QTOF质谱材料培训教材.docx

电喷雾电离源ESI仪器原理介绍套管的清洗、维护假设需要可以演示操作电喷雾电离源是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它适 合于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。对于非极性、挥发性的待测化合物，则不使用。电喷雾电离源的最大特点是简洁形成多电荷离子。这样，一个分子量为10000Da的分子假设带有10 个电荷，则其质荷比只有1000Da，进入了一般质谱仪可以分析的围之。依据这一特点，目前采 用电喷雾电离，可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。因此由ESI电离源电离的质谱仪在测量的分子量围上，理论无上限，只需要调整条件，让其带上更多的电荷即可。电离源几个参数的意义1、毛细管电压 3KV8KV掌握适宜的电压，以便对于待测化合物有更好的电离度并且在这个条件下不会发生电化学反响，从而降低待测物质的信号。在负离子模式下，由于电压过高，电离源尖端会消灭紫色的尖 端放电现象，做样品测试的时候要尽量避开，防止由于尖端放电，电压过高使样品发生裂解， 从而不能得到较高丰度的分子离子峰。同时也会由于电流的产生，损毁离子源的元件。2、去溶剂温度溶剂的最低的气化温度到最高的气化温度之间电离源温度是溶剂气化的重要参数。软件添加附件之后可以将该参数设置到350。对于水 比较多流淌相而言，我们需要调高电离源的去溶剂温度以便水能最大程度液化，由于有时候未气化的水会进入到质谱仪器部，对一些阀门造成损坏。固然，对于水而言，由于外表力比较高，很难形成电喷雾，所以可以在不影响液相分别的状况下，尽量削减水的含量，避开信号的损失。3、锥孔电压依据灵敏度和区分率进展数值优化锥孔也可以叫采样孔，调整适宜的锥孔电压可以增加仪器的灵敏度，但是锥孔电压过高会造成待测化合物的源裂解。造成非二级质谱造成的碎片峰的产生，不利于谱图的解析。4、去溶剂气去溶剂气流量的选择：阅历法选择去溶剂气，一般流淌相的流速为0.1mL/min 时候，选择100L/h 的去溶剂气流量，0.2 mL/min 时选择200L/h 的去溶剂气流量，依次类推。去溶剂气的流量必需稳定，需将液氮分压表的分压掌握在0.6左右，否则做出试验的待测化合物的离子计数重现性很差。另外，当去溶剂气流量升到1000L/h 的时候，会觉察去溶剂温度的反响值保持在300如果预设为350，属于正常现象。总而言之，电离源的最正确使用效果是要保证从电离源外观看来，肯定要产生锥形电喷雾。从图谱上看，假设样品量能保证在mg/mL,质谱的响应值能到达103或者104数量级。假设未到达，分 析思路：1、离子模式选择是否正确。2、离子源、锥孔是否清洁。3、所设的离子源数值是不是没有得到相应的反响值。4、待测样品是否适合用这种电离源进展电离。5、仪器的灵敏度是不是不够在重进展软件的附件安装之前，应当保存ms tune 方法参数，以防由于参数设置问题造成灵敏度下降。两种工作方式：1.全扫描scan：指定的两个质核比间扫描每个离子的丰度。2.仅检测被选择的一个或多个离子的丰度。四级杆检测器飞行时间检测器原理质荷比与时间的平方成正比，只要测定出飞行时间，就可换算成质荷比。在检测时，明显是质荷比小的先到达检测器，质荷比大的后到达。在通常状况下，离子的飞行时间为微秒数量级。飞行时间性能指标：1.区分率：RP = M /MM:为测定的质量，M:半峰高的峰宽 线性模式，区分串较低；反射模式，区分率可高达15000 “延迟引出”DE技术或称“脉冲离子引出”PIE2.质量围：目前的商品仪器般可测到几十万原子质量单位u飞行时间在多肽，蛋白质，糖，核苷酸有广泛的应用，能使有机质谱测试难得到信号的物质得到抱负谱图。MCP 检测器微通道板与电子倍增器的作用类似，都是离子的物理型放大器。与电子倍增器不同的是， MCP 有成像功能；但是在TOFMS 应用中仅使用了电子倍增功能。在微通道板的每个通道的壁上都涂有一种能放射次级电子的半导体材料，当给微通道板加 了肯定电压后，就会在每个通道中产生一个均匀的电场。这个电场是轴向的。所以能使进入电 场的低能电子光子或电子与壁碰撞的时候能产生次级电子，并且在轴向电场的作用下次级 电子被加速，这样次级电子遇到壁上又会产生更多的的次级电子。这样。对于一个入射粒子。在板的输出端就会产生很多的电子。实际上我们很简洁理解，每个通道就是一个光电倍增管， 不过它没有特地的光阴极，而且打拿极是连续分布的，另外入射电子不只限于光子，事实上任 何载能电子，只要在通道壁上能打出次级电子，它都能响应，与光电倍增管外电路分压器相比 拟，它利用铅玻璃自身的体电阻作为分压电阻，一般极间总电阻为10欧，通道中的电势梯度使 次级电子得到加速，获得能量，从而保证在下一次轰击通道时有足够大的二次放射系数。微通道板MCP是由壁镀有半导体层的微管规章排列熔压而形成的二维阵列，可以将微弱电子图像或信号均匀放大到10000倍以上。保持端面的清洁，不能用手触摸。避开碰撞，挤压造成机械破损。避开真空不高的状况下加高压，以免引起通道孔放电。防止两端面间高压击穿造成绝缘破坏。防止 MCP 一次性直接暴露在强粒子束中。二级质谱原理在一级的根底上，确定感兴趣的母离子进展碎裂借助四极杆进展筛选，使用碰撞池进展碰撞碎裂，碎裂机理为碰撞诱导解离。CID本试验选择在一级质谱的根底上选择分子量为721的离子进展碰撞，可得到如下的质谱图，见其碎片峰。二级图谱的碰撞电压的选择直接影响图谱的形成，对数据的解析有很大的影响。最正确状况应当保证图谱中存在5%10%的原母离子和碎片离子，假设碰撞电压设置过高，也会对碎片信息的获得造成影响，碎片过碎，碎片难以解析。二级质谱的应用·待测化合物的碎片获得， 可以通过二级图谱与化合物的二级碎片进展比照，进展待测化合物确实定。·半定量的方法·多肽测序·代产物的鉴定······一：开机开机后仪器使用、调谐1. 翻开质谱：总按钮，抽真空与掌握电压按钮。2. 翻开质谱液相与电脑的中枢按钮3.翻开电脑，MassLynx 软件留意：a.假设 Mass Tune 界面是灰色的，而且没有时上时下的峰，则说明电脑与仪器连接不良。b.假设电脑与仪器长期连接不良，质谱掌握电压按钮肯定要处于关闭状态，以免质谱电压不受控造成质谱烧毁。二：MCP 检测器的老化老化应在真空 24 小时后完成，观看压力表在10-7兆帕，Vaccum 中的表指针应在绿色区域，避开未到达真空度，MCP 双板电极之间通电短路。避开 MCP 一次性暴露在强的粒子流中1. 翻开 MS Tune 界面，点开Press for operate变绿2. 将 Flight Tube 电压渐渐升至 5630V。每隔 500V 一升。 3.Options 中点MCP Conditioning：Voltage：startv0Stopv2300 Time：startmins720Stopmins13. 开头之后 12 小时Flight Tube 中的 MCP Detector 为 2300v5. 关闭质谱：将Voltage 以 200v 为间隔降到 0v，关闭Press for operate变红6. MCP 电压最高值是工程师调谐的，假设试验过程中觉察周密度不高，也避开调MCP 的电压，以免对 MCP 造成损耗。三：质谱校正校正溶液的选择留意事项：选择能够产生离子簇的物质，一般校正溶液的选择与寻常所测的物质的分子量围有关。1. 校正溶液异丙醇甲酸钠的配制本试验室常用校正液 根本比例：以 10ml 异丙醇甲酸钠为例A. 9ml 超纯水放入容量瓶中，用甲酸标定，即得10%甲酸溶液。B. 将 0.5ml0.1mol/L 氢氧化钠溶液与 0.5ml 甲酸水溶液参加 10ml 容量瓶中C. 将体积比为 9:1 的异丙醇参加到“2”中的容量瓶中标定，即得甲酸钠溶液。留意：有机相，水相分别过膜。2. 翻开质谱1、Press for operate 翻开，点开两个气阀。2、ES+ Source：capillary 调成 3350v负离子模式为 2600v，毛细管电压可以依据不同化合物的性质做出调整，总体围在 2kv8kv 之间 desolvation temperature 调到 300(假设安装附件可以到达 350)3、Time of Flight：Flight Tube 以 500v 为间隔升到 5630v MCP Detector 以 200v 为间隔升到 2300v。开启质量校正页面后，质量校正前请先确定目前仪器处于未校正的状态，可以将 flie 文件中的UncalNo Calibration。3. 连接校正液与质谱，翻开校正液流速，待质谱有信号后按”Acquire”收集信号4. 一段时间后3min 左右将质谱方法停顿，观看spectrum,确定下分子量，在MS Tune 中的Calibration中查询标准物的准确分子量留意：由于常常做的是自然产物，其分子量在 400-500 之间，所以要校正400-500 之间的数值。按 m/z 的需求对分子量进展选择，假设待测化合物的分子量在700 左右，则选择 700 左右的分子量进展校正。5. 计算 Leff 值，将计算后的 Leff 值输入到Option 里的TDC setting 中，之后再进展 3-4 操作， 直到采集到的分子量与查表得到的分子量小数点后3 位全都即可。6. 保存：A. 到 spectrum 中找到processcentreareasTofokokfilesaveB.MS Tune中 CalibrationFrom Files找刚存的文件名称点“history”acru mass 点最近那个时间ok RMS residual 图中的点假设偏移太大则删去。(校正后保证质量偏差在 10 个 10ppm)四、仪器灵敏度的调整一般状况下，每一种待测化合物都有最适合自己的电离条件，对于质谱条件的优化选用标准品进展，但是从科研角度而言，这样的工作一般做的比较少的，除非是基于筛查的目的。进过标准品试液之后，通过调整毛细管电压、电离源温度、去溶剂温度、去溶剂气、电离源与锥孔距离的调整可以对仪器灵敏度进展优化。事实上，每一种化合物都有最正确的质谱条件，普适的灵敏度调整可以用接近仪器最常使用的分子量围的校正液进展。五、仪器的区分率的调整完成仪器的灵敏的调整之后可以对仪器的区分率进展调整，本台质谱仪的区分率为5000左右，相对于单四级杆的2002000的区分率而言属于高区分质谱仪，并且区分率主要由于飞行时间管供给。但是相对于市场上高达50000区分率的质谱而言，区分率就比较低了。单峰法，R=M/ 半峰宽，调整offset微调、毛细管电压、锥孔电压、MCP 检测器电压等参数，但是比较繁琐，建议由专业工程师进展调整。并且 MCP 检测器电压的调整对其使用寿命影响较大，应当在专业工程师的引导下完成。C.再回到MS Tune calibrationfilesave as实际样品的上机测试样品前处理1. 选用试剂将样品溶解，难溶解的物质可超声处理。浓度不低于1mg/ml。溶液可以在电离源发生气化，被真空系统抽走。所以应中选择挥发性盐溶液作为流淌相，另外使用酸碱时，应尽量避开使用三氟乙酸，以防其抑制样品信号。2. 溶解后的样品需要过膜处理但对于在膜上有吸附的化合物，应选用其他方法。3. 假设样品经过高速离心，即 30000rpm，样品溶液可以不过膜。流淌相选择1. 直接进样的方式：样品溶剂多项选择用甲醇，乙腈，异丙醇，乙醇和水等挥发性溶剂，为了使样品在溶液中离子化，通常使用挥发性的酸或碱如乙酸，氨水等调整溶液的pH。一般流淌相要与样品溶解的试剂保持全都。2. 常用的溶剂和缓冲液a 水、乙腈及甲醇LC-MS 抱负的溶剂b 乙酸和甲酸 可降低LC 流淌相的pH 值以提高分别度c 氢氧化铵/氨溶液 可提高LC 流淌相的pH 值d 乙酸铵 是一种挥发性盐，用于缓冲流淌相，并改善色谱分别而不影响MS 的性能。最大浓度不超过 0.1mol/L。尽量掌握盐溶液浓度，以防盐析出堵塞毛细管离子模式的选择1. 正离子模式适合于碱性样品，可用乙酸pH3-4或甲酸pH2-3对样品加以酸化。2. 负离子模式适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进展碱化。10mmol/L50mmol/L3. 有些酸碱性并不明确的化合物，可优先选用ESI+进展测定。元素组成分析高区分质谱应用元素分析有lockspray 的状况下1. 将液质正常连好，在option 中的 Lock Spray 勾上，在MS Method 中 Reference Scan 中将voltage 调成 20v，frequencysec调成 52. 将标准溶液接入lock spray 接口处，进展试验。校正液的信号要低于待测物质的信号。3.试验完毕后，翻开Chromatogram 中 TIC 的 BPI;将 MS Tune 的 ProcesscenterTOFLock Mass，将标准的分子量输入其中。留意：1.这里的Lock Mass 是锁定的分子量，不锁定为 02.先看Lock Spray 中的哪一个峰离标准分子量最近，再在MS Tune 中的 Calibration 中查询标准物的准确分子量，将目标分子量输入到Lock Mass 中。4.再在ToolsElemental composition双击目标分子量OK。即得到目标分子的元素组成。5.无 LockSpray 的状况下，承受标法进展分析，操作见1-4.图谱的解析拿到一总离子流图：首先看右上角TIC 下面的数值，假设到达 e4说明电离程度较好。但是并不用刻意追求这个数值， 只要能检出我们需要的峰，这个数值就不是问题。但是假设没有，则需要考虑电离条件的问题。觉察背景比较高 信号不是很明显点击“display”到“TIC”勾上 BPI chromatogram 单击“OK” 如以下图即可得到BPI 图谱我们可以觉察 信号高的地方得到了放大 信号低的地方照旧没有转变假设想讲图谱变得更加“好看信噪比变大”，需将baseline%改为5%。点击“OK”我们可以觉察基线变得更低了。比照一下“BPI”的数据处理工具可以帮助我们找到更多的信号峰，避开由于分别度不够造成的峰识别困难。针对本总离子流图的解读对5.71分钟的峰进展积分 得到其质谱图在100400m/z 围 有很多峰 不能确定是否由于分别不好造成于是点击chromatogram 里面的progress 下面的combine spectrum 窗口将需要的峰右键选在Average 条框，将不需要的背景峰选在下面 subtract 条框。即可得到扣除背景之后的峰。质谱图变得干净很多 但是仍有少量小分子量化合物 推想可能为样品化合物或者样品分子发生源裂解的产物。连续观看消灭的453.2、464.7、904.8、926.8这几个化合物之间是什么关系呢？这些化合物其实是同一化合物。由于453和904之间其实是 M+1峰、2M+1峰的关系、2M+Na 峰。由于玻璃仪器、自然界中都含有丰富的 NaK 元素，所以常会形成加钠或者加钾峰，属于正常现象。多电荷的推断放大904的峰 可见其同位素峰分子量之间相差1 即带1个电荷。假设分子量之间差0.5，则带两个电荷，差0.1则带10个电荷。此为阅历公式。日常维护及使用1. 假设质谱中有 100 的分子量信号假设 100 为无关的杂质峰很强降不下去，可以在Acquire 时将其中的masses 的值改成 105，避开分子量为 100 的峰。2. 假设质谱中有杂质用液相冲不下来，则可以将离子源拆下来清洗： A将离子源拆下来用分别蘸过甲醇与水的棉签反复擦洗。 B清洗锥孔，针管：将锥孔拆下来分别用超纯水，甲醇，超纯水各超声15min。 C安装离子源，安装完毕观看软件中的电压与温度是否能升上去，假设升不上去，重安装。3. 质谱离子源电压升到 3350v，但显示为 3350*2v，可以将离子源拆下来重装上去。4. 从 TIC 中找出一个目标分子量的 TIC 图，从 chromatogramdisplayMass输入想要的分子量即可。5. 假设直接进质谱的话，进针应缓慢，由于要供给一个宽的离子流，否则获得电离的化合物量太少，影响检测结果。6. 查各数据电压信息：chromatogram翻开一个文件点 experiment即可查出各信息值的大小。7. 假设看不到准分子离子峰，可以调Source 中的sample cone；或者Quadrupole 中的 collision Energy。8. 循环水，液面上消灭油渍就可进展换水。9. 油泵每隔一个月震荡一次，油面下降则可加油面至二分之一处即可演示换泵油10. 检查液相仪器状态：电脑中All programsNational InstrumentNI-488.2getting started wizard检查质谱仪器状态：All programsAccessoriesHyber Terminals 输入rebot 10.安装 Probe 毛细管时，露出长度应保证为 0.5mm。11. 离子计数不应超过 500counts/second，否则死时间过长，影响质量精度。试验室维护建议1、 试验室环境维护：温度恒温)、湿度尽量符合标准试验室标准，否则影响MCP 寿命、电力输送稳定、降尘尘土过大影响仪器散热，降低部芯片使用寿命。2、 试验室软件维护：a. 说明书搞明白是根底，多测一下标准品生疏仪器操作和了解仪器性能。b. 广泛查阅中外文献、著作，扩展视野，解决根本的应用问题。 c参加行业论坛或者其他如仪器信息网、丁香园等主流，与同行多多沟通。d.与 Waters 客服或者工程师多多沟通，有问题早解决，利用好强大的技术智囊团。