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细菌内毒素检查细菌内毒素检查王文洁王文洁一、试剂及仪器一、试剂及仪器注射用头孢他啶注射用头孢他啶鲎试剂（鲎试剂（标示灵敏度），细菌标示灵敏度），细菌内毒素标准品，细菌内毒素检查内毒素标准品，细菌内毒素检查用水（用水（BET水），仪器（严格消毒）水），仪器（严格消毒）质量标准：质量标准：中国药典中国药典（2005年版）第二部年版）第二部 p135细菌内毒素检查法：附录细菌内毒素检查法：附录二、实训内容二、实训内容1.1.细菌内毒素标准溶液的制备细菌内毒素标准溶液的制备 15015015151.01.0 0.50.5 0.250.25 0.1250.1250.21.8BET0.22.8BET0.90.9BET0.90.9BET0.90.9BET2 0.5 0.25供试品的最大有效稀释倍数（供试品的最大有效稀释倍数（MVD）MVDCLC -为供试品的浓度为供试品的浓度（当当L以以EU/ml表示时，表示时，C取取1.0ml/ml）L -为供试品的细菌内毒素限值，为供试品的细菌内毒素限值，EUml -鲎试剂的标示灵敏度（鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）2 2.供试品溶液的制备供试品溶液的制备 PC阳性对照阳性对照2内毒素溶液内毒素溶液PPC供试品阳性对照供试品阳性对照含含2内毒素溶液的供试品内毒素溶液的供试品NC阴性对照阴性对照BET水水3 3.对照对照 4.4.检查检查 SPCPPCNC 各两支各两支将将安瓿瓶安瓿瓶中溶液轻轻中溶液轻轻混匀后，封口混匀后，封口膜封口膜封口，垂直，垂直放入放入371水浴中，保温水浴中，保温602分钟分钟。细菌内毒素细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白）和微量蛋白（Protein）的复合物其化学成份主要是由）的复合物其化学成份主要是由O-特特异性链、核心多糖、类脂异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。三部分组成。美国药典美国药典近近800种种药物要用细菌内毒素检查药物要用细菌内毒素检查法来做为质量控制手段。法来做为质量控制手段。我国药典至我国药典至2005年版正式收载了需年版正式收载了需“细菌内细菌内毒素检查法毒素检查法”品种达品种达234种。种。细菌内毒素检查细菌内毒素检查鲎试剂法鲎试剂法2005版中国药典版中国药典二二部收载的部收载的细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法部分部分品种表品种表药品名称药品名称 限限 值值页页 码码甘露醇注射液甘露醇注射液2.5 EU/g72右旋糖酐右旋糖酐70氯化钠注氯化钠注射液射液 0.5 EU/ml 91甲硝唑注射液甲硝唑注射液 0.35 EU/mg124注射用头孢他啶注射用头孢他啶0.1 EU/mg 135注射用苄星青霉素注射用苄星青霉素 0.25 EU/1000单位单位 228谷氨酸钾注射液谷氨酸钾注射液0.012 EU/mg269维生素维生素C注射液注射液2.5 EU/ml671 2005版中国药典版中国药典三三部收载的部收载的细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法部分部分品种表品种表药品名称药品名称 限限 值值页页 码码乙型脑炎灭活疫苗乙型脑炎灭活疫苗100EU/微克微克34人用狂犬病疫苗（地鼠人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）肾细胞）100EU/每每1次人次人用剂量用剂量95 重组乙型肝炎疫苗（酵重组乙型肝炎疫苗（酵母）母）成品成品 10EU/ml115注射用重组人干扰素注射用重组人干扰素成品成品 10EU/每每1次人用次人用剂量剂量 225注射用重组人白介素注射用重组人白介素-2成品成品10EU/每每1次人用次人用剂量剂量227 v鲎试剂法优点鲎试剂法优点 快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品一次可同时测几个样品。v鲎试剂法局限性鲎试剂法局限性对革兰阴性杆菌以外的内毒素不够灵敏对革兰阴性杆菌以外的内毒素不够灵敏。（鲎变形细胞溶解物）（鲎变形细胞溶解物）凝固酶凝固酶内毒素、内毒素、Ca2+原理原理活化的活化的B因子因子 LAL中的中的B因子因子凝固酶原凝固酶原凝固原凝固原(可凝性蛋白可凝性蛋白)凝固蛋白（凝固素凝固蛋白（凝固素)凝胶凝胶细菌内毒素细菌内毒素检查检查可使用其中任何一种方法可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除有专进行试验。当测定结果有争议时，除有专门说明外，以门说明外，以凝胶法凝胶法结果为准。结果为准。细菌内毒素检查有两种方法：细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法凝胶法光度测定法光度测定法:包括包括浊度法浊度法和和显色基质法显色基质法概述1.1.抗生素抗生素（antibiotics）在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称2.2.分类分类 内酰胺类内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类青霉素类、头孢菌素类)氨基糖苷类氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、依替米星链霉素、庆大霉素、依替米星)四环素类四环素类(四环素、金霉素、土霉素四环素、金霉素、土霉素)大环内酯类大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素)多烯大环类多烯大环类(制霉菌素、两性霉素制霉菌素、两性霉素B)多肽类多肽类(多黏菌素、放线菌素多黏菌素、放线菌素)3.3.来源来源 生物合成（发酵）生物合成（发酵）化学合成或半合成化学合成或半合成4.4.特点特点 化学纯度较低化学纯度较低 活性组分易发生变异活性组分易发生变异 稳定性差稳定性差5.5.抗生素质量分析抗生素质量分析生物学法、物理化学法生物学法、物理化学法 鉴别：理化方法、微生物法理化方法、微生物法 检查：水分、水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等降压物质等 含量含量/效价测定：效价测定：微生物法微生物法 ：与临床疗效吻合与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大适用范围广；但操作复杂费时，误差大 理化方法：理化方法：准确度与专属性较高准确度与专属性较高,且操作简便；但与且操作简便；但与临床疗效有偏差临床疗效有偏差内酰胺类氨苄西林氨苄西林阿莫西林阿莫西林青霉素（苄青霉素）青霉素（苄青霉素）青霉素（苄青霉素）青霉素（苄青霉素）（penicillins）头孢氨苄头孢氨苄头孢拉定头孢拉定头孢羟氨苄头孢羟氨苄头孢噻吩钠头孢噻吩钠7-aminocephalosporanic acid,简称简称7-ACA头孢菌素类头孢菌素类6-aminopenicillanic acid,简称简称6-APA青霉素类青霉素类氢化噻唑环氢化噻唑环氢化噻嗪环氢化噻嗪环 母核：母核：母核：母核：6 6氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸母核：母核：母核：母核：7 7氨基头孢菌烷酸氨基头孢菌烷酸氨基头孢菌烷酸氨基头孢菌烷酸结构与性质结构与性质1.1.酸性（羧基）酸性（羧基）pKa 2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。溶性好，有机碱盐难溶于水。2.2.手性手性C （旋光性）（旋光性）3.3.UV青霉素类：苯环取代基青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构头孢菌素类：母核有共轭结构260nm4.4.内酰胺环内酰胺环(四元环张力四元环张力+酰胺键酰胺键)干燥条件较稳定，溶液不稳定干燥条件较稳定，溶液不稳定某些氧化剂、金属离子、温度某些氧化剂、金属离子、温度Identification(一一)色谱法色谱法HPLC(tR)TLC(Rf)(二二)光谱法光谱法IR UV(三三)呈色反应呈色反应1 1）羟肟酸铁反应）羟肟酸铁反应内酰胺环内酰胺环内酰内酰胺类胺类NH2OHHClNaOH羟肟酸羟肟酸 Fe3+H+显色显色2 2）茚三酮反应）茚三酮反应-氨基氨基 茚三酮茚三酮 蓝紫色蓝紫色(红、棕、褐红、棕、褐)3 3）双缩脲反应）双缩脲反应内酰胺类内酰胺类 碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜紫色紫色4 4）变色酸）变色酸-硫酸反应硫酸反应5 5）重氮苯磺酸反应）重氮苯磺酸反应酚羟基酚羟基（偶合）（偶合）6 6）铜盐反应）铜盐反应头孢氨苄的专属反应头孢氨苄的专属反应7 7）硫酸）硫酸-甲醛反应甲醛反应(BP)青霉素钾和青霉素钠呈红棕色青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四四)焰色反应焰色反应K+、Na+Purity Test(聚合物、有关物质、异构体等聚合物、有关物质、异构体等)头孢他啶中聚合物测定头孢他啶中聚合物测定 萄聚糖凝胶萄聚糖凝胶立体网状结构图立体网状结构图原理原理“分子筛分子筛”氨基糖苷类氨基糖苷类 氨基环醇氨基环醇+氨基糖氨基糖苷苷链霉素链霉素(Streptomycin)巴龙霉素巴龙霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脱氧链霉胺葡萄糖胺脱氧链霉胺巴龙胺巴龙胺D核糖巴龙霉糖核糖巴龙霉糖巴龙二糖胺巴龙二糖胺庆大霉素庆大霉素(gentamycin)绛红糖胺绛红糖胺(紫素胺紫素胺)2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺(N-甲基甲基-3-去氧去氧-4-甲基戊糖胺甲基戊糖胺)Identification坂口反应坂口反应麦芽酚反应麦芽酚反应N-甲基葡萄甲基葡萄糖胺反应糖胺反应N-甲基葡萄糖胺反应（甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）反应）乙酰丙酮乙酰丙酮OH-吡咯衍生物吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛H+红色红色乙酰丙酮乙酰丙酮OH-对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛H+麦芽酚反应麦芽酚反应链霉糖特有反应链霉糖特有反应H+坂口反应坂口反应链霉胍特有反应链霉胍特有反应链霉素链霉素OH-水解水解8-羟基喹啉羟基喹啉 NaOBr或-萘酚萘酚 链霉胍链霉胍橙红色橙红色四环素类四环素类ABCD123456789101112结构与性质1 1）两性：）两性：-OH酸性酸性 N(CH3)2碱性碱性 Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；生成不溶性盐；Fe3+形成红色配合物；形成红色配合物；Al3+形成黄色配合物形成黄色配合物；pH3 7.5 多价阳离子与酚二酮多价阳离子与酚二酮荧光荧光 与酸、碱均可成盐；与酸、碱均可成盐；临床多用盐酸盐；临床多用盐酸盐；强酸或强碱中溶解度强酸或强碱中溶解度 2 2）旋光性）旋光性3 3）UV和荧光和荧光 4 4）与金属离子络合）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基酚羟基、烯醇基)弱酸性（弱酸性（pH2-6）A环环C-4异构化异构化 差向四环素差向四环素酸性（酸性（pH 2）C环脱水环脱水 脱水四环素脱水四环素 碱性碱性 C环开环，形成内酯环开环，形成内酯 异四环素异四环素5）不稳定性A.A.差向异构化差向异构化蓝色荧光淡黄黑AApH2.06.0（氢键氢键，土霉素、，土霉素、多西环素不易差向多西环素不易差向异构化）异构化）B.B.酸性脱水降解酸性脱水降解max=445nmmax=435nmDDDCBBCBCC.C.碱性脱水降解碱性脱水降解OH-技能：技能：掌握采用鲎试剂法掌握采用鲎试剂法凝胶法进行细菌内毒素凝胶法进行细菌内毒素检查操作方法检查操作方法掌握根据观察阳、阴性结果判断细菌内毒素掌握根据观察阳、阴性结果判断细菌内毒素检查是否合格的方法检查是否合格的方法相关理论：相关理论：掌握鲎试剂法检查细菌内毒素的原理掌握鲎试剂法检查细菌内毒素的原理掌握细菌内毒素检查的意义掌握细菌内毒素检查的意义熟悉抗生素类药物主要类别及性质熟悉抗生素类药物主要类别及性质