T_SPPHN 001-2023 2.0 亿CFU mL 嗜硫小红卵菌HNI-1悬浮剂.docx

学兔兔标准下载T/SPPHN 001-2023ICS 01.040.65CCS B15/19T/SPPHN湖南省植物保护学会团体标准T/SPPHN 001-20232.0 亿 CFU/mL 嗜硫小红卵菌 HNI-1悬浮剂Rhodovulum sulfidophilum HNI-1 2.0×108CFU/mL SC23 -11-20 发布2023 -11-20 实施湖南省植物保护学会 发布学兔兔标准下载T/SPPHN 001-2023前言本文件是根据GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由湖南省植物保护研究所提出。本文件由湖南省植物保护学会归口。本文件起草单位：湖南省植物保护研究所、中国农业科学院植物保护研究所、宁波大学、湖南新长山农业发展股份有限公司。本文件主要起草人：刘勇、张德咏、李方方、张松柏、羊健、燕飞、史晓斌、戴建平、苏品、周波、罗香文、王忠勇、张体伟。项目技术指标有效活菌数CFU/mL                                      82.0×10杂菌率(%)                                                     10水不溶物质量分数(%)                                0.2pH值6.58.5学兔兔标准下载T/SPPHN 001-20232.0 亿 CFU/mL 嗜硫小红卵菌 HNI-1 悬浮剂1 范围本文件规定了2.0 亿CFU/mL 嗜硫小红卵菌HNI-1 悬浮剂的要求、试验方法、检验规则、标志、包装、贮运、安全和保证期。本文件适用于以嗜硫小红卵菌活菌体加工而成的悬浮剂。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 1601 农药PH值的测定方法GB/T 1604 商品农药验收规则GB/T 1605-2001 商品农药采样方法GB/T 3796 农药包装通则GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 14825-2006 农药悬浮率测定方法GB/T 16150-1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法GB/T 28136-2011 农药水不溶物测定方法GB/T 28137-2011 农药持久起泡性测定方法GB/T 31737-2015 农药倾倒性测定方法HG/T 2467.6-2003 农药水剂产品标准编写规范3 术语和定义本文件无术语和定义。4 要求4.1 组成与外观本品为红色液体，有轻微臭味，存放过程中可能出现轻微沉淀，但经摇匀后应恢复原状。4.2 产品技术指标应符合表 1 的要求表1  2.0  亿 CFU/mL 嗜硫小红卵菌 HNI-1 悬浮剂控制项目指标1悬浮率（有效成分）/（%）                         80倾倒性倾倒后残余物/（%）        5.0洗涤后残余物/（%）        0.5持久起泡性（1 min后泡沫量）/mL            1.0细度（75m）/（%）                                    98稀释稳定性合格低温稳定性    a)合格热贮稳定性    b)合格a)，b)注：        低温稳定性、热贮稳定性实验，在正常生产时每3个月至少进行一次。学兔兔标准下载T/SPPHN 001-20235 试验方法5.1 一般规定本标准所有试剂和水在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682-2008中规定的三级水。检验结果的判定按GB/T8170中的4.3.3修约比较法进行。5.2 抽样按照 GB/T 1605-2001 中“液体制剂采样”方法进行，用随机数表法确定抽样的包装件数，最终抽样量不少于 200mL。5.3 有效活菌数与杂菌率的测定有效活菌数采用最大可能数计数法（MPN）测定；杂菌数采用平板菌落计数法测定，测出杂菌数（包括细菌和霉菌）后，再按照杂菌率的计算方式进行计算。5.3.1试剂和溶液无菌水；光合细菌的双层培养基：遵照附录D的规定；有效活菌数测定用培养基：遵照附录D的规定；杂菌数测定用培养基：细菌培养基按 GB/T4789. 28-2003 中 4.8 规定，霉菌培养基遵照附录 D 的规定。5.3.2试验仪器手持扩大镜（10倍）；V8漩涡混合器（转速范围：200 rpm/min3000 rpm/min，无级调速）；ECC-150A恒温培养箱控温范围：RT+580，温度显示精度：0.1，控温精度：±0.1，控温均匀度：±0.5(37时)；EOF-150A恒温烘箱控温范围：RT+10220，温度显示精度：0.1，控温精度：±1，控温均匀度：±1.5(150时)；高压蒸汽消毒器；灭菌的培养皿：直径9cm；灭菌的螺口试管、灭菌的锥形瓶；灭菌的玻璃刮刀；灭菌的0.5mL、l.0 mL、15mL吸管。2学兔兔标准下载T/SPPHN 001-20235.3.3菌株鉴别根据代表菌株的形态学和生理生化特征进行菌种鉴别，并可辅助结合16S rDNA基因序列分析等手段。当对鉴别结果有争议或者需要进行法律仲裁检验时，应到具有菌株鉴定资质的单位，将待检菌株与模式菌株进行比对，出具菌种鉴定报告，作为仲裁依据。有效成分的特征参见附录A。菌种鉴别方法参见附录B。16S rDNA基因序列分析进行菌种鉴别参见附录C。5.3.4有效活菌数的测定采用平板菌落计数法（A）或最大可能数法（MPN 法）（B）测定有效活菌数量。A. 平板菌落计数法（1）仪器设备：9cm 灭菌培养皿 30 个、移液枪 1mL、10mL、灭菌枪头、涂布棒、超净工作台、2mL 灭菌离心管 10 个、封口膜或保鲜膜。（2）光合细菌双层平板培养基参见附录 D。（3）操作步骤：1）菌液稀释将菌液用无菌水于 2mL 离心管中逐级稀释为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10 等十个浓度，分别做好标记。2）培养基的配置按要求分别配置上层和下层培养基，灭菌备用。3）倒下层培养基融化下层培养基，倒平板（约 33mL/板）超净工作台中冷却待用。4）涂菌按无菌操作要求，用移液枪吸取 100L 菌液到冷却凝固的下层培养基上，用涂布棒涂抹均匀。5）倒上层培养基融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至 50左右时，将其倒入已涂菌的下层培养基上，超净工作台中冷却至室温。6）用封口膜或保鲜膜将培养皿密封7）放置于 30±1的恒温培养室，在 2500lx3000lx 的白炽灯下光照培养 7d10d，倒置培养。注：每个浓度重复三次。（4）活菌数的计算方法可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。选取菌落数在 30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。若三个稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均不在 30300 之间，则以最接近 300 或 30 的平均菌落乘以稀释倍数。B. 最大可能数（MPN）法（1）试验仪器：10mL 螺口试管 20 个、灭菌、试管架、移液枪 10mL 或 5mL、1mL、灭菌枪头、超净工作台、封口膜或保鲜膜。3学兔兔标准下载T/SPPHN 001-2023（2）光合细菌培养基配方：有效活菌数测定用培养基，配方参见附录 D。（3）操作步骤：选取 10-8、10-9、10-10 三个浓度梯度的稀释液做测定用。取 20 支装有 9mL 培养基的灭菌螺口试管，分别按 3 管一组标记为 10-8、10-9、10-10、CK。用 1mL 灭菌枪头按无菌操作要求吸取每个浓度梯度的稀释液各 1mL 放入对应编号的试管中，拧好试管盖。标记为 CK 的 3支试管加入灭菌水 1mL 做对照。放置于 30±1的恒温培养室，在 2500lx3000lx 的白炽灯下光照培养 7d10d，统计每个浓度下三支试管整支变红的管数，将变红管数在三个浓度下的分布形式对应到 MPN 表（见附录 E），获得相应的 MPN 数值，MPN 值×107 即为样品中有效活菌数浓度。5.3.5杂菌率的测定5.3.5.1 细菌数的测定与计算方法(1) 细菌数的测定选取 10-5、10-6、10-7 三个浓度梯度的稀释液，用 0.5mL 无菌吸管吸取 0.1mL，分别加至含有 15mL 营养肉汤培养基的培养皿(直径为 9cm)表面，用无菌玻璃刮刀将稀释液均匀涂布，待菌液全部渗入培养基后，放置于 36±1的恒温培养箱内倒置培养 48±2 h。每一浓度重复三次，同时设置加无菌水的空白对照。用肉眼计数菌落，必要时可借助手持放大倍数为10 倍的扩大镜。(2) 细菌数的计算方法以平板上出现 30 个300 个菌落数的稀释度平板为计数标准。当只有一个稀释度，其平均菌落数在 30300 之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释度倍数。若有两个稀释度，其平均菌落数均在 30300 之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比例小于 2 应计数两者的平均数。若大于 2 则计数其中稀释较小的菌落总数。若三个稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀稀度的平均菌落数均不在 30300 之间，则以最接近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数。5.3.5.2 霉菌数的测定与计算方法(1) 霉菌数的测定选取 10-5、10-6、10-7 三个浓度梯度的稀释液，用 0.5mL 无菌吸管吸取 0.1mL，分别加至含有 15mL 马丁培养基的培养皿表面，用无菌玻璃刮刀将稀释液均匀涂布，待菌液全部渗入培养基后，放置于 2528的恒温培养箱内，3d 后开始观察，共培养观察 5d。每一浓度重复三次，同时设置加无菌水的空白对照。用肉眼计数菌落，必要时可借助手持放大倍数为 10 倍的扩大镜。(2) 霉菌的计算方法通常选择菌落数在 10150 之间的平皿进行计数，同稀释度的 2 个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每毫升检样中所含的霉菌数。5.3.5.3 杂菌率的计算方法4学兔兔标准下载T/SPPHN 001-2023菌剂含杂菌率(X)按下式计算：式中：X 杂菌率，%；Z1杂菌数(包括细菌和霉菌)，CFU/mL；Z2有效菌数，CFU/mL。5.4 水不溶物质量分数的测定按GB/T 28136-2011 农药水不溶物测定方法测定。5.5 pH 值测定按 GB/T 1601 的规定进行测定。5.6 悬浮率测定5.6.1实验仪器1)量筒：250mL 具塞量筒、100mL 普通量筒；2)真空吸液器；3)秒表；4)三角瓶：250mL；5)恒温水浴锅。5.6.2标准硬水配制方法按 GB/T 14825-2006 中标准硬水配制方法进行。5.6.3操作步骤将样品摇匀取 5.00mL(精确到 0.01mL)，于 250mL 三角瓶中，加入标准硬水 100mL，用手旋转振荡 50 次后转移到 250mL 具塞带刻度量筒中，三角瓶用标准硬水清洗两次，清洗液一并收集到 250mL 具塞带刻度量筒中，用标准硬水定容到 250mL。将量筒放入（30±2）恒温水浴锅中放置 5min，将量筒盖好，左手托住量筒底部，右手握住量筒顶部并用食指按住塞子，颠倒量筒 30 次充分混匀，打开量筒塞子后重新将其放入恒温水浴锅中，竖直静置30min。用真空吸液器自上而下将上层液体抽走 225mL，抽液过程中调整适当的真空度，吸液管嘴紧贴量筒管壁并保持在液面下 3mm5mm 处跟随液面下降，勿搅动下部沉淀。量筒内余留的 25mL 悬浮液，按 5.3.4 进行有效活菌数的测定，此活菌数浓度记为 C1。5.6.4计算样品中的悬浮率(Y)按下列公式进行计算Y=（1-C1/C0）×1.1111×100式中：C0步骤5.6.3中所取样品中的有效活菌数；C1量筒底部余留的25mL悬浮液的有效活菌数；1.1111换算系数5学兔兔标准下载T/SPPHN 001-20235.6.5允许差两次重复测定结果之差应不超过10%。5.7 倾倒性的测定按GB/T 31737-2015进行。5.8 持久起泡性的测定按GB/T 28137-2011进行。5.9 细度的测定按GB/T 16150-1995中2.2进行测定，使用200目、孔径75m的标准筛。5.10稀释稳定性实验按HG/T 2467.6-2003中4.9进行。静置1h后，如稀释液均一，无析出物为合格。5.11低温稳定性实验5.11.1 实验仪器低温恒温培养箱：（120）±1；烧杯：100mL。5.11.2 实验方法取80mL试样置于100mL烧杯中，在低温恒温箱中（6±2）保持1h，期间每隔15min搅拌1次，每次15s，观察外观有无变化。将烧杯放回低温恒温箱中，（6±2）继续放置7天。7天后将烧杯取出恢复至室温，测试有效活菌数应大于等于2.0×108亿CFU/mL，则符合标准要求判定为合格。5.12热贮稳定性实验5.12.1 方法提要试样在（45±2）恒温环境下，密封保存14d，取出测试其有效活菌数。5.12.2 实验仪器恒温箱（或恒温水浴锅）：（1099）±2；45 仍能密封的具塞玻璃瓶：50mL；医用注射器：50mL。5.12.3 实验步骤用注射器将约30mL试样，注入洁净的玻璃瓶中，置此玻璃瓶于冰盐浴中致冷，用塞子迅速封口。至少封3瓶，分别称量。将封好的玻璃瓶置于金属容器内，再将金属容器放入（45±2）恒温箱（或恒温水浴锅）中，放置14d，取出冷至室温，将玻璃瓶拭净，于24h内，按本标准4.3规定的方法进行检测，测试有效活菌数应大于等于1.6×108亿CFU/mL，则符合标准要求判定为合格。6 检验规则6学兔兔标准下载T/SPPHN 001-2023符合GB/T 1604有关规定。数值修约规则和极限值按GB/T 8170处理。7 标志、标签、包装、贮运、安全和保证期7.1 标志、标签、包装、贮运产品的标志、标签和包装应符合GB 3796的规定。采用聚乙烯塑料瓶包装或铝箔袋包装。外包装采用塑料桶或纸箱。也可根据用户要求或订货协议，采用其他形式的包装，但需符合GB 3796中的有关规定。本产品应贮存于640、干燥、阴凉的库房内，不得露天堆放，以防雨淋和日晒，避免阳光直射，防止长时间40以上高温。运输过程中应有遮盖物，防日晒、雨淋及40以上高温。气温低于6时需用保温车运输。轻装轻卸，避免破损。7.2 安全嗜硫小红卵菌悬浮剂属于微毒杀菌剂，操作时应穿戴好防护用品，如不慎溅到眼睛或皮肤，用大量清水冲洗干净，如误服请携标签立即送医院对症治疗。7.3 保证期在规定的贮运条件下，从生产日期算起，保证期为1年。在保证期内，各项指标仍应符合表1参数的80%及以上的要求。7学兔兔标准下载T/SPPHN 001-2023附录 A（规范性）嗜硫小红卵菌 HNI-1 菌株来源：从海南省海水水样中分离、纯化获得。菌体形态见图A-1。图 A-1 嗜硫小红卵菌扫描电镜嗜硫小红卵菌属于光合细菌中的一种。光合细菌是地球上出现最早、具有原始光能合成体系的原核生物，在自然界中普遍存在。是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，是一类没有形成芽孢能力的革兰氏阴性菌，因具有细菌叶绿素和类胡萝卜素等光合色素，呈现一定颜色。嗜硫小红卵主要生物学特性：细胞卵圆形至杆形，0.50.9m×0.92.0m。单极生鞭毛运动或不运动，兼性厌氧光养菌。生理生化测试结果：革兰氏染色阴性，V-P 反应阳性，甲基红反应阴性，不能利用淀粉，H2S 反应阳性；可以利用多种小分子的有机酸（甲酸钠、乙酸钠、乳酸钠、丙酮酸）生长，也能利用部分糖类和醇类化合物（丙三醇、葡萄糖醇、肌醇、葡萄糖、木糖、蔗糖、甘露糖）进行生长，在蛋白胨和酵母膏中生长最好，不能利用NaHCO3；在 883nm、808nm、593nm、382nm 有特征吸收峰；最适生长温度和 PH 分别为3035、pH 7.0，培养物为红色，菌株在黑暗好氧条件生长慢、耐盐。嗜硫小红卵菌生物活性研究及应用评述：从海南省海水水样中分离出一株嗜硫小红卵菌，命名 HNI-1，选取黄瓜霜霉病菌作为供试病原菌。采用 FAO（1982 年）推荐的叶盘漂浮法。根据每个叶盘上发病面积占该叶盘面积的百分率，计算光合细菌发酵液对黄瓜霜霉病的抑制率，发现发酵液稀释 5 倍时，抑制率均值为 78.33%，发酵液稀释 10 倍时，抑制率均值为 73.33%，发酵液稀释 20 倍时，抑制率均值为 54.07%。HNI-1培养液对黄瓜幼苗具有显著的促生作用，当菌株培养液培养至对数生长期后，将菌株培养液加入黄瓜幼苗水培营养液中，检测0天、3天、6天、9天、12天、15天后，幼苗的各项生物学指标。结果表明，菌株培养液对黄瓜幼苗的根长、生物量有显著的促进作用，且经菌株培养液处理后的黄瓜幼苗的过氧化物酶活显著提高，IAA含量和游离氨基酸的含量有显著提高。8特征嗜硫小红卵菌（R.sulfidophilum）亚德里亚小红卵菌（R.adriaticum）广海小红卵菌（R.euryhalinum）R.iodosumR.robiginosum苛求小红卵菌(R.strictum)细胞直径(m)0.6-0.90.5-0.80.7-1.00.5-0.80.5-0.80.6-1.0运动能力+-+-+生长最适NaCl 范围(%)1-62.5-7.50.5-122.5-52.5-50.8-1.0最适 pH 范围6.5-8.06.5-7.07.0-8.06.5;7.0-7.36.5;7.3-7.78.0-8.5好氧黑暗生长能力+-+硫化物耐受能力高（浓度1-2 mM）高高ndnd高硫酸盐同化能力+-+生长因子需求b，n，p-ABA，tb，tb，n，p-ABA，tb，nb，nb，p-ABA，t氢气利用+-+-二价铁利用-+nd标准下兔学兔载T/SPPHN 001-2023附录 B（规范性）菌种鉴别生理生化特征法1 主要仪器设备和材料除常规微生物试验操作所需要的设备和培养条件，其他还包括：万分之一天平；生物显微镜（10×100 倍）；高压蒸汽灭菌锅；恒温培养箱；移液器；移液管；试管（15mL）及试管架；菌落计数器；匀质器；L 形玻璃棒；培养皿（9cm）；载玻片；盖玻片；紫外分光光度计等。2 主要培养基和试剂2.1 试剂：结晶紫、乙醇、草酸氨、碘、碘化钾、丙酮、番红、过氧化氢、性氧化钠、肌酸、溴甲酚紫、可溶性淀粉、对二甲基氨基苯甲醛、浓硫酸、浓盐酸、L-酪氨酸、氯化钠、硝酸钾、-萘酸、二苯胺、乙醚、马尿酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠、谷氨酸钠、生物素、尼克酰胺、硫胺素、对氨基苯甲酸等。2.2 培养基：光合细菌的双层培养基（附录 D）3 形态学特征鉴别3.1 染色：在光合细菌双层培养基上生长 7296h 的目标菌株涂片，空气干燥（非热固定）后，进行革兰氏染色，蓝紫色为阳性，红色为阴性。3.2 菌体观察：用生物显微镜观察菌体形态，细胞直径、运动功能等。3.3 菌落形态观察：在光合细菌双层培养基上生长 7296h，观察菌落的形态和产色素等。3.4 培养条件：本方法内，除暗室培养特殊要求，所有光合细菌培养均在光照 1500 lux，30 条件下进行；固体培养采用双层平板法，液体培养采用 250 mL 血清瓶加满培养基至瓶口厌氧培养。4 生理生化特征鉴别嗜硫小红卵菌（Rhodovulum sulfidophilum）及其近似种的生理生化特征检表 B.1。表 B.1  嗜硫小红卵菌（Rhodovulum sulfidophilum）及其近似种的生理生化特征检表9柠檬酸钠-+酒石酸钠-ndnd+甘露醇±-±+-甘油+-+-乙醇±+±-葡萄糖酸盐nd+ndndndndMol % G+C66.3-66.6(HPLC)，68.9-73.2(Tm)64.9-66.7(Tm)62.1-68.6(Tm)66(HPLC)69(HPLC)67.3-67.7(HPLC)碳源利用学兔兔标准下载T/SPPHN 001-2023符号及缩写：+，阳性；-，阴性；±，不同菌株中存在差异；  b，生物素；n，尼克酰胺；t，硫胺素；p-ABA，对氨基苯甲酸；nd，未确定。4.1 生长最适氯化钠范围(%)光合细菌培养基中加入不同浓度的氯化钠，起始浓度为 0%，按 0.25%为梯度，依次配置各个梯度浓度至 10%。将目标菌株采用 250 mL 血清瓶液体光照培养（7296）h，与未接种的对照比较，目测生长情况。4.2 最适 pH 范围用盐酸分别调节光合细菌培养基的 pH 值 5.09.0。采用 250 mL 血清瓶液体光照培养将目标菌株培养（7296）h 后目测生长情况。4.3 好氧黑暗生长能力在锥形瓶中加入瓶体积 25%的用光合细菌培养基，接入培养基 5%体积的目标菌株菌液，封口膜（可通气）封口后，在 180rmp 条件下暗室震荡培养，（7296）h 后目测生长情况。4.4 硫化物耐受能力光合细菌培养基中分别加入不同浓度的硫化物，起始浓度为 0mM，按 0.25mM 为梯度，依次配置各个梯度浓度至最高浓度：硫化钠（3mM）、亚硫酸钠(0.5mM)、硫代硫酸钠(5mM)。采用 250mL 血清瓶液体光照培养将目标菌株培养（7296）h 后目测生长情况。4.5 硫酸盐同化能力在光合细菌培养基配方中去除出含硫元素成分：（NH4）2SO4、FeSO4。将目标菌株利用该培养基，采用 250mL 血清瓶液体光照培养 72 小时，然后将目标菌株接入添加了 0.5mmol/L的（NH4）2SO4 相同培养基中，采用 250mL 血清瓶液体光照培养（7296）h 后目测生长情况。4.6 生长因子目标菌对生长因子需求测定方法，在光合细菌培养基中，不加入原有成分 yeast extract，而是分别加入：b，生物素；n，尼克酰胺；t，硫胺素；p-ABA，对氨基苯甲酸，浓度为 0.1%的五种培养基。接种目标菌株，厌氧光照培养（7296）h 后，观察菌株生长情况。4.7 氢气利用配 制基 础 培养 基 ：1000mL 蒸 馏水 中 加入 2.0g (NH4)2SO4、 0.2g MgSO4·7H2O 、0.5gNaH2PO4·H2O、0.1g CaCl2·2H2O、0.5g K2HPO4。培养基中不含碳源。将目标菌株接入到含有 250mL 基础培养基的 500mL 锥形瓶中，封口后，往瓶中不断通入二氧化碳与氢气，二氧化碳流速为 5mL/min，氢气流速为 20mL/min。光照培养 7296h 后，观察菌株生长情况。4.8 二价铁利用主要参考目标菌在 FeSO4 存在与否的情况下的生长情况。以光合细菌培养基为参照，分别配置含有与不含有 FeSO4·7H2O 两种培养液，采用 250mL 血清瓶液体光照培养将目标菌株培养（7296）h 后目测生长情况。4.9 碳源与化合物利用10学兔兔标准下载T/SPPHN 001-2023配 制基 础 培养 基 ：1000mL 蒸 馏水 中 加入 2.0g (NH4)2SO4、 0.2g MgSO4·7H2O 、0.5gNaH2PO4·H2O、0.1g CaCl2·2H2O、0.5g K2HPO4。将 1.0g 被测底物：柠檬酸钠、酒石酸钠、甘露醇、甘油、乙醇、葡萄糖酸盐分别加入到基础培养基中配置成待测培养基。将目标菌株接种到待测培养基中，采用 250mL 血清瓶液体光照培养将目标菌株培养（7296）h 后目测生长情况。4.10 G+C mol%先液体培养目标菌株，将采用细菌 DNA 提取试剂盒，参照试剂盒使用说明书提取目标菌株 菌 DNA。取 少量 样品 DNA 使用 1%琼脂 糖凝 胶电泳 检测 其条带 和浓度 ，并 采用NanoDrop2000 测定浓度，-20冰箱保存备用。Tm 测定：利用带加温装置的紫外分光光度计，波长固定于 260nm；将待提取 DNA 测样品用 0.1SSC 稀释至 OD260 值于 0.30.6 间；在波长 260nm 首先记录 25的吸光度（A25）然后温度迅速上升至 50；每隔 35记录一次；OD 值开始上升表示变性开始，每隔 1稳定 5min，记录杯内温度和 OD 值，直至OD 值不变表示变性完毕。Tm 值计算：（1）热变形温度测定完成后，将记录的温度和相应光密度整理成表；（2）各光密度乘相应温度的相对膨胀系数（Vt）与 25时光密度相比Vt/V25，求得相对的光密度；（3）以温度为横坐标，以相对光密度为纵坐标，绘制热变性曲线。热变形曲线中点相对应的温度即为熔链温度（Tm 值）。最后按照公式进行 G+Cmol%含量计算：0.1SSC：G+Cmol%=2.44Tm-69.31SSC：G+Cmol%=2.08Tm-106.4注：必须以大肠埃希氏菌（E.coliK12）为参比操作对照，以核实实验误差。11学兔兔标准下载T/SPPHN 001-2023附录 C（规范性）菌种鉴别方法16S rDNA 基因序列分析法1 样品 DNA 提取将目标菌株涂布法在双层培养基平板上培养（710）d，挑取红色单菌落，采用细菌DNA 提取试剂盒，参照试剂盒使用说明书提取细菌 DNA。样品 DNA 使用 1%琼脂糖凝胶电泳检测其条带和浓度，并采用 NanoDrop2000 测定浓度，-20冰箱保存备用。2 引物16S rDNA 序列引物对为：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1429R： 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。3 16S rDNA PCR 扩增将检测合格的样品 DNA 作为 PCR 扩增的模板，采用 50L 反应体系进行 PCR 扩增。PCR 扩增体系：5L 10× PCR buffer (含 20mmol/L MgCl2 )， 4 L dNTP， 1L Primer F(上游引物)，1L Primer R（下游引物），0.3L TaqTM DNA 聚合酶，2L 模板 DNA ，ddH2O 补足 50L。PCR 反应条件：95预变性 10 min， 95 变性 45 s，55 退火 1 min，72延伸 45s，循环 35 次; 最后 72延伸 10 min，4保持PCR 扩增产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 反应设立 3 个重复反应管，并用一双蒸水代替模板 DNA 设立阴性对照管。4 PCR 产物检测扩增结束后，PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。回收检测结果正确的条带，送公司测序。5 16S rDNA 序列的测定将测序得到的 16S rDNA 序列提交到 NCBI 核酸数据库已有的核酸序列进行 BLAST 程序对比，通过对比找到与 NCBI 核酸数据库中与嗜硫小红卵菌同源性大于 99%相近序列进而确定菌种。12标准学兔兔下载T/SPPHN 001-2023附录 D（规范性）光合细菌培养基醋酸钠0.5 gYeast extract1.5K2HPO41gKH2PO40.6 g（NH4）2SO40.5gFeSO4·7H2O0.05gH3BO40.05g加蒸馏水至1L琼脂 1.3g（下层） 1.8g（上层）若配双层固体培养基注：根据实际情况将 PH 值调到 7 时的用量为准（K2HPO4）有效活菌数测定的选择性培养基乙酸钠1.64gMgSO4·7H2O0.2gK2HPO40.9gKH2PO40.6gCaCl2·2H2O0.075gEDTA0.02g（NH4）2SO41.32gFeSO4·7H2O0.0118g微量元素溶液0.001L加去离子水至1LpH7.0（用三乙胺碱调）微量元素溶液H2BO20.28gMnSO4·H2O0.21gNa2MoO4·2H2O0.075gZnSO4·7H2O0.24gCuSO4·5H 2O0.004g加去离子水至 0.1L霉菌数测定的马丁培养基KH2PO41.0gMgSO4·7H2O0.5gGlucose10.0g蛋白胨5.0g1%孟加拉红水溶液3.3mL琼脂18g加蒸馏水至1L13阳性管数 95%MPN可信限阳性管数 95%MPN可信限0.100.010.001下限上限0.100.010.001下限上限0003.0-9.5220214.5420013.00.159.6221288.7940103.00.1511222358.7940116.11.218230298.7940206.21.218231368.7940309.43.638300234.6941003.60.1718301388.71101017.21.3183026417180102113.638310439