T_SHZSAQS 00228-2023 乳肉兼用牛Mass Array分型验证多基因聚合效应技术规范.docx

学兔兔标准下载ICS 65.020.30CCS B 40团体标准T/SHZSAQS 002282023乳肉兼用牛 Mass Array 分型验证多基因聚合效应技术规范2023-11-27 发布2023-11-27 实施石河子市质量标准化协会发 布学兔兔标准下载T/SHZSAQS002282023目次前言 . II1范围 . 12规范性引用文件 . 13术语和定义 . 13.1 多基因聚合效应. 13.2 MassARRY 分型技术. 13.3 标记辅助选择. 14主要仪器设备 . 15主要试剂和材料 . 26样本采集 . 27试验步骤 . 27.1 血液基因组 DNA 提取和质检. 27.2 质谱检测引物. 28试验结果 . 29废弃物处理 . 310安全防护 . 311注意事项 . 3附录 A(资料性）. 4I学兔兔标准下载T/SHZSAQS002282023前言本文件参照 GB/T1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则起草。本文件起草单位：石河子大学动物科技学院、新疆生产建设兵团第八师畜牧兽医工作站、天津市武清大孟庄镇农业服务中心。本文件主要起草人：赵宗胜，郑炜，张勇，方晨辉，杨圣贤，叶翠芳，欧四海，李广，何开兵，王丹，武少军。II兔学兔标准下载T/SHZSAQS002282023乳肉兼用牛 Mass Array 分型验证多基因聚合效应技术规范1范围本文件规定了乳肉兼用牛Mass Array分型验证多基因聚合效应的术语与定义及主要仪器设备、主要试剂和材料、样本采集、试验步骤、试验结果、废弃物处理、安全防护、注意事项等。适用于乳肉兼用牛Mass Array分型验证多基因聚合效应。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求DB11T150.1奶牛饲养管理技术规范 第 1 部分：育种3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 多基因聚合效应是指控制数量性状的基因是由大量基因组成的，等位基因之间无显性隐性区分，各对基因对表现型的作用是累加的，每个基因的作用是微小的。3.2 Mass ARRY 分型技术在单碱基延伸的基础上与质谱技术相结合从而进行分型。3.3 标记辅助选择DNA分子的多态性是建立家畜遗传图谱、进行 QTL定位和进行分子标记辅助育种的重要依据。其中的一项成果就是分子标记辅助选择，分子标记可以将家系、表型特征和遗传标记信息进行品种选育。4主要仪器设备1学兔兔标准下载T/SHZSAQS002282023点样仪、飞行质谱仪、配用软件电脑等。试验室用水、试验室质量管理应符合GB/T6682、GB/T19495.2、DB11T150.1相关要求。5主要试剂和材料Onco Carta 扩增 引物 混合 物， 10× PCR Buffer， 20 mmol/L Mg2+plus ，25mmol/LMgCl2，25mmol/L dNTP混合物，5U/ L PCR Enzyme，Primer Mix，10×SAP缓冲液，虾碱性磷酸酶SAP(1.7 U/ L)，10×i Plex Pro缓冲液，Onco Carta 延伸引物混合物，i Plex 终止混合物，Thermo sequenase，Clean Resin树脂，SpectroCHIP芯片，384孔微量反应板等。6样本采集使用含有EDTA抗凝剂的采血管，采集成年母牛尾根静脉血1-3mL，采集完毕后上下颠倒混匀，在采血管壁上清晰记录牛号。样本保存于-20环境下待用。7试验步骤7.1 血液基因组 DNA 提取和质检参照血液基因组DNA提取试剂盒说明书对试验样品血液提取DNA，用超微量紫外可见分光光度计（NanoDrop 2000型）和1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。将质检合格的DNA样品浓度稀释至50ng/ L，放置于-20储存备用。7.2 质谱检测引物根据 SNP位点序列信息，对筛选到的 SNPs 进行引物设计，引物设计完成经软件测试可以使用后交由天津康普森检验检测有限公司进行引物合成及基因分型检测。GHR g.31883049C>A：上游引物ACGTTGGATGGGTAAGCACCAAAGGAAATG，下游引物ACGTTGGATGAGACTGCATAGCCCAGAAAG，延伸引物gggGAATAGTTTTCTATTCCATTTC；DGAT1 g.609870T >C：上游引物ACGTTGGATGAAGCTCTGAGACTCCCCAC，下游引物ACGTTGGATGAGCAGGTTTCTTCTGCCAC，延伸引物CCCCACCCACGGCCT；FSHR g.31251002 T>C：上游引物ACGTTGGATGTTTCTGTTCCTTTTCCTTC，下游引物ACGTTGGATGCTTCCAGAATGGTGCTTCAG，延伸引物gggaTTTTCCTTCTTCCTCCC。8试验结果（1） Mass ARRAY PCR反应：见附表1；Mass ARRAY PCR反应循环数：见附表2-6。（2） 试验效果：如图对SNP位点进行分型，GHR基因存在CC CA AA 三种基因型，DGAT1基因存在TT TC CC 三种基因型，FSHR基因存在CC CT TT三种基因型。2学兔兔标准下载T/SHZSAQS002282023经验证，FSHR(CC)-DGAT1(CC)-GHR(CA)基因型在实验荷斯坦群体中为最优基因型组合，泌乳量最高，乳脂率和乳蛋白率也显著或极显著高于其他基因型组合。9废弃物处理废弃物处理应符合GB/T19495.2、DB11T150.1相关要求。10安全防护安全防护应符合GB/T19495.2、DB11T150.1相关要求。11注意事项实验室检测用的试剂和操作流程应建立完整有效的质量安全管理体系。3标兔学兔准下载T/SHZSAQS002282023附录A(资料性）附表 1Mass ARRAY PCR 反应体系ReagentConcentrationVolumeDNA template10ng/ l1/wellHotStar Taq5U/ l106Primer Mix0.5 M530dNTP Mix25mM53MgCl225mM172.25PCR Buffer with10          331.2515mM MgCl2Water，HPLC gradeNA927.5Total5/well附表 2Mass ARRAY PCR 反应循环数附表 3SAP 消化体系ReagentConcentrationVolume(l)WaterNA810.9SAP Buffer1090.1SAP1.7U/l159Total2/well4学兔兔标准下载T/SHZSAQS002282023附表 4 消化循环数附表 5 延伸反应体系附表 6延伸循环参数5