DB15_T 3279-2023 苜蓿根腐病锐顶镰刀菌鉴定方法.docx

ICS 65.020.01CCS B 0515内蒙古自治区地方标准DB15/T 32792023苜蓿根腐病锐顶镰刀菌鉴定方法Identification of fusarium acuminatum of alfalfa root rot2023-12-29 发布2024-01-29 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布DB15/T 32792023前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则  第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、内蒙古自治区乡村振兴研究中心。本文件主要起草人：史志丹、孙红霞、丁海君、房永雨、杨永青、郭呈宇、伊风艳、燕梦娇、郭晨、孙林、刘思博、张英、刘亚东、李国强。IDB15/T 32792023苜蓿根腐病锐顶镰刀菌鉴定方法1范围本文件规定了苜蓿锐顶镰刀菌根腐病鉴定的主要仪器与用具、主要试剂与材料、实验室检测、结果判定。本文件适用于苜蓿锐顶镰刀菌根腐病的室内鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。锐顶镰刀菌根腐病 fusarium acuminatum root rot由锐顶镰刀菌（Fusarium acuminatum）引起的苜蓿根腐病，在感染初期，苜蓿的根皮附近会出现褐色或暗褐色的坏死斑，根系毛根减少，部分叶子出现黄叶，发病严重时叶片枯黄，植株根部的中柱腐烂霉变，并发生坏死，根茎出现中空，侧根出现大量腐烂坏死，分枝减少。4主要仪器与用具光学显微镜、摇床、培养箱、超净工作台、高速冷冻离心机、PCR仪、培养皿、酒精灯、血球计数板、解剖刀、接种针、移液器、枪头、离心管。5主要试剂与材料试剂5.1.1 次氯酸钠。5.1.2 无水乙醇。5.1.3 硫酸链霉素(500 mg/mL)。5.1.4 真菌基因组提取试剂盒。5.1.5 PCR SuperMix。5.1.6 凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，Loading Buffer，DL2000 DNA Marker。培养基5.2.1水琼脂培养基（WA: Water Agar）：琼脂粉 15 g，加蒸馏水定容至 1000 mL，121 高压湿热1DB15/T 32792023灭菌 20 min。5.2.2马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA: Potato Dextrose Agar）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂粉 15 g，加蒸馏水定容至 1000 mL，121 高压灭菌 20 min。5.2.3马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB: Potato Dextrose Broth）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，加蒸馏水定容至 1000 mL，121 高压灭菌 20 min。5.2.4绿豆琼脂培养基（MBA: Mung Bean Agar）：绿豆粉 60 g，琼脂粉 15 g，加蒸馏水定容至 1000mL，121 高压灭菌 20 min。6实验室检测病原菌的分离和纯化6.1.1病原菌的分离从苜蓿田采集患有根腐病的典型病株。用水清洗样品表面的砂砾和土壤，从根部病健交界部位切成约0.5 cm×0.5 cm的小组织块，用75%酒精和1%次氯酸钠分别处理3 min和5 min，无菌水清洗5次。把表面消毒的发病组织放在PDA培养基上25 培养，见附录A中的图A.1。6.1.2病原菌的纯化待PDA培养基长出菌落后取菌落边缘的菌丝转接3次后再进行单孢分离获得纯化菌株用于后续试验，见附录A中的图A.1。用30%灭菌甘油将分离鉴定后的菌株于-80 保存，对不需长期保存的菌株及时灭活处理。感染苜蓿根腐病的样品保存于4 冰箱中，以备复核。菌落培养特性和病菌形态特征鉴定6.2.1锐顶镰刀菌在 PDA 培养基生长形态锐顶镰刀菌在PDA平板上菌丝呈粉红色绒毛状，生长到后期，颜色逐渐加深变成桃红色，菌丝有隔且具分支，见附录A的图A.2。6.2.2锐顶镰刀菌分生孢子锐顶镰刀菌小型分生孢子数量较少，呈长椭圆形，01个分隔，大小为6.8 µm14.0 µm×3.5 µm4.9 µm。大型分生孢子数量较多，弯刀型，中间较宽、较胖，两端稍尖并稍弯曲，25个分隔，大小为18.2 µm38.5 µm×3.9 µm6.3 µm，见附录A中的图A.3。分子鉴定6.3.1病原菌基因组 DNA 的提取病原菌菌株在25 下PDA平板上生长57 d后，转接至装有50 mL的PDB培养基静置生长3 d，离心收集菌丝，液氮下研磨，使用真菌基因组提取试剂盒提取病原菌DNA后进行分子生物学鉴定。6.3.2PCR 检测鉴定6.3.2.1引物采用rDNA-ITS区通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和RPB2基因通用引物fRPB2-7Cf(5'-ATGGGYAARCAAGCYATGGG-3')和fRPB2-11aR(5'-G2获得分生孢子，用无菌水配置成浓度为10 个/mL分生孢子悬浮液。DB15/T 32792023CRTGGATCTTRTCRTCSACC-3'）以及镰刀菌PHO序列引物Fusphoo-f(5'-ATGCARGGYATYGGHCARCTHGT-3')和Fusphoo-r(5'-ACRTTRGTRGCATCCTTRGWRGART-3')进行PCR扩增。6.3.2.2PCR 结果PCR获得ITS、RPB2、PHO序列大小分别为530 bp左右和850 bp左右，以及为500 bp左右的目的片段，见附录A中的图A.4。送至测序公司进行测序，测序结果在NCBI数据库比对。6.3.2.3聚类分析聚类分析结果表明，以 ITS 序 列 构 建 的 系 统 发 育 树 中 ， 菌 株 与 NCBI 数 据 库 中 的 三 线 镰 刀 菌(JX989827.1)、燕麦镰刀菌（KX058547.1）、锐顶镰刀菌（MT557673.1）聚为同一类，见附录A中的图A.5。以fRPB2序列构建的系统发育树中，菌株与NCBI数据库中的锐顶镰刀菌(HM068335.1)聚为同一类，见附录A中的图A.6。以PHO序列构建的系统发育树中，菌株与NCBI数据库中的锐顶镰刀菌(KJ200247.1)聚于同一类，见附录A中的图A.7。致病性测定6.4.1分生孢子悬浮液制备选取形态特征与F.acuminatum形态特征相符且PCR检测鉴定阳性的分离菌株，在绿豆培养基上培养66.4.2病原菌回接消毒后的苜蓿种子播种于灭菌营养土中，播种40 d后，用分生孢子液接种的大米接种苜蓿根部。采用针刺法接种苜蓿根部，在伤口处接种10粒左右大米，期间要保持土壤湿润。在接种后14 d20 d。对接种发病的苜蓿根部再做病原菌分离、培养，观察是否与F. acuminatum的形态特征一致，并对分离菌进行PCR检测。7结果判定符合锐顶镰刀菌根腐病为害症状，菌落培养特性和病菌形态学特征与锐顶镰刀菌（F. acuminatum ）相符，PCR 扩增鉴定为 F. acuminatum，且苜蓿致病性测试的分离物，鉴定定为 F. acuminatum。3DB15/T 32792023A                    A附录A（资料性）苜蓿根腐病锐顶镰刀菌的分离鉴定过程苜蓿根腐病锐顶镰刀菌的分离鉴定过程见图A.1图A.7。取样清洗分离涂板摇菌镜检再次分离提取测序比对图A.1 苜蓿根腐病病原菌的分离纯化A注：A:锐顶镰刀菌在PDA平板正面，B：锐顶镰刀菌在PDA平板背面。图A.2 PDA 培养基锐顶镰刀菌生长形态B4DB15/T 32792023ABC注：A:小型分生孢子B:大型分生孢子C:菌丝。图A.3 锐顶镰刀菌孢子与菌丝形态750bp500bp1000b750bpABC500bp250bp注：A:ITS引物PCR电泳图，M为DL2000 DNA，2泳道为CK, 13-18泳道为检测菌株，B:RBP2引物PCR电泳图，M为DL2000 DNA，21泳道为CK,2-20泳道为检测菌株，C:PHO引物PCR电泳图，M为DL2000 DNA，2-3泳道为CK,4-11，13-22泳道为检测菌株。图A.4 PCR 电泳图5DB15/T 32792023图A.5 系统发育树ITS 序列图A.6 系统发育树fPRB2 序列图A.7 系统发育树PHO 序列6