地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书.docx

地高辛标记与检测D N A 试剂盒说明书集团企业公司编码：LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-地高辛标记与检测DNA试剂盒DIGDNALabelingandDetectionKit承受地高辛-dUTP 进展随机引物 DNA 标记，碱性标记，利用 NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。此试剂盒可对 10ng-3gDNA 进展 25 次标记反响， 可检测 10×10cm2面积的杂交膜 50 张指导手册1 前言1.1 内容表1 前言1.1 内容表1.2 试剂盒成分2.介绍2.1 产品简介3. 操作步骤和所需材料3.1 在你开头前3.2 流程图3.3 地高辛标记 DNA3.4 标记效率确实定3.5DNA 的转移和固定3.6 杂交3.7 免疫检测3.8 DNA 印记的洗脱和再杂交1.2 试剂盒的成分瓶号标记内容包括功能1 无标记比照 DNA12 无标记比照 DNA22 管 1mL3DNA 稀释缓冲液50g/mL 鱼精DNA,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0 在 25澄清溶液20L4DIG 标记的比照DNA5g/mL 质粒 pBR328DNA用 BamHI 线性化澄清溶液用于确定标记效率56六聚核苷酸混合物标记用混合物7DNA 聚合酶 1 大片段标记级200L750U/mL8抗地高辛的碱性磷酸酶结合物从羊中猎取的，Fab 段，结合碱性磷酸酶澄清溶液9NBT/BCIP10封阻试剂附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必需预备一些溶液。在下表中，你可 以找到不同操作程序需要预备的设备概要。操作程序仪器设备试剂3.3DIG-DNA 标记水浴灭菌的双蒸水0.2MpH8.0 灭菌的EDTA3.4 标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜*地高辛洗涤和封阻缓冲组合* TE 缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.5DNA 转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设2×SSC或者 10×SSC在每个操作程序的前面供给了具体的信息。备3.6 杂交尼龙膜，带正电荷*DIGEasyHyb杂交袋*，或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶分子杂交炉杂交缓冲液，需单独购置留意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。3.7 免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶地高辛洗涤和封阻缓冲组合*TE 缓冲液杂交袋*或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.8DNA 斑点的脱色和重标记探针大的托盘水浴DMF 0.2MNaOH，0.1%SDS2×SSC*标记的产品可以从 RocheAppliedScience 获得。2.介绍2.1 产品概况试验原则步骤描述依据随机引物标记技术承受地高辛标记引物获得了地高辛标记的 DNA 探针。地高辛标记的高效引物是一种DNA 标记特地生产的反响混合物，其中含有地高辛 dUTP,碱性标记和全部的试剂，包括随机引物标记所必需的酶， 已预先混合优化的 5×浓度反响缓冲液。依据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。承受碱标记形式的地高辛-11-dUTP 能杂交够更加简洁和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。免疫检测杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进展免疫检此试剂盒承受 DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroidhapten 去标记DNA 探针用于杂交和后续的免疫检测。测，Fab 段，然后承受即时可用的化学发光底物NBT/BCIP 可以看到杂交结果。应用地高辛标记 DNA 探针可以用于：全部类型的滤膜杂交样品材料至少 100bp 的DNA 片段线性的质粒，cos 质粒或者 DNA 超螺旋的 DNA试验时间步骤反响时间DNA 标记1h-O/N杂交6horO/N免疫检测1.5h显色0.5-16h检测数量一个试剂盒足够用于:25 个标准的标记反响，每个反响的膜板 DNA 不超过3g；并可以检测 50 张 10×10cm2的杂交膜。质量掌握依据操作步骤中的说明对未标记的比照 DNA【pBR328】进展标记，并依据下面的标准检测操作方法在点杂交中用 0.1pg 同源 DNA 点在膜上 16h 后成色显影检测。试剂盒的储存和稳定性未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15到-25保质 期印在标签上。在干冰中运输。一旦开封，请依据下表选择适宜的储存条件。试剂盒成分抗地高辛碱性磷酸酶结合物8 号管2-8稳定。储存条件NBT/BCIP(9 号管)封阻液10 号管灵敏度和特异性2-8，避光保存或者 15-25保存 4 周未开封时，2-8或者 15-25稳定；一旦开封，应分装并储存在-15到-25或者无菌条件下 2-8间可以稳定保存 1 个月；工作溶液都应是颖配制的承受 southern 杂交从 1g 人胎盘DNA经 Bgl或 EcoR酶切中检测到单拷贝基因。3. 试验步骤和所需材料3.1 在你开头前主要的操作要求此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示：要求指引在清洁的条件下进展操作高压灭菌地高辛系统的试剂过滤灭菌的溶液包括：SDS,吐温20，并应当参加到已灭菌的溶液中。用干净的孵育托盘每次使用前都要严格地清洗试验托盘处理膜的要求带无粉手套处理膜的时候，只能够用干净的镊子夹膜的边缘3.2 流程图3.3 局部地高辛标记 DNA3.4 局部标记效率的检测3.5 局部DNA 固定3.6 局部杂交3.7 局部免疫检测3.8 局部洗脱和 DNA 斑点与另一探针的杂交3.3 地高辛标记 DNA 介绍随机引物标记的 DNA 带有地高辛-11-dUTP,这一标记承受的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，dNTP 混合物的 5×浓度标记混合物，其中 dNTP 混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP，标记级的Klenow 酶和适合的反响缓冲液。附加设备和所需试剂水浴冰水混合物此表中列出了成分，储存条件和除了试剂盒成格外所需试剂的用途。溶液成分储存条件/稳定性用途水高压灭菌的双蒸水15-25，稳定稀释 DNAEDTA(乙二胺四乙酸)0.2MEDTA,pH8.015-25，稳定终止标记反响模板 DNA：模板 DNA 所需特征：特征具体信息模板 DNA 应当承受 theHighPurePlasmidIsolationKit 进行制备。纯度当承受其他商业化的纯化试剂盒进展纯化时，我们建议额外进展一次苯酚/氯仿抽提以去除剩余的蛋白质。在标记之前假设对模板进展限制酶切或者其他酶的修饰 作用，那么此步骤也是需要进展的。大小为了获得抱负的结果，模板 DNA 应当线性化，且大小应该在 100-10000bp 以上。假设模板 DNA 大于 10kb，那么在标记之前应当承受限制性酶切序列为 4 个核苷酸的限制性酶如 Hae 对模板进展酶解。上面步骤描述原则上 10ng-3g 的模板均可以标记上，然而请认真查看在给定的表中，用于你的杂交试验所需数量的探针。可以依据供给的操作方法放大总体积和成分用 量来获得更大量的标记探针。假设要检测简单基因组中的单拷贝基因，需标记的模板 DNA 用量至少 300ng探针浓度：25ng/mL 杂交液。标记从琼脂糖凝胶上分别的 DNA假设你想要完成基因组的 southern 杂交，你应当利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板 DNA 从载体上分别出来。为了从凝胶中分别 DNA,你可以用琼脂糖凝胶 DNA 提取试剂盒(theAgaroseGelDNAExtractionKit)进展大小在 400bp-5kbp 范围内 DNA 片段的回收。这一试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼 脂糖凝胶。然后，不需要进一步纯化即可对 DNA 片段进展高效的地高辛标记。然后标记好的探针应当用高效的 PCR 产物纯化试剂盒HighPurePCRProductPurificationKit进展纯化，以去除残留的琼脂 糖颗粒。步骤步骤操作1向一个反响管仲中参加 10ng-3g 模板 DNA线性或超螺旋和高压灭菌的双蒸水，终体积达 15l；作为比照，向另一管中参加此步骤用于标记 10ng-3gDNA。可以通过扩大全部成分和体积标记更大量的 DNA最高达 10g。5l 无标记比照 DNAVial2和高压灭菌水，终体积达 15l沸水浴 10 分钟以变性 DNA，然后快速插入冰水混合物中2留意：完全变性对于标记的有效性是格外重要的参加以下试剂到变性探针或比照 DNA 中：试剂Vial5Vial63Vial7体积2L 2L 1L充分混合并简洁离心； 37孵育 1 小时或者过夜留意：较长的孵育时间最高达 20 小时能够提高地高辛标记 DNA 的产量参加 2L0.2MEDTA(pH8.0)和/或 65加热 10 分钟终止反响4留意：承受地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可以 从 200bp 到 1000bp 甚至更长，这主要取决于原始模板 DNA 的长度标记反响的产量表 1：模板 DNA1h20h此表向您展现了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反响中每个试验承受 1gDNA 作为模板。1 小时内，大约有 15%的核苷酸参与到了 0.8g 合成的地高辛标记 DNA 中。20 小时后消耗了大约 38% 的核苷酸。10ng15ng50ng30ng30ng120ng100ng60ng260ng300ng120ng500ng1000ng260ng780ng3000ng530ng890ng使用 DIG-High-Prime 溶液，增加不同模板 DNA 的量进展反响，并检测反响 1 小时和反响 20 小时的差异。地高辛标记 DNA 的产量由放射线示踪器进展测定，并通过斑点杂交进展证明10 个独立标记试验的平均值。3.4 标记效率确实定介绍地高辛标记 DNA 产量确实定对于获得最正确的，具有可重现性的杂交结果格外重要。在杂交混合物中探针浓度过高简洁产生背景，而太低浓 度则简洁导致信号弱。试验原则检测标记探针质量的好方法是直接检测法。步骤12描述将地高辛标记 DNA 的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上；尼龙膜局部区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记 的比照 DNAVial4作为标准。承受 anti-DIG-AP 结合物(Vial8)和随时即用的NBT/BCIP 对尼龙膜进展免疫检测。比较地高辛标记 DNA 与比照 DNA 的一系列稀释点的强度确定标记效率。所需附加溶液的制备请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在 地高辛洗涤和封阻缓冲液无 DNA 酶和 RNA 酶系列产品中获得。溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1M 马来酸0.15MNaCl pH7.5(20)0.3%(v/v)Tween2015-25,稳定去除未结合的抗体马来酸缓冲液0.1M 马来酸0.15MNaCl用 NaOH(固体)调节 pH 值到7.5(20)15-25,稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1MTris-HCl 0.1MNaCl pH9.5(20)15-25,稳定调整 pH 值到 9.5TE 缓冲液10mMTris-HCl1mMEDTA pH8.015-25,稳定终止颜色反响试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：溶液成分/制备方法储存/稳定性用途封阻溶液用马来酸缓冲液依据 1：10 的比例将 10×封阻液10 号瓶按体积比 10%溶解稀释成1×工作溶液始终颖制备封阻膜上非特异结合位点每次使用前将原始管中的anti-digoxigenin-AP(8 号抗体溶液管)10000rpm 离心 5 分钟。然后从外表留神吸取所需用量。用封阻溶液依据 1：5000150mU/mL的比例稀释anti-digoxigenin-AP2-8，12h与地高辛标记的探针结合取 40LNBT/BCIP(9 号管)底物显色液于 2ml 检测缓冲液中混匀即配即用留意：避光保存稀释系列依据合成核苷酸的预期产量开头下面的的系列稀释，标记的探针和 地高辛标记的比照 DNAVial4应当稀释到 1ng/L。利用第 3.3 章中图表可以最好的估量出在你的探针中地高辛标记 DNA 的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。留意：表 1 中给出的产量是承受高纯度的 DNA 模板在最正确条件下生产出的。依据下表中的描述对你标记的探针和你的比照 DNA 进展一系列的梯度稀释。管DNA(L)1来自于管#稀释的原液DNA 稀释缓冲液3 号管 (L)稀释比例终浓度1ng/L2531514952351：1001：3.310pg/L 3pg/L452451：10553451：10654451：10755451：10856451：1090-50-1pg/L 0.3pg/L 0.1pg/L0.03pg/ L0.01pg/ L0操作步骤下面的步骤描述的是直接检测。留意：在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全掩盖膜。步骤操作1 分别从你标记的探针和标记比照 DNA 的 2-9 号管中取出 1L 点在尼龙膜上2 通过紫外交联或者 120烘烤 30 分钟的方法将核酸固定在膜上3 将膜转移到一个装有 20mL 马来酸缓冲液的塑料容器中在 15-25中振荡孵育 2 分钟4 在 10mL 封阻液中孵育 30 分钟5 在 10mL 抗体溶液中孵育 30 分钟6 用 10mL 洗涤缓冲液洗涤两次，每次 15 分钟7 在 10mL 检测缓冲液中平衡 2-5 分钟8 将膜上带有 DNA 的一面朝上，放入盛有 2ml 底物显色液的盒子中，避光，15-25中孵育 5 分钟。留意：不能摇动；可适当翻开盒子观看染色状况9待显色到适合的效果后用 TE 缓冲液洗膜 5min，扫描结果分析比较比照与你的标记反响产生的点的强度差异，并计算出地高辛标 记DNA 的量。假设你的探针稀释后量达 0.1pg 的点与比照 DNA 的点均可见，那么说明标记的探针到达了预期的标记效率，能够满足杂交所需的 探针浓度。3.5 DNA 的转移和固定转移方法和膜凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook 等的文章。胶中不参加 EB 会更好，由于 EB 可能引起背景不均匀的问题。全部一般类型的 DNA 转移方法都适用于后续的地高辛杂交试验；在试验中，在 20×SSC 中承受毛细管转移的方法将 DNA 转移到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。留意：碱性转移如在 0.4MNaOH 中不适用于地高辛标记分子量marker 的转移。固定操作将 DNA 固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：假设你想承受那么将膜放到已经用 10×SSC 浸透的 Whatman3MM 滤纸上。紫外交联的方法洗涤之前用紫外交联这块潮湿的膜尼龙膜紫外交联后，将膜放入双蒸水中简洁冲洗一下，然后自然晾干。在 2×SSC 简洁的洗涤一下膜120，烘烤尼龙膜将尼龙膜放在 120下烘烤 30 分钟或者依据操作说明的要求进展操作。80，烘烤尼龙膜在 2×SSC 简洁的洗涤一下膜将尼龙膜放在 80下真空烘烤 2 小时膜的储存请依据下表选择膜的储存方法。假设那么你想连续试验马上将这个膜进展预杂交假设你想稍后进展试验那么将枯燥的膜储存于 2-83.6 杂交需要的附加设备 DIGEASYHyb冰水浴震荡水浴或杂交炉耐高温的塑料或者玻璃盒，培育皿，滚筒瓶或者可密封的塑料袋留意：不要用敞口的容器盛放杂交缓冲液杂交温度适宜的杂交温度是依据 GC 含量和探针与靶片段的相像百分数计算获得的，具体的公式如下：Tm=49.82+0.41(%G+C)-(600/I)I=能够杂交上的片段的长度，以碱基对 进展计算T =Tm-2025opt.这一给出数字的方程式是依据杂交溶液中含有 50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。用于地高辛杂交液进展杂交的实际杂交温度 T 要比计算出的 Tm 低opt.20-25。T 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有opt.18%的错配。当你的探针与靶序列的相像度低于 80%时，你应当相应的降低T 大约每 1%的错配要降低 1.4，同时相应的调整严谨洗涤步骤opt即提高 SSC 浓度和降低洗涤温度。操作步骤请参照下表进展试验。步骤操作1将适量体积的杂交缓冲液DIGEASYHyb提前预热到杂交温度37-42。在适当的容器中温顺振荡 30 分钟进展预杂交。留意：膜应当自由的移动。尤其是假设你在同一个预杂交溶液 中放入几张膜。2变性地高辛标记的 DNA 探针：在地高辛杂交液中浓度大约为25ng/mL将探针放入沸水浴中煮 5 分钟后快速放入冰水混合物中冷却。留意：由于 DIG-11-dUTP 是碱标记的，因此 DNA 探针不能用碱处理NaOH的方法变性。3将变性的地高辛标记探针参加到预热的地高辛杂交缓冲液每100cm2的膜参加 3.5mL 杂交缓冲液中，充分混合但要避开产生泡沫气泡简洁产生背景4倒出预杂交液，向膜上参加探针杂交液的混合物；温顺振荡孵育 4 小时或延长孵育至过夜杂交液的储存含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15 到-25，可以反复使用几次，在每次使用前需要 68颖变性 10 分钟。留意：不行以将杂交液煮沸。严谨洗涤对于大局部 DNA:DNA 应用,用 0.5×SSC 进展严谨洗涤已经足够。针对每个探针来说，正确的洗涤条件应当依据阅历来确定。对于人基因组 DNA，承受的条件是 0.5×SSC，65。探针长度大于 150bp 且 GC 含量高时，应在 68下进展洗涤。对于长度为 100bp 或更短的探针，洗涤温度应当降低。此表描述了怎样完成后面的杂交洗涤。步骤12操作用足够的 2×SSC，0.1%SDS 连续振荡洗涤两次，每次 5 分钟。在 65-68，用足够的 0.5×SSC，0.1%SDS提前预热到洗涤温度连续振荡洗涤两次，每次 15 分钟。3.7 免疫检测 需要附加的试剂请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高 辛洗涤和封阻缓冲液无 DNA 酶和 RNA 酶系列产品中获得。溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1M 马来酸0.15MNaCl pH7.5(20)0.3%(v/v)Tween2015-25,稳定去除未结合的抗体马来酸缓冲液0.1M 马来酸0.15MNaCl用 NaOH(固体)调节 pH 值到7.5(20)15-25,稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1MTris-HCl 0.1MNaCl pH9.5(20)15-25,稳定调整 pH 值到 9.5TE 缓冲液10mMTris-HCl1mMEDTA pH8.015-25,稳定终止颜色反响试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：溶液成分/制备方法储存/稳定性用途封阻溶液用马来酸缓冲液依据1：10 的比例将 10× 封阻液10 号瓶按体积比 10%溶解稀释成1×工作溶液始终颖制备封阻膜上非特异结合位点抗体溶液每次使用前将原始管中的 anti- digoxigenin-AP(8 号管)10000rpm 离心 5 分钟。然后从外表留神吸取所需用量。用封阻溶液依据 1：5000150mU/mL的比例稀释 anti- digoxigenin-AP的探针结合取 40LNBT/BCIP(9号管)底物显色液于 2ml 检测缓冲液中混匀即配即用留意：避光保存操作步骤2-8，12h与地高辛标记此表描述了完成一张 100cm2膜的免疫检测方法。步骤操作1杂交和严谨洗涤后，将膜简洁的用洗涤缓冲液冲洗 1-5 分钟2在 100mL 封阻液中孵育 30 分钟3在 20mL 抗体溶液中孵育 30 分钟4用 100mL 洗涤缓冲液洗涤两次，每次 15 分钟5在 20mL 检测缓冲液中平衡 2-5 分钟6将膜上带有 DNA 的一面朝上，放入盛有 10ml 底物显色液的盒子中，避光，15-25中孵育 5 分钟留意：不能摇动；颜色可在数分钟内显现，持续 16h；可适留意：全部的孵育均是在 15-25下，振荡完成的。假设膜还需要再次与探针杂交，那么任何时候都不要让膜干。当翻开盒子观看染色状况7待显色到适合的效果后用 50mlTE 缓冲液洗膜 5min，扫描3.8 DNA 印记的洗脱和再次探针杂交主要信息印记中的碱性标记形式的 DIG-11-dUTP 能够更简洁更有效的被洗脱，以用于再一次的杂交试验。所需附加的仪器和试剂DMF2×SSC0.2NNaOH,0.1%SDS操作步骤此操作描述的是膜的洗脱。步骤操作用大烧杯水浴加热 DMF 到 50-601将膜放入其中直到蓝色颗粒从膜上脱落双蒸水充分洗涤2在 37条件下，用含有 0.1%SDS 的 0.2MNaOH 洗涤两次，每次 20分钟，以去除地高辛标记的探针3用 2×SSC 充分洗涤 5 分钟4空气中枯燥或用另一个探针进展预杂交和杂交留意：假设打算印记需要洗脱和再次杂交，那么膜在任何时候都不能 干。洗脱后的膜需要的储存条件一旦膜被洗脱，可以将膜放在马来酸缓冲液中或者 2×SSC 中预备再用。5 附录20×SSC成分及终浓度300mmol/L 柠檬酸三钠二水3mol/L 氯化钠水配制 1L 溶液各成分的用量88.2g175.3g补足 1L溶解柠檬酸三钠二水和氯化钠于约 0.9L 水中，调 pH 为 7.0，用水补足体积至 1L。