DB22_T 3283-2021 猪血凝性脑脊髓炎病毒检测 TaqMan荧光定量PCR法.docx

ICS 11.220CCS B 41DB22吉林省地方标准DB22/T 32832021猪血凝性脑脊髓炎病毒检测TaqMan 荧光定量 PCR 法TaqMan quantitative PCR assay for detection of porcine hemagglutinatingencephalomyelitis virus2021 - 11 - 26 发布2021 - 12 - 15 实施吉林省市场监督管理厅发 布DB22/T 32832021前言本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本文件起草单位：吉林大学。本文件主要起草人：贺文琦、李姿、兰云刚、赵魁、关继羽、陆慧君、高丰。IDB22/T 32832021猪血凝性脑脊髓炎病毒检测TaqMan 荧光定量 PCR 法1  范围本文件描述了猪血凝性脑脊髓炎病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的原理、试验条件、试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。本文件适用于猪血凝性脑脊髓炎病毒的检测。2  规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫3  术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猪血凝性脑脊髓炎病毒porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV引 起 猪 血 凝 性 脑 脊 髓 炎 的 病 原 。 PHEV 为 不 分 段 的 单 股 正 链 RNA 病 毒 ， 属 于 冠 状 病 毒 科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Betacoronavirus）成员。4  原理根据PHEV S基因序列设计引物和探针，探针在5端标记FAM荧光素作为报告荧光基团，3端标记TAMRA作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥53的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。5  试验条件5.1  生物安全要求所有培养物和废弃物的处置应符合 GB 19489 规定。5.2  防污染措施防止污染措施应符合 GB/T 27401 规定。1名称序列（5-3）上游引物 FCCAGGATAAATTTCTGTGG下游引物 RAACCAGGACTAACCTTTGCTaqMan 探针（FAM）ATGTCCCCACCAAGTATGTTACAGCAAA（TAMRA）DB22/T 328320216  试剂或材料6.1  M-MLV 反转录酶，浓度为 200 U/L，-20  保存。6.2  Taq DNA 聚合酶，-20  保存。6.3  RNase 抑制剂，浓度为 40 U/L，-20  保存。6.4  Oligo（dT）18 引物，浓度为 50 U/L，-20  保存。6.5  dNTP 混合物，浓度为 2.5 mmol/L，-20  保存。6.6  氯仿，常温保存。6.7  异丙醇，常温保存。6.8  75 %乙醇，常温保存，使用前 -20  预冷。6.9  TRIzol 裂解液，常温或 4  保存。6.105×MLV 缓冲液 -20  保存。6.1110×PCR 缓冲液 -20  保存。6.12阳性对照样品，灭活 PHEV 的细胞培养物，Ct 值30。6.13阴性对照样品，正常小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a 细胞）、猪肾细胞（PK-15 细胞）等，或者经检测不含 PHEV 的健康猪脑、脊髓组织研磨液。6.14引物和探针见表 1。引物浓度均为 10 mmol/L，-20  避光保存，6 个月内使用。表1  引物和探针序列信息7  仪器设备7.1  冰箱，4  冰箱、-20  冰箱和 -70  超低温冰箱。7.2  高速冷冻离心机，可控温至 4 ，离心速度不低于 12 000 r/min。7.3  微量移液器，2 L、10 L、50 L、200 L 和 1 000 L。7.4  实时荧光定量 PCR 扩增仪。7.5  组织匀浆仪。7.6  超微量紫外分光光度计。7.7  水浴锅。7.8  离心管，1.5 mL 无 RNase 离心管。7.9  PCR 反应管，根据 PCR 扩增仪要求选择单管、八联排管或 96 孔荧光反应板。8  样品8.1  样品采集采集疑似猪血凝性脑脊髓炎病死仔猪的脑、脊髓。用灭菌剪刀和镊子剪取待检组织，装入一次性无菌塑料袋（自封袋），编号，置于冰盒或含有冰袋的保温箱中，密封运送至实验室待检。2试剂用量RNA模板1.0 gOligo（dT）18引物（100 mol/L）1.0 L5×MLV缓冲液4.0 LdNTP混合物（2.5 mmol/L）4.0 LRNase抑制剂（40 U/L）0.5 LM-MLV反转录酶（200 U/L）0.5 L无RNase H2O补至 20.0 LDB22/T 328320218.2  样品保存样品在 2 8  条件下保存应不超过 24 h，若长期保存应置于 -70  超低温冰箱（7.1）中，且避免反复冻融。9  试验步骤9.1  病毒 RNA 提取9.1.1  称取 1.0 g 待检样品于组织匀浆仪（7.5）中，加入 0.2 mL TRIzol 裂解液（6.9）匀浆，使用微量移液器（7.3）吸取至 1.5 mL 无 RNase 离心管（7.8）。9.1.2  另取 2 支 1.5 mL 无 RNase 离心管（7.8），分别加入阳性对照样品、阴性对照样品。9.1.3  向 9.1.1 和 9.1.2 离心管中加入 1 mL TRIzol 裂解液（6.9），剧烈振荡 15 s，室温静置 10 min。采用其他等效的 RNA 提取方法，按照试剂盒说明书进行。9.1.4  加入 200 L 预冷氯仿（6.6），振荡 15 s，冰上静置 10 min。9.1.5  4 条件下，高速冷冻离心机（7.2）12 000 r/min 离心 15 min。9.1.6  使用微量移液器（7.3）吸取上层无色水相于新的 1.5 mL 无 RNase 离心管（7.8）中。9.1.7  加入等体积预冷异丙醇（6.7），轻轻颠倒混匀，-20  条件下静置 30 min。9.1.8  4 条件下，高速冷冻离心机（7.2）12 000 r/min 离心 10 min，弃上清。9.1.9  加入 1 mL 预冷的 75 %乙醇（6.8），4  条件下，高速冷冻离心机（7.2）12 000 r/min 离心5 min。9.1.10重复 9.1.9 操作一次。9.1.11弃上清，滤纸吸干残余液体，室温干燥 2 min。9.1.12加入 20 L 无 RNase H2O 溶解，超微量紫外分光光度计（7.6）测定核酸浓度。冰浴保存备用。4  冰箱（7.1）保存不超过 8 h，长期保存应置于 -70  冰箱。9.2  cDNA 模板制备按表 2 中各组分依次加入PCR反应管（7.9），盖紧管盖后，瞬时离心 3 s，42  水浴锅（7.7）中水浴 1 h；70  水浴锅（7.7）中水浴 10 min；冰浴 2 min，-20  冰箱（7.1）保存备用。表2  反转录系配制表9.3  反应体系3试剂用量10×PCR缓冲液2.0 LdNTP混合物（2.5 mmol/L）2.0 L上游引物F（10 mmol/L）1.0 L下游引物R（10 mmol/L）1.0 LTaqMan探针（FAM）（10 mmol/L）1.0 LcDNA模板4.0-40.0 ngTaq DNA聚合酶0.5 L无RNase H2O补至 25.0 LDB22/T 32832021设定 PCR 反应管数（n+2）×3，其中 n 为待检样品数，设阳性对照样品（6.12）和阴性对照样品（6.13）各 1管，每个样品设置 3 次重复反应。按表 3 中各组分依次加入PCR反应管（7.9），盖紧管盖后，500 r/min瞬时离心 30 s。表3  PCR反应体系配制表9.4  反应参数将9.3中离心后的PCR反应管（7.9）放入实时荧光定量PCR扩增仪（7.4）内，记录样品摆放顺序。设定 TaqMan 荧光定量 PCR 检测 PHEV 核酸的反应参数：第一阶段，预读 50  2 min；第二阶段，预变性 95  3 min；第三阶段，95  15 s、60  30 s，40 个循环。荧光收集设置在每次循环 60  30 s 时进行。10  结果判定10.1  结果分析条件设定根据收集的 Ct 值判定结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准。10.2  质控标准10.2.1阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。10.2.2阳性对照 Ct 值30，并出现典型的扩增曲线。10.2.3如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次试验视为无效。10.3  结果描述及判定10.3.1  阴性判定无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无PHEV核酸，判定为阴性。10.3.2  阳性判定Ct 值 35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在PHEV核酸，判定为阳性。10.3.3  有效原则4DB22/T 3283202110.3.3.1Ct 值35，且出现典型扩增曲线的样品，建议复检。10.3.3.2若复检结果仍出现典型扩增曲线，判定为阳性。若无典型扩增曲线，判定为阴性。_5