DB22_T 3199-2020 螟黄赤眼蜂工厂化生产技术规程.docx

ICS 65.020B 15DB 22吉林省地方标准DB 22/T 31992020螟黄赤眼蜂工厂化生产技术规程Technical specification for industrialized production of Trichogramma chilonis Ishii×××× - 11 - 23 发布2020 - 12 - 30 实施吉林省市场监督管理厅发 布DB22/T 31992020目次前言 . II 1  范围 . 1 2  规范性引用文件 . 1 3  术语及定义 . 1 4  工厂化生产流程 . 2 5  生产前准备 . 2 6  工厂化生产 . 5 7  质量控制 . 6 8  记录档案 . 9 附录 A（资料性附录）  螟黄赤眼蜂形态学鉴定方法 . 10 IDB22/T 31992020前言本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：吉林农业大学、吉林省农业科学院、吉林省蚕业科学研究院。本文件主要起草人：杜文梅、张俊杰、阮长春、周淑香、朱兴友、毛刚。IIDB22/T 31992020螟黄赤眼蜂工厂化生产技术规程1  范围本文件规定了螟黄赤眼蜂产前准备、工厂化生产技术要求、质量控制、记录档案。本文件适用于柞蚕卵繁育螟黄赤眼蜂的工厂化生产和质量控制。2  规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 1166-2006生物防治用赤眼蜂DB22/T 1025-2018柞蚕良种繁育技术规程3  术语及定义NY/T 1166-2006 界定的以及下列术语和定义适于本文件，为了便于使用以下重复列出了 NY/T1166-2006 中的一些术语和定义。3.1单卵蜂数 number of host eggs parasitized每粒柞蚕卵内所寄生的螟黄赤眼蜂个体数。3.2寄生率 parasitism proportion被寄生的柞蚕卵数占供检测卵数的百分比。3.3羽化破壳率 rate of eggs with emergency holes指有羽化孔的中间寄主卵占总寄生卵的比例。NY/T1166-2006，术语及定义 2.16 3.4遗留蜂率 proportion of unemerged parasitoids滞留在柞蚕卵内成蜂数占总成蜂数的百分比。3.5畸形蜂率 deformed adults proportion指体形异常的成蜂数（如大肚子蜂、无翅蜂等成蜂）所占总蜂数的比例。NY/T1166-2006，术语及定义 2.24 3.6雌蜂百分比 female proportion单粒寄生卵中羽化的赤眼蜂雌性成蜂数占总成蜂数的百分比。1DB22/T 319920203.7D 值 D value赤眼蜂腹中突基部至阳基侧瓣末端的距离。3.8诱导滞育 diapause induction利用某种特定条件（如持续低温、短光照或全黑暗）诱导螟黄赤眼蜂稳定进入滞育状态的一个过程。3.9接蜂 inoculation将蜂种接引到中间寄主卵上的生产环节。NY/T1166-2006，术语及定义 2.4 4  工厂化生产流程图1  螟黄赤眼蜂工厂化生产流程图5  生产前准备5.1  生产计划制定每年的 11 月份  12 月份，根据市场需求制定生产计划，并根据虫情预测预报信息和实际情况，及时调整，主要内容包括：a)  所需厂房、设备；b)  蜂种、蚕茧等生产资料；c)  用工数量和时间；d)  组织生产及应急保障措施。5.2  厂房及设备物质5.2.1  厂房应包括：a)  蜂种繁育室；2DB22/T 31992020b)  暖茧车间；c)  剖腹取卵室；d)  洗卵室；e)  消毒室；f)  暗室；g)  发育室；h)  保鲜冷藏库；i)  物品保存库。5.2.2  设备主要包括：a)  低温生化培养箱；b)  绞卵机；c)  搅拌器；d)  脱水机；e)  烘干机；f)  柞蚕卵色选机；g)  包装机；h)  空调；i)  排风机；j)  电暖气；k)  加湿器；l)  温湿度自控仪；m)  电脑几打印机；n)  发育盘架；o)  手推运输车。5.2.3  常用药品及材料主要包括：a)  25 g/L  30 g/L 苯扎溴铵溶液（新洁尔灭消毒液）；b)  孔径尺寸 0.150 毫米的纱网；c)  孔径尺寸 2 毫米的纱网。5.3  蜂种5.3.1  采集在靶标害虫产卵季节，于不同地理环境广泛采集被赤眼蜂寄生的靶标害虫卵，并按不同地理位置进行标记，经室内培养，筛选出寄生率高、适应性强的蜂种。5.3.2  鉴定根据雄性赤眼蜂外生殖器的形态特征进行鉴定，按附录 A 执行。5.3.3  纯化3DB22/T 31992020对采自不同靶标害虫卵内的赤眼蜂进行如下筛选纯化：a)  在试管（10 毫米×70 毫米左右大小）中投放米蛾卵（100 粒为宜），再单头引入雌蜂，用棉球或纱布封口后置于发育室；b)  发育条件：光照 16 小时，（25±1 ）、RH （75±5）%；黑暗 8 小时，（20 ±1） 、RH （75±5）%；c)  羽化出蜂后按附录 B 逐管鉴定；d)  将确定为螟黄赤眼蜂的单管合并，继续繁殖。5.3.4  保存鉴定纯化的蜂种，经数代筛选繁殖，建立起一定数量的种群后保存使用：a)  将发育到幼虫中期的蜂种，置入 12 、RH （75±5）% 的条件下，诱导滞育 30 天；b)  置入 （3±1） 、RH （75±5）% 的条件下，进行解除滞育 60 天  90 天；c)  经 10  24 小时、15  24 小时 过渡后，按 4.3.3 b）变温发育至出蜂。5.4  柞蚕茧5.4.1  备茧应包括：a)  备茧时期：在生产前一年的 11 月  12 月份开始按预定计划备茧：b)  茧质要求：1)  健康雌茧率  90%；2)  雄茧率  7%；3)  死伤茧率  3%；4)  割口茧率  8%；5)  发育蛹和嫩蛹  5%；6)  茧层率  10%，无薄皮茧、瘪茧；7)  茧不潮、未接触 -3  以下低温。c)  备茧数量：按每繁 70 万头螟黄赤眼蜂用茧 1 kg 计算。5.4.2  蚕茧保存保存温度 (3±1) 、RH （60±5）%；适当通风换气，保持空气含氧量；防鼠害防农药，避免发热焐包，储存时间不低于 45 天。6  工厂化生产6.1  灭菌消毒在生产前一周，将所有繁蜂车间及繁蜂工具，进行集中消毒。消毒方法参照 DB 22/T 1025-2018 中8.3.3.1 执行。6.2  蜂种复壮根据生产计划，定期对螟黄赤眼蜂蜂种，以米蛾卵和柞蚕卵交替繁育复壮：a)  接蜂比例：米蛾卵蜂卵比 1：80，柞蚕卵蜂卵比 2:1；b)  接蜂时间： 24 小时  48 小时；4DB22/T 31992020c)  发育条件：同 4.3.3 b）；d)  复壮周期：33 天  38 天。6.3  蜂种扩繁以柞蚕卵为寄主，将蜂种扩繁 3 代  4 代：a)  接蜂比例：1：25 （蜂种寄生柞蚕卵：新鲜卵）；b)  接蜂时间：24 小时；c)  接蜂条件：全黑暗，（25±1） 、RH （75±5）%；d)  发育条件：同 4.3.3 b）；e)  将末一代蜂种发育至幼虫中后期置于（3±1）、RH （75±5）% 条件下冷藏，冷藏时间不超过 10 天。6.4  寄主卵6.4.1  暖茧发蛾暖茧室保持18   22 ，RH （70±5）%，20 天  25 天逐渐羽化出蛾。6.4.2  收蛾在柞蚕蛾羽化期内，每天下午开始将羽化的雄蛾挑检干净，次日清晨人工收雌蛾，用于当天繁蜂或储存在 （3±1）  的冷库中备用。6.4.3  剖腹取卵用人工方法将柞蚕雌蛾腹部与头胸部分离，然后用特制的绞卵机将腹部破碎或人工挤出卵巢。6.4.4  洗卵用搅拌器将卵与蛾腹内杂物搅拌分离，漂净杂物，然后反复用清水冲洗。6.4.5  卵面消毒将清洗干净的新鲜卵用 0.1% 的苯扎溴铵溶液浸泡 5 分钟。6.4.6  脱水晾卵消毒后的新鲜卵用布袋装好，用脱水机进行初步脱水，然后用烘干机烘干，温度不超过 28 。6.4.7  清除绿卵烘干的新鲜卵用色选机清除绿卵后，再用于接蜂，绿卵率不高于 4%。6.5  商品代接蜂蜂种与新鲜柞蚕卵按 1:15  1:20 比例进行接蜂。当蜂种羽化 25%  30% 时，将种蜂卵均匀撒在接蜂盘中，铺上孔径尺寸 2 毫米的纱网，再将新鲜卵定量平铺到纱网上，送入 （25±1） 、RH（75±5）% 的暗室内产卵寄生，48 小时后，逐盘去除蜂种，标明日期送入发育室发育。6.6  培养发育5DB22/T 31992020接蜂后的寄生卵分批次送入自然光照的变温发育室，按 4.3.3 b）培养 24 小时  48 小时，至幼虫中后期。6.7  寄生卵冷藏将发育至幼虫后期的螟黄赤眼蜂寄生卵，平铺到卵盘中置于冷库内货架上冷藏：a)  铺卵厚度 3 cm  4 cm；b)  冷库温度（3±1） 、RH （75±5）%，全黑暗；c)  冷藏时间控制在 30 天以内。6.8  寄生卵第 1 次加温根据害虫发生时间将螟黄赤眼蜂从冷库取出，采用分步渐变加温的方式促进发育：a)  在 （15±1） 、RH （75±5）% 全暗条件下加温 24 小时；b)  自然光照条件下，按 4.3.3 b）变温发育至预蛹期；c)  加温 11 天  12 天可羽化出蜂。6.9  寄生卵精选对发育至预蛹期的赤眼蜂寄生卵，用柞蚕卵色选机去除未寄生卵、劣质卵、绿卵及其他杂质。6.10  寄生卵第 2 次加温将精选后的寄生卵，置于发育室按 4.3.3 b）变温发育至蛹后期，再按 5.7 的方法冷藏，冷藏时间不超过 5 天。7  质量控制7.1  抽样及处理调查7.1.1  样本 A从每批精选后的柞蚕寄生卵中多点随机抽取样卵混匀，再按十字交叉法随机抽取 1000 粒标记为样本 A。7.1.2  样本 B在 A 样本中随机抽取 3 个 100 粒，分别装入试管中标记为 B1、B2、B3；将 B 样本发育至预蛹期后检查绿卵率、寄生率。7.1.3  样本 C在 A 样本中随机抽取 30 粒，装入试管中，发育至预蛹期后，随机抽取 10 粒寄生卵，分别标记为 C1、C2、C10 样本；利用解剖镜检查每个样本的单卵蜂数。7.1.4  样本 D在 A 样本中随机抽取 3 个 100 粒，分别装入试管中标记为 D1、D2、D3 样本；将 D 样本加温保湿使其羽化，检查羽化破壳率。7.1.5  样本 E6L =  ´100% . (A.1)DB22/T 31992020在 A 样本中抽取 20 粒寄生卵分装 20 个试管内，标记为 E1、E2E20 样本；将 E 样本加温保湿使其羽化，调查畸形蜂数、遗留蜂数、雌雄蜂数。7.2  检测7.2.1  绿卵率分别检测 B1、B2、B3 样本的绿卵数后按公式（A.1）计算，取 3 个样本的平均值为绿卵率（%）。xX式中：L绿卵率（%）；X检测卵数（100 粒）；x绿卵数（粒）；7.2.2  寄生率分别检测 B1、B2、B3 样本的寄生数后按照公式（A.2）计算，取 3 个样本的平均值为寄生率（%）。P =nN´100% . (A.2)式中：P寄生率 (%)；N检测卵数（检查完绿卵率后剩余的 B1、B2、B3 样本的卵数）（粒）；n寄生卵数 (粒)；7.2.3  单卵蜂数分别检测 C1、C2C10 样本的单卵蜂数后按公式（A.3）计算，取 10 个样本的平均值为单卵蜂数（头）。å (C + C . + CD =1 21010). (A.3)式中：D单卵蜂数（头）；C单卵蜂数（检查 C1、C2C10 样本的单卵蜂数）（头）。7.2.4  羽化破壳率分别检测 D1、D2、D3 样本的卵粒羽化孔数后按公式（A.4）计算，取 3 个样本的平均值为羽化破壳率（%）。Y =EE + R´100% . (A.4)式中：Y羽化破壳率（%）；E有羽化孔的卵数（粒）；R未羽化卵数（粒）。7.2.5  遗留蜂率7抽样检验项目优质合格不合格寄生率/%85.080.0  84.980.0羽化破壳率/%80.065.0  79.965.0绿卵率/%2.02.1  4.04.0单卵蜂数/头80.0  100.070.0  79.970.0遗留蜂率/%15.015.1  25.025.0畸形蜂率/%5.05.1  10.010.0雌蜂百分比/%85.080.0  84.980.0DB22/T 31992020分别检测 E1、E2E20 样本，按公式（A.5）计算，取 20 个样本的平均值为遗留蜂率（%）。F =MM + D´100% . (A.5)式中：F遗留蜂率（%）；M卵内滞留蜂数（头）；D羽化出壳蜂数（头）。7.2.6  雌蜂百分比分别检测 E1、E2E20 样本，按公式（A.6）计算，取 20 个样本的平均值为雌蜂百分比（%）。P =N1NI + N 2´100% . (A.6)式中：P雌蜂百分比（%）；N1雌蜂数（羽化雌蜂数）（头）；N2雄峰数（羽化雄蜂数）（头）。7.2.7  畸形蜂率分别检测 E1、E2E20 样本，按公式（A.7）计算，取 20 个样本的平均值为畸形蜂率（%）。J =QZ´100% . (A.7)式中：J畸形蜂率（%）；Q畸形蜂数（羽化出壳的畸形雌、雄蜂数之和）（头）；Z总蜂数（羽化出蜂总数，不包括遗留在卵壳内的遗留蜂）（头）。7.3  质量分级质量分级见表 1。表1  螟黄赤眼蜂质量分级标准8  记录档案8DB22/T 31992020建立螟黄赤眼蜂工厂化生产档案，对整个生产过程进行详实记录，保存两年以上，做到可追溯：a)  每天的温湿度记录；b)  每批次螟黄赤眼蜂的生产日期；c)  每批次螟黄赤眼蜂的加温日期；d)  每批次螟黄赤眼蜂的质量检验信息。9DB22/T 31992020AA附录A（资料性附录）螟黄赤眼蜂形态学鉴定方法A.1  制作鉴定玻片将用浓度 75%  95% 酒精浸泡的雄性赤眼蜂标本按下列方法制作为玻片：a)  在 5% 的 KOH 溶液中浸泡 8 小时  15 小时，并用水清洗干净，置于载玻片上；b)  在解剖镜下，用昆虫针挑取雄蜂的外生殖器，清除其他组织，盖好盖玻片；c)  在显微镜下观察并测量阳基背突、腹中突及 D 值。A.2  观察测量并鉴定在显微镜下观察赤眼蜂雄性外生殖器并测量其阳基背突、腹中突及 D 值，符合下列特征的属于螟黄赤眼蜂：a)  有明显的半圆形的侧叶，末端达 D 值的 1/2；b)  腹中突的长度约等于 D 值的 1/3，略成锥形；c)  钩爪末端伸达 D 值的 1/2。_10