(17)--第六章 微生物的生长及控制.ppt

1教学目的教学目的：n微生物生长的测定及微生物的生长规律；微生物生长的测定及微生物的生长规律；n影响微生物生长的主要因素；影响微生物生长的主要因素；教学教学方法和手段：方法和手段：n主要通过多媒体课件的讲授和具体举例分析主要通过多媒体课件的讲授和具体举例分析来实现教学目的，通过提问、讨论等教学辅来实现教学目的，通过提问、讨论等教学辅助手段促进学生的积极思考，激发学生的潜助手段促进学生的积极思考，激发学生的潜能。能。2生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。个体体积扩大的生物学过程。个体体积扩大的生物学过程。个体体积扩大的生物学过程。繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。物学过程。物学过程。物学过程。第六章第六章 微生物的生长及其控制微生物的生长及其控制34n n微生物生长：微生物生长：在一定时间和条件下细胞数在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长），在微生物量的增加（微生物群体生长），在微生物学中提到的学中提到的“生长生长”，一般均指群体生长，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。这一点与研究大生物时有所不同。n n微生物生长：单位时间里微生物数量或生微生物生长：单位时间里微生物数量或生物量的变化。物量的变化。5第一节微生物的生长和测定方法1 1、测生长量：、测生长量：、测生长量：、测生长量：（1 1）直接法：测体积、称干重等方法直接法：测体积、称干重等方法直接法：测体积、称干重等方法直接法：测体积、称干重等方法（2 2）间接法：间接法：间接法：间接法：A A比浊法：可用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行比浊法：可用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行比浊法：可用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行比浊法：可用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行测定或用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定。测定或用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定。测定或用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定。测定或用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定。67B生理指标法：生理指标法：如测含氮量：一般细菌的含氮量为其干重的如测含氮量：一般细菌的含氮量为其干重的12.5%，酵母菌为，酵母菌为7.5%，霉菌为，霉菌为6.5%，含氮，含氮量乘以量乘以6.25即为粗蛋白含量。即为粗蛋白含量。测含碳量以及测磷、测含碳量以及测磷、DNA、RNA、ATP、DAP（二氨基庚二酸）、几丁质或（二氨基庚二酸）、几丁质或N乙酰乙酰胞壁酸等含量的；胞壁酸等含量的；产酸、产气、耗氧、粘度和产热等指标，有产酸、产气、耗氧、粘度和产热等指标，有时也应用于生长量的测定。时也应用于生长量的测定。82、计繁殖数：细菌细菌细菌细菌酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌放线菌和霉菌孢子数放线菌和霉菌孢子数放线菌和霉菌孢子数放线菌和霉菌孢子数（1 1）直接法：指用计）直接法：指用计）直接法：指用计）直接法：指用计数板（例如血球计数板）数板（例如血球计数板）数板（例如血球计数板）数板（例如血球计数板）在光学显微镜下直接观在光学显微镜下直接观在光学显微镜下直接观在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方察细胞并进行计数的方察细胞并进行计数的方察细胞并进行计数的方法。法。法。法。9A 平板菌落计数法（2）间接法）间接法（菌落计数法）（菌落计数法）：10n n采用培养平板计数法要求：采用培养平板计数法要求：n n每一活微生物单细胞在培养平板上培养每一活微生物单细胞在培养平板上培养后，形成一个单菌落，在科研中一般用后，形成一个单菌落，在科研中一般用菌落形成单位（菌落形成单位（colony forming units，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞）来表示，而不是直接表示为细胞数。数。n n技术要求高，烦琐。技术要求高，烦琐。11C 厌氧菌的菌落计数法：厌氧菌的菌落计数法：一般采用亨盖特滚管培养法进行（第四节）。一般采用亨盖特滚管培养法进行（第四节）。半固体深层琼脂法半固体深层琼脂法 12第二节：微生物的生长规律 一、一、细菌的同步生长和二次生长细菌的同步生长和二次生长同步培养：同步培养：使群体中的细胞处于比较一致使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶段上，即大多的，生长发育均处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。同步生长：同步生长：以同步培养方法使细胞群体中以同步培养方法使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态。各个体处于分裂步调一致的生长状态。13n n通过同步培养方法获得的细胞被称为通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。同步细胞或同步培养物。n n由于细胞的个体差异，同步生长往往由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变个世代，随后又逐渐转变为随机生长。为随机生长。14二、单细胞微生物的典型生长曲线纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中，纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中，定时测定菌体数量，以活菌数对数为纵坐标，以时定时测定菌体数量，以活菌数对数为纵坐标，以时间为横坐标绘图所得到的曲线，称为生长曲线。间为横坐标绘图所得到的曲线，称为生长曲线。整个典型生长曲线可分为四个时期：延滞期、指数整个典型生长曲线可分为四个时期：延滞期、指数期、稳定期和衰亡期。期、稳定期和衰亡期。15161、延滞期延滞期表现：不立即繁殖，菌数几乎不变，细胞表现：不立即繁殖，菌数几乎不变，细胞形态变大。形态变大。特点：生长速率常数为特点：生长速率常数为0，分裂迟缓，合成，分裂迟缓，合成代谢活跃，体积增长快，细胞内代谢活跃，体积增长快，细胞内RNA含量含量增高，对外界不良环境敏感，合成各种新增高，对外界不良环境敏感，合成各种新的酶系和中间代谢产物。的酶系和中间代谢产物。影响延滞期长短的因素：影响延滞期长短的因素：菌种菌种接种龄接种龄 接种量接种量培养基成分培养基成分17(1)(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2)(2)利用对数生长期的细胞作为种子；利用对数生长期的细胞作为种子；(3)(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；(4)(4)适当扩大接种量适当扩大接种量在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：182、指数期：在生长曲线中，细胞、指数期：在生长曲线中，细胞数以几何级数增长的时期。数以几何级数增长的时期。表现：代谢活性最强，几何级数增加，代表现：代谢活性最强，几何级数增加，代时最短，生长速率最大。时最短，生长速率最大。特点：细菌数目增加与原生质总量增加，特点：细菌数目增加与原生质总量增加，与菌液浊度增加呈正相关性。与菌液浊度增加呈正相关性。代时：单个细胞完成一次分裂所需时间，代时：单个细胞完成一次分裂所需时间，亦即增加一代所需时间。亦即增加一代所需时间。倍增时间：原生质增加一倍所需的时间倍增时间：原生质增加一倍所需的时间倍增时间：原生质增加一倍所需的时间倍增时间：原生质增加一倍所需的时间19影响微生物增代时间（代时）的因素：影响微生物增代时间（代时）的因素：1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；代时不同；2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短；时短；3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比；凡是处于较低浓度范营养物浓度呈正比；凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。称为生长限制因子。4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。呈正相关。20大肠杆菌在不同温度下的代时大肠杆菌在不同温度下的代时温度（温度（温度（温度（）代时代时代时代时（minmin）温度（温度（温度（温度（）代时代时代时代时（minmin）1010151520202525303086086012012090904040292935354040454547.547.5222217.517.520207777213、稳定期表现：新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，表现：新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，活菌数动态平衡。活菌数动态平衡。特点：生长速率又趋于特点：生长速率又趋于0，细胞总数最高。合成各，细胞总数最高。合成各类次生代谢物。类次生代谢物。原因：养分减少；营养物比例失调，有毒代谢物产原因：养分减少；营养物比例失调，有毒代谢物产生，培养环境条件中生，培养环境条件中pH和氧化还原电位等对细和氧化还原电位等对细菌生长不利。菌生长不利。22应用意义：应用意义：1 1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）补充营养物质（补料）调调pH pH 调整温度调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。234、衰亡期表现：出现表现：出现“负生长负生长”，有些细胞开始自溶。，有些细胞开始自溶。衰亡期特点：细菌代谢活性降低，细菌衰老并出衰亡期特点：细菌代谢活性降低，细菌衰老并出衰亡期特点：细菌代谢活性降低，细菌衰老并出衰亡期特点：细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。化酶、外肽酶或抗生素等。化酶、外肽酶或抗生素等。化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。24三、微生物的连续培养 连续培养（连续培养（连续培养（连续培养（continuous culturecontinuous culture）：指在微生物的整个培养）：指在微生物的整个培养）：指在微生物的整个培养）：指在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。生长并能持续生长下去的一种培养方法。生长并能持续生长下去的一种培养方法。生长并能持续生长下去的一种培养方法。又称开放培养，是相对单批培养、封闭培养而言的。又称开放培养，是相对单批培养、封闭培养而言的。又称开放培养，是相对单批培养、封闭培养而言的。又称开放培养，是相对单批培养、封闭培养而言的。单批培养（单批培养（单批培养（单批培养（batch culturebatch culture）或）或）或）或 封闭培养（封闭培养（封闭培养（封闭培养（closed cultureclosed culture）：）：）：）：指将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，指将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，指将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，指将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。典型生长曲线。最后一次收获。典型生长曲线。最后一次收获。典型生长曲线。最后一次收获。典型生长曲线。25单批培养（封闭培养）：培养基一次加入，单批培养（封闭培养）：培养基一次加入，不予补充，不再更换。不予补充，不再更换。连续培养：在培养过程中不断的补充营养物连续培养：在培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物才能实现微质和以同样的速率移出培养物才能实现微生物连续培养。生物连续培养。26连续培养器的类型连续培养器的类型271、恒浊器：是一种根据培养器内微生物的生、恒浊器：是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。的微生物细胞的连续培养器。28恒浊连续培养恒浊连续培养测定所培养微生物的光密度值测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的生长速率。持最高的生长速率。29一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业使用范围：用于生产大量菌使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。乙醇等。302、恒化器、恒化器:是一种设法使培养液的流速保持是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装 置。置。31恒化连续培养：n n使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。其最高生长速率下进行生长繁殖。其最高生长速率下进行生长繁殖。其最高生长速率下进行生长繁殖。3233连续发酵与单批发酵相比的优点：连续发酵与单批发酵相比的优点：缩短发酵周期。缩短发酵周期。提高设备利用率。提高设备利用率。便于自动控制。便于自动控制。降低动力消耗及体力劳动强度。降低动力消耗及体力劳动强度。产品质量较稳定。产品质量较稳定。缺点缺点：营养物利用率低。营养物利用率低。染菌率高。染菌率高。菌种易菌种易退化。退化。34四、微生物的高密度培养n n微生物的高密度培养：微生物在液体培养微生物的高密度培养：微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的倍以上时的生长状态或培养技术。生长状态或培养技术。n n现代高密度培养技术主要是在用基因工程现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐步发展起来菌生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。的。n n实践价值实践价值35n n选取最佳培养基成分和各成分含量选取最佳培养基成分和各成分含量n n补料补料n n提高溶解氧的浓度提高溶解氧的浓度n n防止有害代谢产物的生成防止有害代谢产物的生成n n保持合适保持合适PH具体方法具体方法36第三节：影响微生物生长的主要因素 影响微生物生长的外界因素除营养条件外，还影响微生物生长的外界因素除营养条件外，还影响微生物生长的外界因素除营养条件外，还影响微生物生长的外界因素除营养条件外，还有许多物理条件。如有许多物理条件。如有许多物理条件。如有许多物理条件。如温度、温度、温度、温度、pHpH、OO2 2 、水分、水分、水分、水分、渗透压渗透压渗透压渗透压等。等。等。等。37一、温度生长温度三基点：最低生长温度，最适生生长温度三基点：最低生长温度，最适生长温度，最高生长温度。长温度，最高生长温度。宽温微生物宽温微生物窄温微生物窄温微生物41菌菌 名名生长温度生长温度发酵温度发酵温度累积产物温度累积产物温度 （）（）（）Streptococcus thermophilus374737S.lactis3440产细胞：产细胞：2530产乳酸：产乳酸：30Streptomyces griseus3728_Corenybacterium pekinense32 3335_Clostridium acetobutylicum3733_Penicilium chrysogenum302520以青霉素的生产为例：培养以青霉素的生产为例：培养165小时采用分段控制温度的方法，小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在其青霉素产量比始终在30 培养提高了培养提高了14.7%。分段控制方式：分段控制方式：05小时，小时，30；540小时，小时，25；40125小时，小时，20；125165小时，小时，25。不同生理生化过程的最适温度不同生理生化过程的最适温度微生物不同生理活动要求不同温度，所以，微生物不同生理活动要求不同温度，所以，最适生长温度最适生长温度 发酵速度快、积累代谢产物多。发酵速度快、积累代谢产物多。42从微生物整体来看从微生物整体来看:生长的温度范围一般在生长的温度范围一般在-10 100 极端下限为极端下限为-30，极端上限为，极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物：但对于特定的某一种微生物：只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度处于最适生长温度时，生长速度最处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。快，代时最短。超过最低生长温度时，微生物不生超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。长，温度过低，甚至会死亡。超过最高生长温度时，微生物不生超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。长，温度过高，甚至会死亡。43微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系中变化很大，根据微生物与氧的关系,可可把它们分为几种类群把它们分为几种类群:专性好氧菌专性好氧菌:好氧菌好氧菌 兼性厌氧菌兼性厌氧菌 微好氧菌：微好氧菌：耐氧菌：耐氧菌：厌氧菌厌氧菌 (专性专性)厌氧菌：厌氧菌：二、氧气对微生物生长的影响二、氧气对微生物生长的影响44氧浓度对不同微生物生长的影响45在培养不同类型的在培养不同类型的微生物微生物时，要采用相应的措施保证不时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。同微生物的生长。培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时 在培养基中添加还原剂，降低在培养基中添加还原剂，降低 培养基中的氧化还原电位势。培养基中的氧化还原电位势。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。46三、三、pHpH值值环境环境pHpH值值对微生物生长的影响对微生物生长的影响 绝大多数微生物的生长PH在5-9之间。不同微生物的生长pH也存在最低、最适与最高3个值.除不同种类微生物有其最适生长PH外，即使同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过程，也有不同的最适pH要求。研究其中的规律对发酵生产中PH的控制极为重要.微生物细胞内环境中的PH值相当稳定.47 微生物种类微生物种类最低最低pHpH最适最适pHpH最高最高pHpH大肠杆菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌黑曲霉黑曲霉一般放线菌一般放线菌一般酵母菌一般酵母菌 4.34.3 4.5 4.5 4.2 4.2 1.5 1.5 5.0 5.0 3.0 3.06.06.08.08.06.06.07.57.57.07.07.57.55.05.06.06.07.07.08.08.04.04.05.85.8 9.5 9.5 8.5 8.5 9.3 9.3 9.0 9.0 10 10 8.0 8.0 一些微生物生长的一些微生物生长的pHpH值范围值范围48微生物微生物 pH值值 最低最低 最适最适 最高最高Thiobacillus thiooxidans 氧化硫硫杆菌氧化硫硫杆菌 0.5 2.03.5 6.0Lactobacillus acidophilus 嗜酸乳杆菌嗜酸乳杆菌 4.04.6 5.86.6 6.8Rhizobium japonicum 大豆根瘤菌大豆根瘤菌 4.2 6.87.0 11.0Azotobacter chroococcum 圆褐固氮菌圆褐固氮菌 4.5 7.47.6 9.0Nitrosomonas sp.硝化单胞菌硝化单胞菌 7.0 7.88.6 9.4Acetobacter aceti 醋化醋杆菌醋化醋杆菌 4.04.5 5.46.3 7.08.0Staphylococcus aureus 金黄葡球菌金黄葡球菌 4.2 7.07.5 9.3Chlorobium limicola 泥生绿菌泥生绿菌 6.0 6.8 7.0Thurmus aquaticus 水生栖热菌水生栖热菌 6.0 7.57.8 9.5Aspergillus niger 黑曲霉黑曲霉 1.5 5.06.0 9.0一般放线菌一般放线菌 5.0 7.08.0 10.0一般酵母菌一般酵母菌 3.0 4.05.8 8.0不同微生物的生长不同微生物的生长pHpH值范围值范围49同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对对pH值的要求也不同。在发酵工业中，控制值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH值尤其重要。值尤其重要。微生物微生物 生长最适生长最适pH 合成抗生素最适合成抗生素最适pH灰色链霉菌灰色链霉菌6.36.96.77.3红霉素链霉菌红霉素链霉菌6.67.06.87.3产黄青霉产黄青霉6.57.26.26.8金霉素链霉菌金霉素链霉菌6.16.65.96.3龟裂链霉菌龟裂链霉菌6.06.65.86.1灰黄青霉灰黄青霉6.47.06.26.5生长的最适pH值与发酵的最适pH值50同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境对环境pHpH值要求不同。值要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌例如：丙酮丁醇梭菌 在在pHpH值值=5.5=5.57.07.0时，以菌体生长为主时，以菌体生长为主 在在pHpH值值=4.3=4.35.35.3时，进行丙酮丁醇发酵时，进行丙酮丁醇发酵同一种微生物由于环境同一种微生物由于环境pHpH值不同，可能积累不同的代谢值不同，可能积累不同的代谢产物。产物。例如：黑曲霉例如：黑曲霉pHpH值值=2=23 3时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。pHpH值在值在7 7左右时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。左右时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。51微生物的生命活动对环境微生物的生命活动对环境pHpH值的影响值的影响5253第四节：微生物培养法概论 一、实验室培养法：一、实验室培养法：1 1、固体培养法固体培养法（1 1）、好氧菌的固体培养法：）、好氧菌的固体培养法：主要用试管斜面（主要用试管斜面（test-tube slanttest-tube slant）、培）、培养皿琼脂平板（养皿琼脂平板（agar plateagar plate）及较大型的）及较大型的克氏扁瓶（克氏扁瓶（kolle flaskkolle flask）、茄子瓶等进行）、茄子瓶等进行平板培养。平板培养。54（2）、厌氧菌的固体培养高层琼脂柱高层琼脂柱厌氧培养皿厌氧培养皿厌氧培养皿厌氧培养皿亨盖特滚管技术亨盖特滚管技术厌氧罐（厌氧罐（anaerobicanaerobic）技术）技术厌氧手套箱（厌氧手套箱（anaerobic glove boxanaerobic glove box）技术）技术5556对厌氧罐反复对厌氧罐反复抽真空、灌氮抽真空、灌氮气，剩余氧在气，剩余氧在钯催化剂的催钯催化剂的催化下，与灌入化下，与灌入混合气体中的混合气体中的氢气还原成水氢气还原成水而除去，从而而除去，从而形成良好的无形成良好的无氧环境。氧环境。57厌氧手套箱（厌氧手套箱（anaerobic glove boxanaerobic glove box）技术：箱内）技术：箱内始终充满成分为始终充满成分为N N2 2：COCO2 2：H H2 28585：5 5：1010（V/VV/V）的）的隋性气体，并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状隋性气体，并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状态。通过塑料手套进行操作。态。通过塑料手套进行操作。582、液体培养法：(1)(1)好氧菌的液体培养：好氧菌的液体培养：好氧菌的液体培养：好氧菌的液体培养：试管液体培养试管液体培养试管液体培养试管液体培养三角瓶浅层液体培养：一般仅适用于兼性厌氧菌的三角瓶浅层液体培养：一般仅适用于兼性厌氧菌的三角瓶浅层液体培养：一般仅适用于兼性厌氧菌的三角瓶浅层液体培养：一般仅适用于兼性厌氧菌的培养培养培养培养摇瓶培养：又称振荡培养。摇瓶培养：又称振荡培养。摇瓶培养：又称振荡培养。摇瓶培养：又称振荡培养。台式发酵罐台式发酵罐台式发酵罐台式发酵罐596061(2)厌氧菌的液体培养：n n放入厌氧罐或培养基中加入巯基乙酸、半放入厌氧罐或培养基中加入巯基乙酸、半胱氨酸、维生素胱氨酸、维生素C或庖肉（牛肉小颗粒）等或庖肉（牛肉小颗粒）等有机还原剂。或加入铁丝等能显著降低氧有机还原剂。或加入铁丝等能显著降低氧化还原电位的无机还原剂。再在液面上封化还原电位的无机还原剂。再在液面上封石蜡油或凡士林。石蜡油或凡士林。62二、工业生产培养微生物的方法和装置1、固态培养法：固态培养法：好氧菌的曲法培养好氧菌的曲法培养 瓶曲瓶曲 袋曲袋曲 盘曲盘曲 通风曲通风曲厌氧菌的堆积培养法厌氧菌的堆积培养法632、液体培养法：好氧菌的浅盘培养好氧菌的浅盘培养好氧菌的浅盘培养好氧菌的浅盘培养深层液体通气培养：发深层液体通气培养：发深层液体通气培养：发深层液体通气培养：发酵罐酵罐酵罐酵罐6465大型发酵罐搅拌装置66第五节：有害微生物的控制第五节：有害微生物的控制一、一、基本概念：基本概念：控制（有害）微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。67 1 1、灭菌、灭菌、灭菌、灭菌(Sterilization)(Sterilization)：用理化因素杀死包括芽孢：用理化因素杀死包括芽孢：用理化因素杀死包括芽孢：用理化因素杀死包括芽孢在内的所有微生物。在内的所有微生物。在内的所有微生物。在内的所有微生物。2 2消毒消毒消毒消毒(Disinfection)(Disinfection)：杀死或灭活病原微生物：杀死或灭活病原微生物：杀死或灭活病原微生物：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）。（营养体细胞）。（营养体细胞）。（营养体细胞）。3 3防腐防腐防腐防腐(Antisepsis)(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食：防止或抑制霉腐微生物在食：防止或抑制霉腐微生物在食：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长。品等物质上的生长。品等物质上的生长。品等物质上的生长。方法：低温方法：低温方法：低温方法：低温 缺氧缺氧缺氧缺氧 干燥干燥干燥干燥 高渗高渗高渗高渗 高酸度高酸度高酸度高酸度 高醇度高醇度高醇度高醇度 加防腐剂加防腐剂加防腐剂加防腐剂 684 4化疗化疗(Chemotherapy)(Chemotherapy)：利用高度选择毒力的：利用高度选择毒力的化学物质杀死或抑制宿主体内的病原微生物生化学物质杀死或抑制宿主体内的病原微生物生长繁殖，借以治疗该宿主传染病的措施。长繁殖，借以治疗该宿主传染病的措施。69二、物理杀菌因素温度 辐射作用 过滤 渗透压 干燥 超声波等70高压蒸汽灭菌法（常规高压灭菌）高压蒸汽灭菌法（常规高压灭菌）利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 100 以上高温灭菌的方法。以上高温灭菌的方法。方法：方法：121121（1kg/cm1kg/cm2 2或或1515磅磅/英寸英寸2 2）维持）维持1515-20min-20min。112112（0 0.5.5kg/cmkg/cm2 2或或8 8磅磅/英寸英寸2 2）2020-3 30min0min。11115 5（0.750.75kg/cmkg/cm2 2或或1111磅磅/英寸英寸2 2）2020-3 30min0min。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121 121。含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112 112。适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。71高高 压压 蒸蒸 汽汽 灭灭 菌菌 锅锅注意事项：注意事项：排净冷空气；排净冷空气；灭菌终了，缓慢降压。灭菌终了，缓慢降压。72影响加压蒸汽灭菌效果的因素n n菌量菌量n n灭菌锅内空气排除程度灭菌锅内空气排除程度n npHn n灭菌对象的体积灭菌对象的体积n n加热与散热速度加热与散热速度73高温对培养基的影响及其防止措施高温对培养基的影响及其防止措施消除有害影响的措施消除有害影响的措施 采用特殊的加热灭菌法采用特殊的加热灭菌法 过滤除菌法过滤除菌法 其它方法：加入螯合剂其它方法：加入螯合剂74空气和不耐热的液体培养基的灭菌棉花、玻璃纤维或石棉滤膜核孔752 2、紫外线：用于手术室，无菌室，包装室、紫外线：用于手术室，无菌室，包装室、紫外线：用于手术室，无菌室，包装室、紫外线：用于手术室，无菌室，包装室一般一般一般一般3030WW的紫外灯可用于的紫外灯可用于的紫外灯可用于的紫外灯可用于1515MM2 2的房间消毒的房间消毒的房间消毒的房间消毒3 3、可见光、可见光、可见光、可见光可见光对光合微生物有直接影响：可见光对光合微生物有直接影响：可见光对光合微生物有直接影响：可见光对光合微生物有直接影响：强烈的可见光可引起微生物死亡，由于光氧化作强烈的可见光可引起微生物死亡，由于光氧化作强烈的可见光可引起微生物死亡，由于光氧化作强烈的可见光可引起微生物死亡，由于光氧化作用所致；光被细胞色素吸收后，有氧时引起一些用所致；光被细胞色素吸收后，有氧时引起一些用所致；光被细胞色素吸收后，有氧时引起一些用所致；光被细胞色素吸收后，有氧时引起一些酶或其它敏感成分失去活性。酶或其它敏感成分失去活性。酶或其它敏感成分失去活性。酶或其它敏感成分失去活性。4 4、电离辐射、电离辐射、电离辐射、电离辐射 射线，射线，射线，射线，射线，射线，射线，射线，射线等可使被照物中水射线等可使被照物中水射线等可使被照物中水射线等可使被照物中水分子发生电离产生游离基，游离基与细胞中敏感分子发生电离产生游离基，游离基与细胞中敏感分子发生电离产生游离基，游离基与细胞中敏感分子发生电离产生游离基，游离基与细胞中敏感蛋白作用使之失活，从而导致细胞死亡。蛋白作用使之失活，从而导致细胞死亡。蛋白作用使之失活，从而导致细胞死亡。蛋白作用使之失活，从而导致细胞死亡。76评价指标评价指标:最低抑菌浓度最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC):(minimum inhibitory concentration,MIC):指在一定条件下指在一定条件下,某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度。某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度。半数致死量（半数致死量（50%lethal dose,LD50%lethal dose,LD5050)：指在一定条件下：指在一定条件下,某化学药剂能杀死某化学药剂能杀死50%50%试验动物时的剂量。试验动物时的剂量。最低致死量（最低致死量（minimum lethal dose,MLD):minimum lethal dose,MLD):指在一定条件下指在一定条件下,某化学药物能引起试验动物群体某化学药物能引起试验动物群体100%100%死亡率的最低剂量。死亡率的最低剂量。三、化学杀菌剂、消毒剂、治疗剂三、化学杀菌剂、消毒剂、治疗剂 77消毒剂消毒剂:可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂的化学试剂.主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。环境中的微生物。防腐剂防腐剂:可以抑制或阻止微生物生长，但对人体或动物体的毒性可以抑制或阻止微生物生长，但对人体或动物体的毒性较低的化学药剂较低的化学药剂.用于肌体表面，如皮肤、粘膜、伤口等处用于肌体表面，如皮肤、粘膜、伤口等处防止感染，也有的用于食品、饮料药品的防腐作用。防止感染，也有的用于食品、饮料药品的防腐作用。但现时消毒剂和防腐剂间的界限已并不很严格但现时消毒剂和防腐剂间的界限已并不很严格.（一）表面（一）表面消毒剂消毒剂78各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：石炭酸系数：石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为1010分钟，而供试菌定为分钟，而供试菌定为Salmonella typhiSalmonella typhi（伤寒沙门氏菌）。（伤寒沙门氏菌）。在临床上最早使用的消毒剂在临床上最早使用的消毒剂-石炭酸石炭酸79 类类类类型型型型 名称及使用方法名称及使用方法名称及使用方法名称及使用方法 作用原理作用原理作用原理作用原理 应用范围应用范围应用范围应用范围 醇醇醇醇类类类类70%70%70%70%75%75%75%75%乙醇乙醇乙醇乙醇脱水、蛋白质脱水、蛋白质脱水、蛋白质脱水、蛋白质变性变性变性变性皮肤、器皿皮肤、器皿皮肤、器皿皮肤、器皿 醛醛醛醛类类类类0 0 0 0.5.5.5.5%10%10%10%10%甲醛甲醛甲醛甲醛2%2%2%2%戊二醛（戊二醛（戊二醛（戊二醛（pH=8pH=8pH=8pH=8）蛋白质变性蛋白质变性蛋白质变性蛋白质变性房间、物品消毒（不房间、物品消毒（不房间、物品消毒（不房间、物品消毒（不适合食品厂）适合食品厂）适合食品厂）适合食品厂）酚酚酚酚类类类类3%3%3%3%5%5%5%5%石炭酸石炭酸石炭酸石炭酸 2%2%2%2%来苏儿来苏儿来苏儿来苏儿3%3%3%3%5%5%5%5%来苏儿来苏儿来苏儿来苏儿破坏细胞膜、破坏细胞膜、破坏细胞膜、破坏细胞膜、蛋白质变性蛋白质变性蛋白质变性蛋白质变性地面、器具地面、器具地面、器具地面、器具皮肤皮肤皮肤皮肤地面、器具地面、器具地面、器具地面、器具氧化氧化氧化氧化剂剂剂剂0 0 0 0.1.1.1.1%高锰酸钾高锰酸钾高锰酸钾高锰酸钾3%3%3%3%过氧化氢过氧化氢过氧化氢过氧化氢0 0 0 0.2.2.2.2%0.5%0.5%0.5%0