生长状况，并根据需要在食物耗尽前添加 OP50 或进行转移。饲养的技术指标 8.3.1 操作要求 操作符合以下要求：挑取线虫时，动作应轻柔细致，从线虫的腹侧下方轻轻挑取，避免挑虫器损伤线虫；每次挑取线虫前，挑虫器应在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却 3 s5 s 后使用；线虫的转板及转移操作应在洁净工作台中进行。8.3.2 饲养条件 饲养的各类条件应符合以下要求：生长温度在 15 25 之间，最常使用的培养温度是 20；相对湿度在 4080；光照不超过 30 lx；DB35/T 21322023 6 固体饲养的线虫置于洁净的恒温培养箱中，液体饲养的线虫置于恒温摇床中，恒温摇床的震荡频率为 100 r/min200 r/min。9 消毒与感染防控 消毒管理 定期对设施设备进行清洁消毒。微生物与寄生虫处理 在人工饲育过程中，如线虫表现出被微生物或寄生虫感染的表型，对感染线虫进行销毁处理。线虫易感染的微生物和寄生虫见附录F。10 废弃物处理 产生的生物废弃物和污水按照SN/T 4835的规定进行无害化处理，其他实验室废弃物按照相关规定进行处理。11 记录与档案 记录 记录培养温度、相对湿度、线虫发育情况等。标识 饲育容器应标记饲育日期、繁育方法、饲育条件等。档案 应满足以下要求：建立人员培训计划和培训档案；建立设备维护、使用档案；建立线虫冻存档案，记录冻存时间、编号；档案保存不少于 3 年。DB35/T 21322023 7 A A 附录A （资料性）仪器设备及耗材 A.1 仪器设备 A.1.1 恒温培养箱 培养箱材质无毒、无害、无放射性，并配有温度控制系统，方便在0 60 温度范围内调节箱内温度。A.1.2 体视显微镜 放大倍数在550倍之间。A.1.3 恒温摇床 摇床材质无毒、无害、无放射性。配有温度控制系统，能够在10 60 温度范围内调节箱内温度；震荡频率调节范围为 0 r/min300 r/min。A.1.4 高压灭菌锅 高压灭菌锅材质耐热、耐腐蚀、无放射性，最高灭菌工作温度不低于130。A.1.5 移液器 能够精确地移取一定体积的液体。A.1.6 酒精灯 防爆不锈钢酒精灯。A.1.7 挑虫器 挑虫器由铂金丝和手柄两部分组成，铂金丝一端压成铲形，另一端固定在手柄上。A.1.8 洁净工作台 洁净工作台的性能达到JG/T 292中的规定。A.1.9 80 冰箱 提供80 条件的超低温冰箱。A.1.10 液氮罐 液氮储存罐。A.2 耗材 A.2.1 培养皿 无毒、无害、无放射性、无菌。DB35/T 21322023 8 A.2.2 多孔板 无毒、无害、无放射性、耐腐蚀、无菌。常用规格有96孔板、24孔板和12孔板等。A.2.3 三角瓶 无毒、无害、无放射性、耐腐蚀、无菌。常用规格有50 mL、150 mL、500 mL、1 000 mL等。A.2.4 梯度降温盒 提供每分钟降低1 的冷却速率，能够成功进行低温冻存和恢复。A.2.5 冻存管 用于80 和液氮中长期储存。DB35/T 21322023 9 B B 附录B （资料性）培养基及试剂 B.1 双蒸水 配制培养基及试剂的双蒸水达到 GB/T 66822008中三级水或以上的规格要求。B.2 LB 培养基 B.2.1 LB液体培养基 1 g胰蛋白胨，0.5 g酵母粉，1 g氯化钠（NaCl），加入双蒸水定容至100 mL，121 C、0.107 MPa灭菌20 min。B.2.2 LB固体培养基 1 g胰蛋白胨，0.5 g酵母粉，1 g NaCl，2 g琼脂，加入双蒸水定容至100 mL，用1 M氢氧化钠（NaOH）调pH到7.5，121 C、0.107 MPa灭菌20 min。倒入无菌培养皿中，凝固冷却。B.3 NGM 培养基 2.5 g酪蛋白胨，17 g琼脂粉，3 g NaCl，加入975 mL的双蒸水，121 C、0.107 MPa灭菌20 min。冷却至55 后，加入下列溶液（胆固醇溶液过滤除菌，其余溶液在121 C、0.107 MPa 灭菌20 min）。1 mL 5 mg/mL 溶解于无水乙醇的胆固醇溶液 1 mL 1 M 氯化钙（CaCl2）溶液 1 mL 1 M 硫酸镁（MgSO4）溶液 25 mL 1 M 磷酸盐溶液（108.3 g 磷酸二氢钾（KH2PO4），35.6 g 磷酸氢二钾（K2HPO4），加入 1 000 mL 的双蒸水）在培养基凝固前分装至无菌培养皿中，从而制成空白的NGM皿。B.4 M9 溶液 6 g磷酸氢二钠（Na2HPO4），3 g K2HPO4，5 g NaCl，0.25 g七水硫酸镁（MgSO47H2O），加入双蒸水定容至1 000 mL，121 C、0.107 MPa 灭菌20 min。B.5 冻存液 B.5.1 S缓冲液1 129 mL 0.05 M K2HPO4，871 mL 0.05 M KH2PO4，5.85 g NaCl，121 C、0.107 MPa灭菌20 min。B.5.2 S缓冲液2（含30甘油）700 mL S缓冲液1，300 mL无菌甘油，混匀。B.6 液体培养基 B.6.1 S-basal基础培养液 DB35/T 21322023 10 5.85 g NaCl，1 g K2HPO4，6 g KH2PO4，加入999 mL的双蒸水，121 C、0.107 MPa灭菌20 min，再加入1 mL 5mg/mL溶解于无水乙醇的胆固醇溶液（过滤除菌）。B.6.2 微量金属溶液 1.86 g乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2），0.69 g七水硫酸亚铁（FeSO47H2O），0.2 g四水氯化锰（MnCl24H2O），0.29 g七水硫酸锌（ZnSO47H2O），0.025 g五水硫酸铜（CuSO45H2O），加双蒸水定容至1 000 mL，121 C、0.107 MPa灭菌20 min，避光保存。B.6.3 S培养基 1 L S-basal基础培养液，10 mL 1 M pH 6.0柠檬酸钾溶液，10 mL微量金属溶液，3 mL 1 M CaCl2，3 mL 1 M MgSO4，上述所有溶液均在 121 C、0.107 MPa 灭菌 20 min，并在无菌条件下混匀。DB35/T 21322023 11 C C 附录C （资料性）雄虫及雌雄同体虫的形态结构图 C.1 雄虫 雄虫的形态结构如图C.1所示。标引序号说明：A成年雄虫解剖模式图；B相差干涉显微镜拍摄的成年雄虫全长；C放大的生殖腺远端；D放大的雄虫尾部。注：图中标尺为0.1 mm。图C.1 秀丽隐杆线虫雄虫（成虫）形态结构 DB35/T 21322023 12 C.2 雌雄同体虫 雌雄同体虫的形态结构如图C.2所示。标引序号说明：A用相差干涉显微镜拍摄的雌雄同体虫；B雌雄同体虫解剖模式图。注：图中标尺为0.1 mm。图C.2 秀丽隐杆线虫雌雄同体（成虫）形态结构 DB35/T 21322023 13 D D 附录D （资料性）线虫的生长周期 卵：线虫的胚胎发生在母体子宫中就已开始，从母体产出的卵大约处在30个细胞期。胚胎发生完成后孵化出一龄幼虫（L1），约550个细胞。每个雌雄同体成虫能产250300个卵，用解剖镜观察NGM培养皿上的卵，为颗粒状，钝椭圆形，富有光泽。幼虫：在22 的培养条件下，野生型秀丽隐杆线虫产出的卵经过大概9 h即孵化成L1。线虫的幼虫分为4个阶段，分别为一龄、二龄、三龄及四龄幼虫（L1，L2、L3、L4）。从L1发育至L4需经历三次蜕皮：L1发育至L2约需12 h，L2发育至L3约需8 h，L3发育至L4约需8 h。当遇到群体密度很大且食物缺乏，或温度偏高等不利环境条件时，L2不发生蜕皮，不发育为L3，而是成为耐受期线虫，耐受期线虫是为抵御不良环境，如干燥等条件特化而成。在解剖镜下，耐受期线虫体型比L3小，一般不动，但遇干扰，则蠕动得比L3快，耐受期线虫能生存几个月。当食物条件恢复后，耐受期线虫不经过L3幼虫，直接发育成L4幼虫，这一特点能用于线虫的短期保存。成虫：L4最后一次蜕皮成为年轻的成虫约需10 h，年轻的成虫最后发育成成熟的成虫约需8 h。野生型秀丽隐杆线虫的雌雄同体成虫在20 培养条件下，寿命大概为21天。线虫在25 的生长速度是15 的2.1倍，在20 的生长速度是15 的1.3倍。线虫的生长周期如图D.1所示。图D.1 线虫的生长周期DB35/T 21322023 14 E E 附录E （资料性）OP50 的培养 线虫是以OP50为食，OP50具有尿嘧啶缺陷，在NGM培养皿上不可无限生长。LB液体培养基即能满足OP50的繁殖。LB琼脂固体培养皿能用于OP50菌株单克隆的划线分离和保存。培养皿可置于4 保存备用。OP50的扩增：取出保存OP50单克隆的培养皿，用无菌牙签挑取一个克隆到100 mL LB液体培养基中，于37 摇床过夜振荡培养(220 r/min)。培养好的OP50菌液即能作为线虫的食物使用，并能在4 保存4周。OP50的质量控制：每批次扩增的OP50均进行一次质量检测。质量符合如下要求：OP50菌落呈圆形，表面光滑湿润而具闪光，微凸起，边缘整齐。DB35/T 21322023 15 F F 附录F （资料性）线虫易感染的微生物和寄生虫 线虫易感染的微生物和寄生虫见表F.1。表F.1 线虫易感染的微生物和寄生虫 项目 感染表型 微生物 苏云金芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis线虫体壁和肠道结构退化；整体表现出生长抑制、后代数量减少、产生异常活动，甚至出现致死性 圆锥掘氏梅里霉 Drechmeria coniospora线虫体型变成不规则凸起状；而后菌丝穿透线虫表皮导致线虫被固定而无法运动，最后导致线虫死亡 白杆菌 Leucobacter Verde 1 生长缓慢；线虫液体培养时尾部黏连，最后导致死亡 白杆菌 Leucobacter Verde 2 肛门畸形 铜绿假单胞杆菌 Pseudomonas aeruginosa生长发育变缓、运动能力下降、产卵量减少和体内脂肪含量降低，严重时造成线虫大量死亡 寄生虫 微孢子虫 Nematocida parisii 较小的体型、生长缓慢、子代数明显减少、肠道细胞膜上出芽微孢子虫 Nematocida displodere 较小的体型、生长缓慢、子代数明显减少、外阴爆裂并喷发出孢子 注：被感染的线虫在显微镜下会呈现出特定的表型，能以此来判断线虫是否被感染。微生物种属鉴定参照16S核糖体RNA基因鉴定方法，寄生虫检测参照SN/T 52832020中检测方法。DB35/T 21322023 16 参考文献 1 SN/T 52832020 熊蜂微孢子虫检疫技术规范 2 http:/www.wormbook.org/3 https:/www.wormatlas.org/4 Woo PC,Lau SK,Teng JL,Tse H,Yuen KY.Then and now:use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories.Clin Microbiol Infect.2008 Oct;14(10):908-34.