(10.4)--基于高通量测序技术分析肠道...在酒精性肝损伤小鼠中的变化.pdf

基于高通量测序技术分析肠道菌群在酒精性肝损伤小鼠中的变化摘要 目的 建立酒精性肝损伤小鼠模型，分析其肠道菌群变化，并探讨小鼠酒精性肝损伤可能机制。方法 周龄小鼠随机分为对照组（组）和酒精组（组）。组使用 液体饲料喂养 后再给予单次酒精灌胃建立慢性加急性酒精性肝损伤模型。组使用液体对照饲料喂养，并给予等热量糊精灌胃。灌胃后 收集血清、肝脏和肠道组织以及粪便样本。检测血清丙氨酸氨基转移酶（）、天冬氨酸氨基转移酶（）、三酰甘油（）水平；肝脏肿瘤坏死因子（）、白细胞介素（）、水平；观察肝脏和肠道 染色病理改变；采用 高通量测序检测粪便 多样性、多样性及门、属水平物种构成变化。结果 与 组相比，酒精暴露导致小鼠血清、上升（），肝脏、升高（）。染色结果显示酒精暴露的小鼠肝脏出现脂肪空泡，有散在细胞坏死以及炎性浸润；肠道结构欠清晰、腺体萎缩，有炎症浸润。组小鼠肠道菌群结构改变，菌门水平上，厚壁菌门（）丰度升高（），菌属水平上，副萨特菌（）丰度减少（），且以梭菌属中的、为关键菌属。结论 酒精性肝损伤小鼠的肠道菌群构成发生变化，该变化可能与肝病发生相关。关键词 酒精；肠道菌群；肝损伤中图分类号 文献标志码 文章编号 （）：世界范围内，每年因饮酒造成的死亡人数超过 万，造成全球超过 的疾病负担。长期饮酒造成肝脏损伤，可发展为酒精性肝病（，）。在所有的肝脏疾病中发病率及病死率最高。越来越多证据表明，肠道菌群在肝脏疾病的发病过程中发挥重要作用。肝脏和肠道由门静脉相连，一旦肠道菌群发生紊乱，肠道稳态被破坏，过量肠道抗原进入肝脏，会导致肝脏免疫耐受失衡，造成肝脏病变和损伤。已有研究表明 小鼠体内 丰度下降，丰度上升；但另有实验表明酒精暴露造成小鼠肠道 丰度增加，相对丰度下降。尽管已有研究表明肠道菌群与 发病密切相关，但肠道菌群多样性以及构成的具体变化尚存争议，仍需更多实验补充验证。该研究以慢性酒精喂养加急性酒精灌胃（模型）建立酒精性肝损伤小鼠模型，通过检测血清生化指标、肝脏炎性因子 水平、肝脏和肠道病理形态学改变及肠道菌群测序分析确定酒精暴露对肠道菌群的影响，揭示肠道菌群在酒精性肝病发生中的作用，为酒精性肝损伤机制研究提供依据，以期为酒精性肝损伤患者的治疗提供新思路。材料与方法 材料 实验动物 只 周龄 雄性小鼠，体质量 ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。级动物房温度 ，湿度维持（），光照周期为 昼夜交替。该实验方案经安徽医科大学实验动物伦理审查委员会审核通过。动物饲料动物饲料均购自江苏南通特洛菲饲料科技有限公司。组小鼠喂养 酒精液体对照饲料（）。能量构成比为：碳水化合物、脂肪、蛋白质。组小鼠喂养 酒精液体饲料（），饲料能量构成比为：碳水化合物、脂肪、蛋白质 和酒精。主要仪器 罗氏公司 全自动生化分析仪、石蜡切片机、全自动组织脱水机、组织包埋机、冷冻切片机均购自德国徕卡公司；显微镜购自日本奥林巴斯公司。方法 动物分组与处理 只 周龄小鼠适应性喂养 周后，随机分配到对照组（组）和酒精组（组），每组 只；造模过程包括 液体饲料适应期，酒精液体饲料过渡期（酒精液体饲料与对照液体饲料混合的比例分别为（、），酒精饲料造模期和单次 酒精灌胃（组灌胃 麦芽糖糊精溶液）。灌胃 后麻醉小鼠取材，收集血清和组织进行后续检测。血清丙氨酸氨基转移酶（，）、天冬氨酸氨基转移酶（，）、三酰甘油（，）检测 取血后于常温静置 ，离心 ，分离血清后，使用全自动生化分析仪测定血清、以及 含量。染色 取新鲜组织，迅速置于 多聚甲醛内固定，制作石蜡包埋。制备 切片，进行苏木精和伊红染色，封片，光学显微镜下观察（）。肠道病理评分参考 评分标准。实时荧光定量 实验（）根据 试剂盒说明书，提取肝脏组织总，稀释后确定 纯度并定量至 ，逆转录成 后，用 上机扩增，以 为内参，以 组与 组的比值来表示肿瘤坏死因子（，）、白细胞介素（，）、水平（表）。表 各基因的引物序列基因名称引物序列（）：测序造模结束时，采取无菌方法收集粪便，从每组随机选取 个粪便样品进行检测。利用 试剂盒提取粪便总基因组，取 合格的 样品加引物，引物序列为：，：，配置成 反应体系后对 区域进行扩增，扩增条件为、，循环 次（、，、，、），、，静置，纯化后的扩增产物溶 于 ，贴 上 标 志 完 成 建 库，以 测序系统的 模式上机测序，将原始数据存储于序列数据库，用于后续分析。肠道菌群测序结果分析 多样性分析采用估计物种总数的 指数和综合评估群落丰富度及均匀度的 指数；多样性分析采用主坐标分析（，），使用相似性分析分别从门和属水平比较各组小鼠肠道菌群组成差异。采用组间群落差异分析（，）确定各组小鼠菌群样本之间有显著差异的类群。统计学处理结果以?表示，采用 统计软件进行分析，组间差异采用两独立样本 检验，以 为组间差异有统计学意义。结果 基本情况两组小鼠均无死亡现象，组小鼠最后 次灌胃后出现嗜睡、瘫倒等醉酒症状，后逐渐恢复意识。组小鼠情况良好、行动正常。酒精对小鼠体质量的影响酒精对小鼠体质量的影响见图。组小鼠实验期间体质量呈下降趋势，且造模后期有较大幅度下降，由于 组遵循等热量喂养原则，组小鼠体质量与 组保持一致趋势，后期波动较为平稳。造模结束时，组相较于 组体质量降低（，）。表明摄入酒精对小鼠体质量有一定影响。图 酒精对小鼠体质量的影响与 组比较：酒精对小鼠肝脏损伤的影响 相较于 组，安徽医科大学学报 ；（）组肝脏指数无升高趋势（，）（图）。与 组、相比，组血清、活性升高（，；，）（图、）。组 相较于 组有升高趋势，但差异无统计学意义（，）（图）。染色后显示 组小鼠肝小叶界限不清，肝索排列紊乱，可见清晰的脂肪空泡，同时观察到散在的细胞坏死以及炎性浸润（图）。组小鼠肝小叶结构正常，肝索放射状排列，肝窦及肝细胞未见明显病理性损伤。酒精对小鼠肝脏炎性因子基因表达的影响与 组相比，组小鼠肝脏 有升高趋势，但差异无统计学意义（，），、相对表达量均升高（，；，；，）（图）。酒精对小鼠肠道病理改变的影响 组小鼠结肠黏膜表面不光滑、结构欠清晰，腺体排列紊乱、萎缩，可见炎症浸润。组小鼠结肠组织表面光滑，且腺体排列整齐，无明显充血或水肿现象。组与 组结肠病理学评分差异有统计学意义（，）。见图。图 酒精对小鼠肝脏损伤的影响：肝脏指数；：血清 水平；：血清 水平；：血清 水平；：肝脏 染色；与 组比较：图 酒精对小鼠肝脏炎性因子表达的影响：肝脏 水平；：肝脏 水平；：肝脏 水平；：肝脏 水平；与 组比较：安徽医科大学学报 ；（）图 小鼠结肠 染色及病理评分：结肠 染色；：结肠病理学评分；与 组比较：酒精对小鼠肠道菌群的影响 多样性分析 多样性分析是对单个样品中物种多样性的分析，图 中 多样性相关指标 指数和 指数显示，组与 组物种丰富度和均匀度差异无统计学意义（）。图 多样性分析：指数；：指数 分析 分析即主坐标分析，可用来研究样本群落组成的相似性或相异性。样本的物种丰度和构成越接近，则在 图中距离越近。作为第 主坐标对肠道菌群的代表性为、为第 主坐标，代表性为 。轴上可见 组与 组距离相差较大且差异有统计学意义（，），见图。表明两组小鼠肠道菌群的物种的丰度和构成存在差异。图 分析 肠道菌群门水平丰度分析两组小鼠肠道菌群主要由 个菌门构成，且两组均以 和 为主要菌门，其他菌门丰度较低。与 组相比，组 差异无统计学意义（），而 相对丰度升高（，）。进一步比较 ，差异无统计学意义（）。见图。肠道菌群属水平丰度分析 组和 组中由 个菌属构成，且可知的优势菌属均为，且 组丰度有下降趋势，但差异无统计学意义（，）。与 组相比，组 相对丰度降低（，）。见图。安徽医科大学学报 ；（）图 肠道菌群门水平丰度分析与 组比较：图 肠道菌群属水平丰度分析与 组比较：差异分析结果采用 筛选 组和 组之间有差异的物种。当 值超过设定值（默认设定值为）则认为该物种是构成 组与 组肠道菌群差异的生物标志物。（）在 组中富集，和 （、）在 组中丰度较低。见图。图 差异分析 讨论 酒精性肝病作为全球重大公共卫生问题，建立完善、可靠的酒精性肝损伤模型是研究其发病机制和探索其防治方法的重要前提。目前常用的酒精肝损伤动物模型主要包括慢性酒精喂养模型、胃内灌注酒精模型、急性酒精灌胃模型以及慢性酒精喂养加一次急性灌胃的 模型。该研究采用 模型，不仅缓解了慢性酒精喂养时间过长导致的病死率较高问题，又避免了急性酒精灌胃模型病理改变效果微弱的缺点，同时高度还原人类饮酒方式，短期内可造成更严重的肝脏损伤。血清、升高被广泛认为是酒精性肝损伤的显著性标志。过量酒精刺激肝脏时，乙醇代谢产生自由基侵袭肝细胞膜以及线粒体膜，引起膜通透性增大，释放、入血。脂质代谢异常引起的肝脂质堆积是 最早的表现形式。该研究结果显示，与 组相比，组小鼠血清、大幅升高，有升高趋势，但差异无统计学意义。该研究中酒精暴露并没有引起小鼠肝指数的变化。白云峰 等利用 、和 种不同品系小鼠建立酒精性肝动物模型，比较各项肝损伤指标后表明，品系小鼠肝指数虽无明显变化，但由于其对酒精厌恶性更低，血清、升高更显著，染色呈现病理改变更严重，仍是最理想的实验动物品系。该研究中 组小鼠肝脏病理切片也有不同程度的脂肪空泡、炎性浸润，与血清结果变化基本一致。以上结果说明该研究成功建立酒精性肝损伤模型。肠道菌群失调导致的肠道屏障功能障碍、细菌位移、内毒素血症是 发生的中心环节。长期大量酒精暴露造成肠道菌群失调，肠道屏障破坏，内毒素进入肠腔与 样受体及 样受体结合，激活 通路，释放大量包括、在内的炎性因子，同时可以与、等相互作用发生炎性级联效应，从而促进肝脏损伤。研究表明，酒精喂养小鼠的肠道上皮细胞结构丢失、肠绒毛及隐窝变形。该研究同样表明，酒精暴露可致小鼠结肠结构欠清晰、腺体萎缩，出现炎症浸润。同时发现 组小鼠肝脏、等炎性因子水平升高。研究表明 小鼠体内 下降，和 数量上升，而 同样利用酒精喂养小鼠发现 丰度增加，相对丰度下降。该研究表明，酒精暴露虽然对小鼠肠道菌群多样性无较大影响，但在改变菌群构成方面有很大作用。在菌门水平上，组小鼠肠道 无明显变化，而 丰度增加。进一步比较，差异无统计学意义。在菌属水平 上，组 肠 道 丰 度 下 降。安徽医科大学学报 ；（）是一种常见的革兰阳性菌，能够通过加重脂质沉积导致肝脏损伤。作为肠道健康粪便核心微生物之一，与炎症性肠病、脂肪肝等疾病发生密切相关。进一步 差异分析显示，与 组相比，组以 和 为其重要菌种，则为 组中的重要菌种。而许文琦 等利用酒精喂养建立大鼠酒精肝模型，发现毛螺菌科和瘤胃球菌属 为酒精作用下肠道发挥作用的重要菌属，原因可能是不同动物品种的肠道菌群结构和丰度本就存在一定差异，因此，在酒精作用下发挥作用的菌群也有所不同。由此可知，酒精暴露未影响肠道菌群多样性，但改变了肠道菌群结构，并可能通过上调小鼠肠道 丰度、减少 相对丰度，且以 和 为重要菌属，影响肠道健康，改变肠道屏障功能。综上所述，酒精暴露造成的肝脏损伤小鼠，其肠道菌群发生变化，该变化可能与肝病的发生相关。该研究从肠道菌群变化入手，揭示其在酒精暴露致小鼠肝损伤中的作用，为探索酒精性肝病的预防和治疗方法提供新思路。参考文献 ：，（）：，（）：王磊熙，候 静，张德凯 肠道稳态失调与肝脏疾病的关联 医学综述，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：胡纯秋，徐德祥，王国秀，等 维生素 缺乏对酒精性肝损伤小鼠影响 营养学报，（）：，（）：白云峰，李晓娟，李永纲，等 近交系小鼠酒精性脂肪肝模型建立的分析 中国比较医学杂志，（）：池肇春 肠道屏障功能障碍与酒精性肝病研究进展 世界华人消化杂志，（）：，：，（）：，：吴冬雪，李玉红，裴盛斐，等 基于 测序技术分析异烟肼致大鼠肝损伤中肠道菌群变化特征 安徽医科大学学报，（）：，（）：许文琦，王 生，黄逸安，等 非酒精性脂肪肝与酒精性肝病大鼠肠道菌群比较研究 世界临床药物，（）：，（，）（）（），（），（）安徽医科大学学报 ；（）（）（），（），（），（），（），（），；在对乙酰氨基酚肝损伤后再生中的作用摘要 目的 通过体外实验探讨白细胞介素（）在对乙酰氨基酚（）所致急性肝损伤（）后肝再生过程中的作用。方法 体外实验，培养 小鼠正常肝细胞，法检测不同浓度 药物和 中和抗体（）作用于 细胞后细胞的活力，筛选出最适药物作用浓度；测量 浓度；法检测、等肝脏再生相关蛋白水平；法检测 、水平。软件处理数据。结果 通过 数据，筛选 最适药物浓度造模以及 作用细胞。试剂盒测量 浓度，、浓度分别为、。结 果，与 处 理 细胞其他时间点相比，组 蛋白水平最高，组、蛋白水平最高（）。与 组相比，组、蛋白表达降低（）；与 组相比，组、表达减低（）。结果，与 处理 细胞其他时间点相比，组、水平达高 接收基金项目：国家自然科学基金（编号：）作者单位：安徽医科大学第二附属医院消化科，合肥 作者简介：郁福乾，男，硕士研究生；章礼久，男，主任医师，博士生导师，责任作者，：；路 燕，女，主治医师，硕士生导师，责任作者，：峰（）；与 组相比，组、水平降低（）。结论 通过中和 抑制 磷酸化进而抑制肝细胞再生，推测 在 诱导的肝损伤后肝再生过程中可能起到促进作用。关键词 对乙酰氨基酚；急性肝损伤；白细胞介素；中和抗体；肝再生中图分类号 ；文献标志码 文章编号 （）：药物性肝损伤（，）是指由药物和（或）其代谢产物引起的肝脏损伤，其发病率近年来呈上升趋势，目前已是中国非感染性肝病的第 大病种。其中以对乙酰氨基酚（，）过量诱导的急性肝衰竭（，）最为常见。在肝脏损伤及修复再生过程中，炎症反应起至关重要的作用。炎症诱导的再生主要由炎症细胞释放的各种细胞因子和生长因子调控，目前研究较多的促炎细胞因子是白细胞 介 素（，）和 肿 瘤 坏 死 因 子（，）。体内研究表明 和 在炎症反应早期介导肝损伤，但在后期能够促进肝脏再生。该研究旨在通过体外实验探讨 在 所致急性肝损伤（，）后肝再生过程中的作用。