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动物科技学院硕士研究生毕业论文答辩动物科技学院硕士研究生毕业论文答辩布鲁氏菌布鲁氏菌019株弱化与基因缺失株构株弱化与基因缺失株构建及初步免疫评价建及初步免疫评价姓姓 名名：指导老师指导老师：研究背景研究背景研究目的研究目的试验研究试验研究全文结论全文结论1 12 23 34 4汇报内容汇报内容论文创新论文创新5 5文章发表文章发表6 6一、研究背景一、研究背景 布鲁氏菌病布鲁氏菌病 (Brucellosis)(Brucellosis)是一种人畜共患传染是一种人畜共患传染病，在全世界范围内广泛分布，在我国也有大量的动病，在全世界范围内广泛分布，在我国也有大量的动物发生感染，新疆是我国的高发地区。物发生感染，新疆是我国的高发地区。动物感染布鲁氏菌后主要表现为波浪热，关节肿动物感染布鲁氏菌后主要表现为波浪热，关节肿大及生殖系统的疾病。大及生殖系统的疾病。目前布鲁氏菌病的预防控制主要通过疫苗接种，目前布鲁氏菌病的预防控制主要通过疫苗接种，我国主要采用弱毒活疫苗有我国主要采用弱毒活疫苗有M5-90M5-90、S2S2等。等。疫苗株的缺陷：疫苗株的缺陷：毒力仍然较强；存在返强的潜在毒力仍然较强；存在返强的潜在威胁；不能有效区分疫苗免疫和自然感染。威胁；不能有效区分疫苗免疫和自然感染。一、研究背景一、研究背景 pgm基因编码的磷酸葡萄糖变位酶，参与布鲁氏基因编码的磷酸葡萄糖变位酶，参与布鲁氏菌脂多糖菌脂多糖O链装配过程，该基因的缺失会影响光滑型链装配过程，该基因的缺失会影响光滑型布鲁氏菌布鲁氏菌LPS的的合成。合成。由于由于LPS是介导宿主先天性免疫反应的重要抗原，是介导宿主先天性免疫反应的重要抗原，pgm基因是布鲁氏菌重要的毒力基因。基因是布鲁氏菌重要的毒力基因。一、研究背景一、研究背景 目前，国内外已有布鲁氏菌目前，国内外已有布鲁氏菌pgmpgm基因突变或缺失的基因突变或缺失的报道：报道：Juan Juan等将布鲁氏菌等将布鲁氏菌S19S19进行了进行了pgmpgm基因敲除，获得了基因敲除，获得了布鲁氏菌布鲁氏菌pgmpgm基因基因缺失株，动物试验结果表明：缺失株，动物试验结果表明：pgmpgm基基因因缺失株不能合成缺失株不能合成LPSLPS，同时也检测不到，同时也检测不到O O链抗体，和链抗体，和亲本株亲本株S19S19有有相似的免疫保护性。相似的免疫保护性。一、研究背景一、研究背景 布鲁氏菌布鲁氏菌019019株是株是19801980年年在在新疆紫泥泉种羊场被新疆紫泥泉种羊场被发发现并分离；较其他野毒株，毒力较弱，但依然可诱发现并分离；较其他野毒株，毒力较弱，但依然可诱发动物的病理损伤，主要引起公羊的附睾炎等症状。动物的病理损伤，主要引起公羊的附睾炎等症状。布鲁氏菌布鲁氏菌氢氧化铝佐剂灭活苗氢氧化铝佐剂灭活苗接种接种羊羊群后，群后，保护保护率可达率可达75%。一、研究背景一、研究背景 通过物理和化学的方法对布鲁氏菌通过物理和化学的方法对布鲁氏菌019019株进行诱株进行诱导突变，分析生长状况及毒力的变化。导突变，分析生长状况及毒力的变化。针对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因（针对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因（pgmpgm）定向构建布鲁氏菌定向构建布鲁氏菌019019的的pgmpgm基因基因缺失株，并对其毒力缺失株，并对其毒力及免疫效果进行评价；探讨布鲁氏菌及免疫效果进行评价；探讨布鲁氏菌019019株致弱后作株致弱后作为疫苗株的潜力为疫苗株的潜力。二、研究目的二、研究目的三、实验研究三、实验研究实验一实验一布鲁氏菌布鲁氏菌019株弱化与毒力评价株弱化与毒力评价实验实验二二布鲁氏菌布鲁氏菌019pgm基因缺失株构建基因缺失株构建实验实验三三布鲁氏菌布鲁氏菌019pgm毒力及初步免疫毒力及初步免疫评价评价实验一实验一 布鲁氏菌布鲁氏菌019019株弱化与毒力评价株弱化与毒力评价0.1%0.1%、0.05%0.05%吖啶橙吖啶橙实验方案实验方案连续转接连续转接50次次0.1%0.1%、0.05%0.05%苯酚苯酚紫外线照射紫外线照射5min5min、2min2min生长曲线生长曲线小鼠脾脏指数小鼠脾脏指数脾脏脾脏CFUCFU计数计数评价毒力变化评价毒力变化布鲁氏菌布鲁氏菌019019株株自身生长能力自身生长能力疫苗应用前景评价疫苗应用前景评价结果与分析结果与分析1、生长曲线的绘制、生长曲线的绘制结果显示：结果显示：25h后进入对数生长期，细菌随时间变化快速增长，后进入对数生长期，细菌随时间变化快速增长，61h后菌数趋于稳定。后菌数趋于稳定。2、代时比较、代时比较组别组别019紫线照射紫线照射(2 min)紫线照紫线照(5 min)AO(0.1g/L)AO(0.05g/L)PhOH(0.1g/L)PhOH(0.05g/L)代时代时（h）0.861.5451.621.89 1.691.03 1.01结果显示：各处理组细菌代时与亲本结果显示：各处理组细菌代时与亲本019株相比较均有不同程度株相比较均有不同程度的增加。的增加。结果与分析结果与分析3、小鼠脾脏指数变化、小鼠脾脏指数变化菌株菌株脾脏指数脾脏指数01910.431.12a紫外线照射（紫外线照射（2min）8.811.28b紫外线照射紫外线照射(5min)8.381.30bAO（0.1g/L）9.741.08aAO（0.05g/L）10.131.47aPhOH（0.1g/L）8.720.43bPhOH（0.05g/L）9.621.74abM5-908.240.93bcPBS5.560.34c结果显示：结果显示：1 108菌菌/只腹腔接种小鼠后，苯酚处理组和紫外照射处理只腹腔接种小鼠后，苯酚处理组和紫外照射处理组小鼠脾指数明显低于亲本株组小鼠脾指数明显低于亲本株019株（株（P0.05）。）。结果与分析结果与分析组别组别LogCFU0198.570.35a紫外线照射（紫外线照射（2min）8.510.87a紫外线照射紫外线照射(5min)7.920.43bAO（0.1g/L）7.960.56bAO（0.05g/L）8.360.31aPhOH（0.1g/L）8.300.52abPhOH（0.05g/L）8.360.32aM5-906.790.25c4、小鼠脾脏细菌计数、小鼠脾脏细菌计数结果显示：结果显示：各处理组布鲁氏菌在小鼠脾脏内的细菌均有不同程度的减少，各处理组布鲁氏菌在小鼠脾脏内的细菌均有不同程度的减少，但均显著高于疫苗株但均显著高于疫苗株M5-90组。经组。经0.1g/L吖啶橙处理和吖啶橙处理和5min紫外线紫外线处理组处理组小小鼠脾脏鼠脾脏CFU与亲本株与亲本株019相比明显减少，差异显著（相比明显减少，差异显著（P0.05），但显著），但显著性高于布鲁氏菌性高于布鲁氏菌M5-90和和S2组（组（P0.05），显著性），显著性高于布鲁氏菌高于布鲁氏菌M5-90和和S2组（组（P0.05），随之时间的延长，抗体水平呈现先增加后平），随之时间的延长，抗体水平呈现先增加后平稳趋势，稳趋势，但是，均但是，均显著性低于疫苗株显著性低于疫苗株M5-90（P0.05P0.05），但均低于疫苗株），但均低于疫苗株M5-90M5-90（P0.05P0.05）；在第）；在第3030天，天，019019pgmpgm活全菌佐剂制剂诱导产生的活全菌佐剂制剂诱导产生的IFN-IFN-含量最低，显著低于其他实验含量最低，显著低于其他实验组。组。讨论讨论1 1、感染小鼠后毒力评价感染小鼠后毒力评价019pgm相较与亲本相较与亲本019株感染株感染小鼠实验结果显示，小鼠实验结果显示，019pgm毒力没有发生明显下降，毒力没有发生明显下降，可能是由于可能是由于pgm基因基因并非布鲁氏菌的主效毒力因子，或该基因在布鲁氏菌内并非布鲁氏菌的主效毒力因子，或该基因在布鲁氏菌内还有其他功能相近的基因共同发挥作用。还有其他功能相近的基因共同发挥作用。讨论讨论2 2、体液免疫水平分析、体液免疫水平分析 019pgm组与亲本株组与亲本株019组小鼠在组小鼠在感染初期第感染初期第10天天即可产生较高水平的即可产生较高水平的IgG，并在第，并在第20天后达到最高水平。天后达到最高水平。同时本研究中使用的完全弗氏佐剂，可以使抗原在体同时本研究中使用的完全弗氏佐剂，可以使抗原在体内缓慢释放，延长与免疫细胞作用时间，并内缓慢释放，延长与免疫细胞作用时间，并可有效可有效诱导机诱导机体产生高滴度的抗体。体产生高滴度的抗体。讨论讨论3 3、细胞免疫水平分析、细胞免疫水平分析 IFN-是强有力的巨噬细胞活化因子，对于杀死胞内是强有力的巨噬细胞活化因子，对于杀死胞内的布鲁氏菌发挥巨大的作用。的布鲁氏菌发挥巨大的作用。细胞因子细胞因子IFN-检测结果表明，检测结果表明，M5-90在诱导机体产生在诱导机体产生IFN-的能力强于的能力强于019pgm和和019全菌佐剂制剂，说明灭全菌佐剂制剂，说明灭活疫苗在诱导细胞免疫方面仍然存在不足。活疫苗在诱导细胞免疫方面仍然存在不足。讨论讨论1.经紫外照射经紫外照射5min处理可有效降低布鲁氏菌处理可有效降低布鲁氏菌019毒力。毒力。2.构建并筛选了构建并筛选了019pgm缺失株，缺失株，10代内未发生回复突代内未发生回复突变；其毒力与亲本株无明显差异。变；其毒力与亲本株无明显差异。3.制备布鲁氏菌制备布鲁氏菌019pgm灭活全菌佐剂制剂，初步免疫灭活全菌佐剂制剂，初步免疫评价结果显示：其可诱导产生一定水平的体液免疫和细胞评价结果显示：其可诱导产生一定水平的体液免疫和细胞免疫水平，但均低于免疫水平，但均低于M5-90弱毒苗。弱毒苗。四四.全文结论全文结论本实验构建了布鲁氏菌本实验构建了布鲁氏菌019株株pgm基因缺失株，并检测了其基因缺失株，并检测了其毒力；并对其免疫效果进行了初步评价。毒力；并对其免疫效果进行了初步评价。五五.论文创新论文创新六六.文章发表文章发表文章发表文章发表六六.文章发表情况文章发表情况李亚李亚,陈创夫,张辉,等.流产布鲁氏菌2308株磷酸甘露糖变位酶pmm基因缺失株构建及鉴定.西北农业学报.刊用.致谢致谢值此此毕业之之际，向尊敬的，向尊敬的陈创夫教授致敬，感夫教授致敬，感谢尊尊师3 3年来年来对我我的培养。的培养。感感谢张辉老老师、郭、郭飞老老师、王、王远志老志老师对课题研究的指研究的指导。感感谢王震博士、李天森博士、李志王震博士、李天森博士、李志强博士、博士、张俊波俊波博士及博士及人人畜共患病畜共患病实验室全体同学室全体同学给我的帮助。我的帮助。感感谢动物科技学院物科技学院对我的培养。感我的培养。感谢我的父母、家人和朋友，我的父母、家人和朋友，谢谢他他们无私的支持和帮助！无私的支持和帮助！谢谢各位评委老师谢谢各位评委老师
