基础医学核酸疫苗及免疫研究进展 PPT课件.ppt

Diagram4 4核酸疫苗定义核酸疫苗定义1 12 23 35 5核酸疫苗的发展史核酸疫苗的发展史核酸疫苗的作用原理核酸疫苗的作用原理核酸疫苗的构建核酸疫苗的构建核酸疫苗的优缺点和应用现状核酸疫苗的优缺点和应用现状 疫苗疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。人们将多种灭活或减毒疫苗称为人们将多种灭活或减毒疫苗称为第一代疫苗第一代疫苗。将用基因工程的方法研制的亚单位疫苗称为将用基因工程的方法研制的亚单位疫苗称为第二第二代疫苗代疫苗。理想疫苗应具备的特征有：安全、廉价、热稳定理想疫苗应具备的特征有：安全、廉价、热稳定性好，含有多种具有保护作用的免疫原，最好是一次口服性好，含有多种具有保护作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前前两代均不能满足上述标准。故基因疫苗即可生效。目前前两代均不能满足上述标准。故基因疫苗应运而生。应运而生。基因疫苗被称为第三代疫苗。n n1990年wolff等从事于基因治疗工作时，用外源性重组质粒给小鼠肌肉注射后，质粒被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达所编码蛋白。n n1991年Williams等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答。n n1992年Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体，从而提出了基因免疫的概念。n n1993年Ulmer等将注射技术用于研究流感核酸疫苗，证实核酸注射不但能在体内表达抗原蛋白，还可以诱导具有显著保护作用的免疫应答。n n因此，1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。关于核酸免疫的国际会议n n1994年5月17-18日，瑞士日内瓦。WHO主办。主题：核酸疫苗。n n1995年2月16-17日，美国马里兰州，Bethesda（NIH）。主题：基因疫苗和核酸疫苗战略。n n1995年4月6-9日，美国弗吉尼亚州。主题：DNA疫苗：疫苗学的新时代。n n1996年2月5-8日，美国马里兰州NIH Natcher会议中心。主题：核酸疫苗预防传染性疾病和控制核酸疫苗。定义 核酸疫苗(nucleic acid vaccine),也称基因疫苗(genetic vaccine),是指一类将抗原基因重组到表达载体上的重组质粒疫苗，经肌肉注射或黏膜免疫等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。基因疫苗的构建基因疫苗构建的基本途径基因疫苗的构建一、构建基因疫苗的载体载体是将抗原基因导入到机体细胞的必要工具。1.载体的分类按照载体功能可分为克隆载体和表达载体；按照载体来源可分为质粒、噬菌体、黏粒和病毒载体等。2.常用于构建基因疫苗的载体pcDNA3.1、pcDNA3.1-E、pcDNA3.1/Zeo（+/-）、pcDNA4、pcDNA4/HisMAX、pBudCE4、pRc/RSV、pRc/CMV2等多种 基因疫苗的构建二、基因疫苗的构建方法1.抗原基因和载体的制备 获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。（4）化学合成基因疫苗的构建基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标记基因标记基因 为了保证抗原基因的定向正确插入，只有以正确的方向插入表达载体读框启动子下游才能表达抗原基因，故抗原基因两端应具有不同的酶切位点，在设计时须注意这点。2.抗原基因与载体的连接 连接的方式可分为粘性末端连接和平末端连接两种，其中前者连接效率较高，使用比较多。连接反应时应考虑反应体积、抗原基因与载体的比例、温度和时间和酶量。粘性末端连接用同一种或两种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点平末端连接 质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒产生粘性末端的内切酶核酸酶S1本法适用于在质粒和目的基因上没有没有相同相同的酶切位点！基因疫苗的构建3.重组质粒转化受体菌 转化：将质粒或者以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染：将质粒或者以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。感受态：细菌经过CaCl2溶液处理和短暂热激后，容易摄入外源DNA，这种状态称为感受态。其原理是细菌处于0、低渗CaCl2溶液中时，细胞壁和细胞膜通透性增加。此时转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经短暂的热激（42 ）处理后，外源基因容易进入细菌细胞内。常用的方法为氯化钙共沉淀法和电穿孔法。基因疫苗的构建4.重组质粒的筛选与鉴定 一般重组质粒鉴定主要按照表型筛选、酶切鉴定和测序鉴定的顺序进行（1）插入片段鉴定：酶切鉴定；PCR鉴定。（2）插入片段方向性鉴定：可利用联合酶切方案进行目的基因的插入方向鉴定。（3）DNA序列测定：末端终止法测序；自动测序仪测序基因疫苗的构建三、重组质粒在真核细胞中的表达与检测1.重组质粒导入真核细胞的方法 磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体介导等方法都可以用来将外源质粒导入真核细胞，其中脂质体介导容易成功，是最常用的方法。2.抗原基因在真核细胞中表达的检测（1）蛋白水平的检测：免疫沉淀法检测表达蛋白；Western印迹检测；酶联免疫吸附测定。（2）核酸水平的检测：RNA印迹；RT-PCR检测。由于这个过程实际上是相当复杂的，所以人们对一些具体的细节并不清楚。下面通过对基因疫苗经过肌肉组织和黏膜免疫的抗原呈递途径来说明基因疫苗的工作原理。基因疫苗经黏膜和皮肤组织免疫的抗原呈递 皮肤或者黏膜是具有高水平免疫监视系统的组织，黏膜淋巴组织的功能：参与粘膜局部免疫应答和产生分泌型IgA。而且在免疫动物时比较方便，尤其是大面积预防时，所以关于基因疫苗通过皮肤或黏膜免疫激活机体免疫反应机制的研究也比较活跃。基因疫苗经过黏膜和皮肤组织免疫可以分为直接免疫机体和重组减毒胞内菌系统免疫两种形式。（1）直接免疫 旅美中国科学家范泓然用皮肤涂抹法给小鼠接种乙肝疫苗取得成功，且检测其效果可以和所用的肌肉注射相媲美。黏膜淋巴结提供了浆细胞抗体型转化与Th0细胞向Th2细胞定向分化的微环境。基因疫苗经过黏膜免疫可以很好地激活B细胞分泌IgA，同时启动Th2细胞功能，但其对细胞免疫（尤其是CTL细胞）活化不足，通过黏膜免疫获得的保护作用不如通过肌肉免疫获得的强烈。（2）用重组减毒胞内菌系统 采用志贺氏菌、沙门氏菌或李斯特菌等重组减毒胞内菌系统，通过粘膜自然感染途径运送 DNA 疫苗是一类很好的方法。因为它们可以将基因疫苗直接呈送给 APCs，所以这种方法运送效率高、免疫方法简单、免疫效果好，能同时激活粘膜免疫和全身免疫，并可获得对载体菌的免疫等优点。减毒沙门氏菌通过自然感染的方式高效地将基因疫苗直接运送给体内的抗原提呈细胞（APCs）如树突细胞（DCs）和巨噬细胞，在粘膜和全身淋巴组织诱发以 Th1 型应答为主的细胞免疫和体液免疫，APCs尤其是 DCs可能在其中起到了关键作用。携带基因疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答携带基因疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答的机制的机制 重组减毒沙门氏菌携带的基因疫苗激发机重组减毒沙门氏菌携带的基因疫苗激发机体的细胞免疫和体液免疫的机制还不完全体的细胞免疫和体液免疫的机制还不完全清楚清楚。可能途径一：DCs 和巨噬细胞吞噬侵入肠粘膜屏障的重组沙门氏菌并被激活，活化的 DCs 和巨噬细胞迁移到脾脏等淋巴组织（DCs 具有很强的迁移能力，而巨噬细胞尚有一些疑问），载体菌在此裂解，基因疫苗进入胞液，然后进入细胞核，最后表达目的抗原。接着激活特异的 CTL，裂解表达抗原的 APCs，APCs 内的抗原被释放激活辅助 T 细胞和诱导抗体反应，激活细胞免疫和体液免疫。可能途径二：重组沙门氏菌引起吞噬它的 APCs 凋亡，凋亡产物（含有目的抗原/基因疫苗）被邻近的 APCs 吞噬。核酸疫苗的优缺点核酸疫苗的优缺点优点：优点：1 1 免疫保护力增强免疫保护力增强 2 2 制备简单，省时省力制备简单，省时省力 3 3 同种异株交叉保护同种异株交叉保护 4 4 应用较安全应用较安全 5 5 产生持久免疫应答产生持久免疫应答 6 6 贮存、运输方便贮存、运输方便 7 7 可用于防治肿瘤可用于防治肿瘤缺点：缺点：1 1 质粒质粒DNADNA可能诱导自身免疫反应可能诱导自身免疫反应 2 2 持续表达外源抗原可能产生一些不良后持续表达外源抗原可能产生一些不良后果果 3 3 肌肉注射质粒后，仅有很少部分被肌细肌肉注射质粒后，仅有很少部分被肌细胞所摄取胞所摄取 4 4 影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的因素影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的因素很多很多 外源外源DNADNA注入体内后，可能整合到宿主注入体内后，可能整合到宿主基因组上，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因基因组上，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主细胞转化成癌细胞活化，使宿主细胞转化成癌细胞 核酸疫苗的应用现状核酸疫苗的应用现状n n有关质粒DNA疫苗在人类及动物产生预防和治疗作用的研究报道不断增加，应用范围也逐渐扩大。人们期望用核酸疫苗来征服诸如微生物感染性疾病、寄生虫病等顽症，并用于肿瘤、遗传病和其他多种疾病的基因水平治疗，所以作了多方面的尝试。n n病毒感染性疾病的核酸疫苗病毒感染性疾病的核酸疫苗n n非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗n n寄生虫核酸疫苗寄生虫核酸疫苗n n肿瘤核酸疫苗肿瘤核酸疫苗发展前景 核酸疫苗的研究只是近十几年发展起来的一项新的生物技术，它已成为疫苗研究领域中的热点之一，特别是其研究方向与世界卫生组织儿童疫苗计划的长远目标（用一种疫苗预防多种疾病）相吻合。现在已获得了迅速的发展。它的研究具有深远意义，可用于细菌、病毒、寄生虫等多种疾病的防治，其多价、高效、廉价等优点使其潜在的应用价值不可估量。核酸疫苗可能对人类疾病的防治以及畜牧业的健康发展起到划时代的作用。核酸疫苗研究进展 一、概一、概 述述 核酸疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗又称基因疫苗或DNADNA疫苗，疫苗，就是把外源基因克隆到真核质粒表达就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒基因直接载体上，然后将重组的质粒基因直接免疫机体免疫机体 ，使外源基因在活体内表，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。引发免疫反应。（一）概（一）概 念念（二）（二）DNADNA疫苗的构成：疫苗的构成：1.1.抗原表达基因抗原表达基因 2.2.真核细胞启动子（如真核细胞启动子（如CMV I.ECMV I.E启动子）启动子）3.Poly A 3.Poly A 终止序列（如来自终止序列（如来自SV40 SV40 或或 BGHBGH基因）基因）4.4.原核细胞选择标志（如青霉素抗性基因）原核细胞选择标志（如青霉素抗性基因）5.5.增强免疫原性的核苷酸序列（如非甲基增强免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化化CpGCpG二核苷二核苷)二、二、DNADNA疫苗载体疫苗载体1.1.裸裸DNADNA疫苗：质粒、疫苗：质粒、MIDGEMIDGE载体载体2.2.病毒载体：病毒载体：天花病毒、腺病毒天花病毒、腺病毒 3.3.细菌载体：减毒活菌苗和繁殖缺陷细菌，细菌载体：减毒活菌苗和繁殖缺陷细菌，如伤寒菌苗、肠炎沙门氏菌苗、志贺氏菌如伤寒菌苗、肠炎沙门氏菌苗、志贺氏菌苗、单核细胞增生李斯特菌苗和小肠炎耶苗、单核细胞增生李斯特菌苗和小肠炎耶尔森氏菌苗尔森氏菌苗4.4.微粒包裹载体：金颗粒微粒包裹载体：金颗粒(gold particle)(gold particle)、脂质体、脂质体(liposomes)(liposomes)、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交聚乙交酯（酯（PLGAPLGA）、藻酸盐微粒）、藻酸盐微粒(alginate)(alginate)、和、和纳米微粒纳米微粒(nanoparticles)(nanoparticles)Various methods of gene deliveryVarious methods of gene delivery 三、三、DNADNA疫苗与常规疫苗的比较疫苗与常规疫苗的比较DNADNADNADNA疫苗疫苗疫苗疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗 灭活疫苗灭活疫苗灭活疫苗灭活疫苗/蛋白亚单位蛋白亚单位蛋白亚单位蛋白亚单位 抗原类型抗原类型抗原类型抗原类型内源性内源性内源性内源性内源性内源性内源性内源性外源性外源性外源性外源性APCAPCAPCAPC加工加工加工加工过程过程过程过程 蛋白酶体蛋白酶体蛋白酶体蛋白酶体 蛋白酶体蛋白酶体蛋白酶体蛋白酶体溶酶体溶酶体溶酶体溶酶体体液免疫体液免疫体液免疫体液免疫应答应答应答应答B B B B细胞细胞细胞细胞 主要主要主要主要的的的的IgGIgGIgGIgG类别类别类别类别IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 DNADNA疫苗与常规疫苗比较疫苗与常规疫苗比较DNADNADNADNA疫苗疫苗疫苗疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗 灭活疫苗灭活疫苗灭活疫苗灭活疫苗/蛋蛋蛋蛋白亚单位白亚单位白亚单位白亚单位 细胞细胞细胞细胞免疫免疫免疫免疫应答应答应答应答 CD4CD4CD4CD4ThThThTh/Th1Th1Th1Th1/Th1Th1Th1Th1CD8CD8CD8CD8 抗原提呈抗原提呈抗原提呈抗原提呈/免疫免疫免疫免疫记忆记忆记忆记忆体液免疫体液免疫体液免疫体液免疫 细胞免疫细胞免疫细胞免疫细胞免疫/参与参与参与参与细胞细胞细胞细胞因子因子因子因子IL-2,4IL-2,4IL-2,4IL-2,4，IFN-,IFN-,IFN-,IFN-,TNF-TNF-TNF-TNF-IL-2,IFN-IL-2,IFN-IL-2,IFN-IL-2,IFN-,TNF-,TNF-,TNF-,TNF-IL-4IL-4IL-4IL-4，5 5 5 5，10,1310,1310,1310,13DNADNA疫苗与常规疫苗比较疫苗与常规疫苗比较(续续1 1）DNADNADNADNA疫苗疫苗疫苗疫苗减毒活减毒活减毒活减毒活疫苗疫苗疫苗疫苗 灭活疫苗灭活疫苗灭活疫苗灭活疫苗/蛋白亚单位蛋白亚单位蛋白亚单位蛋白亚单位 效应机效应机效应机效应机制制制制 CTL CTL CTL CTL CTL CTL CTL CTL 中和反应中和反应中和反应中和反应激活补体激活补体激活补体激活补体ADCCADCCADCCADCC效应效应效应效应 制备制备制备制备易于构建、易于构建、易于构建、易于构建、生产生产生产生产 费用费用费用费用 运输运输运输运输/存储存储存储存储 安全性安全性安全性安全性DNADNA疫苗与常规疫苗比较疫苗与常规疫苗比较(续续2 2）核酸疫苗与第一、二代疫苗相比具有如下优势核酸疫苗与第一、二代疫苗相比具有如下优势：(1)(1)诱诱导导机机体体产产生生全全面面的的免免疫疫应应答答，其其保保护护性性免免疫疫应应答答对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用；对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用；(2)(2)无无减减毒毒、灭灭活活疫疫苗苗可可能能引引起起的的致致病病作作用用，具具有有可可靠靠的安全性；的安全性；(3)(3)能能表表达达经经修修饰饰的的天天然然抗抗原原，具具有有与与天天然然抗抗原原相相同同的的构象和抗原性；构象和抗原性；(4)(4)与亚单位疫苗共有的高产性；与亚单位疫苗共有的高产性；(5)(5)可可将将编编码码不不同同抗抗原原的的基基因因构构建建在在同同一一个个质质粒粒中中，或或将将不不同同抗抗原原基基因因的的多多种种重重组组质质粒粒联联合合应应用用，制制备备多多价价核酸疫苗；核酸疫苗；(6)(6)核酸疫苗既有预防作用，也有治疗作用；核酸疫苗既有预防作用，也有治疗作用；(7)(7)生产简便，成本低廉，稳定性好，贮运方便。生产简便，成本低廉，稳定性好，贮运方便。四、核酸疫苗诱导的免疫反应四、核酸疫苗诱导的免疫反应核酸疫苗诱导的全身免疫应答反应核酸疫苗诱导的全身免疫应答反应 关关于于核核酸酸疫疫苗苗诱诱导导全全身身免免疫疫应应答答反反应应的的机机制制目目前前了了解解的的还还不不十十分分清清楚楚，但但其其诱诱导导过过程程可可大大致致分分为为以以下下几几个阶段：个阶段：疫苗的摄取、转运及表达；疫苗的摄取、转运及表达；抗原的加工和提呈；抗原的加工和提呈；淋巴细胞的活化；淋巴细胞的活化；免疫效应细胞和分子的作用。免疫效应细胞和分子的作用。Immune mechanisms induced by inoculation Immune mechanisms induced by inoculation Immune mechanisms induced by inoculation Immune mechanisms induced by inoculation with naked DNAwith naked DNAwith naked DNAwith naked DNADepiction of the mechanisms of generation of antigen-Depiction of the mechanisms of generation of antigen-specific humoural and cellular responses.specific humoural and cellular responses.五、核酸疫苗的构建五、核酸疫苗的构建 1、将将亚亚单单位位疫疫苗苗的的编编码码基基因因作作为为核核酸酸疫疫苗苗的的候候选选基基因。因。2、多多肽肽合合成成疫疫苗苗的的核核酸酸推推导导序序列列作作用用核核酸酸疫疫苗苗的的候候选选基因基因 3、从病原体亚单位成分中筛选保护性抗原及编码基因、从病原体亚单位成分中筛选保护性抗原及编码基因 31 免疫筛选法免疫筛选法 32 化学分解法化学分解法 候选基因的筛选原则候选基因的筛选原则Ligate PCR product into pTARGETTM VectorTransform TG1 cellsSelecte recombinant clones by ampicillinpstpst酶切鉴定酶切鉴定酶切鉴定酶切鉴定挑取挑取挑取挑取S S基因正向插入的重组质粒基因正向插入的重组质粒基因正向插入的重组质粒基因正向插入的重组质粒pTARGET-hanSpTARGET-hanS测序测序测序测序重组质粒重组质粒pTARGET-hanSpTARGET-hanS的构建的构建:引物引物引物引物1:CT ACT 1:CT ACT ATGATG GCA ACT ATG GAG GAA GCA ACT ATG GAG GAA引物引物引物引物2:AC 2:AC TAA TAA TTA GAG TTT CAA AGG CTCTTA GAG TTT CAA AGG CTCPCR正向正向:酶切成酶切成3674，1870，1470反向反向:可酶切成可酶切成3674，2600,740 可可可可 酶酶酶酶 切切切切 成成成成 5.6kb5.6kb和和和和1.3kb1.3kb左右两个片段左右两个片段左右两个片段左右两个片段EcoREcoR酶切酶切酶切酶切琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳回收回收回收回收5.6kb5.6kb左右的大片段左右的大片段左右的大片段左右的大片段对照空载体对照空载体pTARGET的构建：的构建：用连接酶连接用连接酶连接用连接酶连接用连接酶连接成成成成为为为为闭闭闭闭环环环环pTARGETpTARGET空空空空载载载载体体体体,作为对照载体备用。作为对照载体备用。作为对照载体备用。作为对照载体备用。培养培养培养培养Vero-E6Vero-E6细胞细胞细胞细胞MEMMEM培养基培养基培养基培养基(10%FCS)(10%FCS)3737，5%CO5%CO2 2细细细细胞胞胞胞长长长长至至至至对对对对数生长期数生长期数生长期数生长期电穿孔转染重组质粒电穿孔转染重组质粒电穿孔转染重组质粒电穿孔转染重组质粒转染后转染后转染后转染后72h72h，收获细胞，收获细胞，收获细胞，收获细胞检检检检测测测测核核核核蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的瞬瞬瞬瞬时时时时表表表表达达达达,荧荧荧荧光显微镜下观察并拍照。光显微镜下观察并拍照。光显微镜下观察并拍照。光显微镜下观察并拍照。间接免疫荧光法间接免疫荧光法间接免疫荧光法间接免疫荧光法重组质粒重组质粒pTARGET-hanS体外瞬间表达体外瞬间表达:核蛋白的瞬时表达结果核蛋白的瞬时表达结果作为作为作为作为DNADNA免疫的注射样品。免疫的注射样品。免疫的注射样品。免疫的注射样品。质粒的大量制备及纯化质粒的大量制备及纯化:按按按按分分分分子子子子克克克克隆隆隆隆手手手手册册册册所所所所述述述述方方方方法法法法提提提提纯纯纯纯质质质质粒粒粒粒pcDNA3.1+pcDNA3.1+和和和和 pcDNA3.1+SpcDNA3.1+S用灭菌的用灭菌的用灭菌的用灭菌的PBSPBS溶解溶解溶解溶解调整浓度至调整浓度至1.0mg/ml用分光光度计测定用分光光度计测定A260/A280比值以确定比值以确定核酸样品的纯度，核酸样品的纯度，A260确定样品的浓度确定样品的浓度 实验动物的实验动物的DNADNA免疫免疫68W 龄的龄的BABC/c小鼠小鼠空白质粒空白质粒pcDNA3.1+重组质粒重组质粒pcDNA3.1+S免疫前先用盐酸布比卡因注射液预处理免疫前先用盐酸布比卡因注射液预处理3天后天后相同部位进行相同部位进行DNA接种接种加强免疫一次，共免疫加强免疫一次，共免疫3次。次。间隔间隔2周周细胞因子的动态变化细胞因子的动态变化常规方法分离脾细胞，浓度常规方法分离脾细胞，浓度110724孔孔细细胞胞培培养养板板每每孔孔加加入入脾脾细细胞胞悬悬液液0.5ml，NP10 l(同同时时设设空空白白对对照孔，照孔，ConA刺激孔刺激孔)均设均设3个复孔个复孔37、5%CO2孵箱培养孵箱培养48小时后小时后收收集集脾脾细细胞胞上上清清液液，贮贮于于-70，统统一一用用ELISA kits 检测检测IL-4和和IFN-分分分分别别别别于于于于免免免免疫疫疫疫后后后后5d,5d,10d,10d,17d,17d,35d,42d35d,42d每组处死每组处死3只小鼠只小鼠淋淋巴巴细细胞胞增增殖殖反反应应:脾细胞取自初次免疫后脾细胞取自初次免疫后42d的免疫鼠的免疫鼠以以重重组组的的核核蛋蛋白白刺刺激激免疫小鼠的脾细胞免疫小鼠的脾细胞阴性对照孔和阳性对照孔阴性对照孔和阳性对照孔(ConA)用用MTT法法检检测测脾脾细细胞胞的的增增殖殖反应，计算刺激指数（反应，计算刺激指数（SI）常常规规方方法法分分离离脾脾细细胞胞,浓度调整至浓度调整至2106免疫鼠血清的抗免疫鼠血清的抗NPNP抗体的测定抗体的测定:免免免免 疫疫疫疫 前前前前 和和和和 免免免免 疫疫疫疫 后后后后 5d,5d,10d,10d,17d,35d,42d17d,35d,42d经尾静脉采血经尾静脉采血经尾静脉采血经尾静脉采血N=6/group以以以以被被被被检检检检标标标标本本本本复复复复孔孔孔孔（3 3孔孔孔孔）ODOD值值值值与与与与免免免免疫疫疫疫前前前前血血血血清清清清（阴阴阴阴性性性性对对对对照照照照）的比值的比值的比值的比值2.12.1者为阳性。者为阳性。者为阳性。者为阳性。重重组组的的NP作作为为包包被被物物，辣辣根根过过氧氧化物酶标记的羊抗鼠化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗为二抗ELISA法检测血清的抗法检测血清的抗NP抗体抗体血清抗血清抗NPNP抗体滴度的测定抗体滴度的测定:将将将将初初初初次次次次免免免免疫疫疫疫后后后后4242天天天天的免疫鼠眼球取血的免疫鼠眼球取血的免疫鼠眼球取血的免疫鼠眼球取血N=6/group留留留留置置置置血血血血清清清清，以以以以1010倍倍倍倍稀稀稀稀释释释释为起点为起点为起点为起点,再做系列稀释再做系列稀释再做系列稀释再做系列稀释ELISA法法检测血清抗体滴度检测血清抗体滴度检测血清抗体滴度检测血清抗体滴度六、核酸疫苗的优化六、核酸疫苗的优化1 1、免疫效果的优化、免疫效果的优化 选择高效表达载体选择高效表达载体添加添加DNADNA免疫激活序列免疫激活序列 2 2、免疫途径的优化、免疫途径的优化 肌肉注射（im）基因枪导入 皮内(id)和皮下(sc)注射 黏膜表面接种 Effects of CpG motifs on various cellsEffects of CpG motifs on various cellsEffects of CpG motifs on various cellsEffects of CpG motifs on various cellsGeneration Generation Generation Generation of Immunity of Immunity of Immunity of Immunity after after after after Inoculation Inoculation Inoculation Inoculation of DNA of DNA of DNA of DNA Plasmid Plasmid Plasmid Plasmid with GpG with GpG with GpG with GpG MotifsMotifsMotifsMotifs2 2、免疫途径的优化、免疫途径的优化 3 3、基因佐剂、基因佐剂的应用的应用 细胞因子类细胞因子类共刺激分子共刺激分子分子佐剂联合分子佐剂联合 4 4、抗原蛋白的泛素化表达、抗原蛋白的泛素化表达IL-12IL-12、IL-15IL-15、IL-18IL-18及及IFN-IFN-以增强以增强Th1Th1型细胞应答为主型细胞应答为主。IL-4IL-4加强体液免疫加强体液免疫IL-2IL-2能同时加强体液免疫和细能同时加强体液免疫和细胞免疫胞免疫 集落刺激因子集落刺激因子5 5、与基因重组疫苗联合应用、与基因重组疫苗联合应用 细胞因子产生的动态变化细胞因子产生的动态变化细胞因子产生的动态变化细胞因子产生的动态变化免疫鼠脾细胞的增殖反应免疫鼠脾细胞的增殖反应血清特异性抗体的检测结果血清特异性抗体的检测结果血清特异性抗体的检测结果血清特异性抗体的检测结果免疫鼠脾细胞的增殖反应免疫鼠脾细胞的增殖反应免疫鼠脾细胞的增殖反应免疫鼠脾细胞的增殖反应血清的抗血清的抗NPNP抗体的测定结果抗体的测定结果血清的抗血清的抗NPNP抗体的测定结果抗体的测定结果七、核酸疫苗的安全性问题七、核酸疫苗的安全性问题 局部反应原性和全身毒性研究，即考虑局部反应原性和全身毒性研究，即考虑DNADNA疫苗是疫苗是否有免疫毒性作用，机体是否对疫苗编码的抗原产生否有免疫毒性作用，机体是否对疫苗编码的抗原产生耐受性，或是否导致自身免疫反应，还应对疫苗中污耐受性，或是否导致自身免疫反应，还应对疫苗中污染的细菌蛋白是否诱发抗体产生进行评估；染的细菌蛋白是否诱发抗体产生进行评估；遗传性作用，即质粒遗传性作用，即质粒DNADNA是否与宿主基因组的整合是否与宿主基因组的整合问题；问题；生殖毒性研究，可采用生殖毒性研究，可采用PCRPCR方法对经质粒方法对经质粒DNADNA疫苗免疫苗免疫的雄性或雌性动物的性腺疫的雄性或雌性动物的性腺DNADNA提取物进行检测提取物进行检测致肿瘤性研究，如果质粒致肿瘤性研究，如果质粒DNADNA疫苗构建具有与人的疫苗构建具有与人的基因组同源的基因组同源的DNADNA序列，或其载体含有已知的潜在致序列，或其载体含有已知的潜在致癌基因序列时，需展开这方面的研究。癌基因序列时，需展开这方面的研究。1 1、有关基因整合的研究、有关基因整合的研究 一个最重要的理论危机是质粒一个最重要的理论危机是质粒DNADNA与宿主与宿主基因组整合的问题，因为当外源基因组整合的问题，因为当外源DNADNA与基因组与基因组整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染色体断裂，或染色体重排而致染色体不稳定，色体断裂，或染色体重排而致染色体不稳定，从而导致肿瘤细胞形成。从而导致肿瘤细胞形成。尚尚无无证证据据证证明明以以自自身身表表达达质质粒粒的的形形式式存存在在于于染色体外的外源染色体外的外源DNADNA能整合入宿主染色体中。能整合入宿主染色体中。其其整整合合发发生生率率较较自自然然整整合合发发生生率率低低3 3个个数数量量级级，另另鲑鲑鱼鱼精精DNADNA已已经经以以一一种种非非处处方方药药形形式式经经口口服服或或注注射射等等多多种种方方式式使使用用了了数数十十年年，却却未未见见任何明显的副作用任何明显的副作用。一些事实已清楚地证明脾内或口服裸一些事实已清楚地证明脾内或口服裸DNADNA可能导致整合可能导致整合 2 2、关于免疫耐受的研究、关于免疫耐受的研究 外外源源性性抗抗原原的的持持续续表表达达可可能能产产生生不不良良后后果果：耐受性、自动免疫、过敏反应、超免反应等。耐受性、自动免疫、过敏反应、超免反应等。持续低表达持续低表达-可被抗体中和清除，可被抗体中和清除，无足够的免疫应答。无足够的免疫应答。持续高表达持续高表达-超免反应发生超免反应发生免疫抑制免疫抑制 其它病原感染。其它病原感染。免疫免疫2 2天的小鼠产生耐受天的小鼠产生耐受 免免疫疫出出生生2424小小时时内内的的小小鼠鼠，与与在在成成年年小小鼠鼠中观察到的没有区别。中观察到的没有区别。HBsAgHBsAg转转基基因因小小鼠鼠进进行行DNADNA免免疫疫，使使已已经经建建立立的的对对HBsAgHBsAg的的特特异异性性免免疫疫耐耐受受状状态态被被打打破破，使小鼠产生抗使小鼠产生抗HBsAgHBsAg的特异性抗体。的特异性抗体。实验结果实验结果：结论结论：免疫耐受与抗原类型、浓度、给药：免疫耐受与抗原类型、浓度、给药方式及宿主种属、宿主年龄等因素有关。方式及宿主种属、宿主年龄等因素有关。3 3、关于自身免疫性疾病的研究、关于自身免疫性疾病的研究 潜在性诱导抗质粒潜在性诱导抗质粒DNADNA的免疫反应是另一个必须关注的安全的免疫反应是另一个必须关注的安全性问题。性问题。研究表明：研究表明：用细菌用细菌DNADNA与与mBASmBAS及及CFACFA形成的复合体免疫小鼠，能形成的复合体免疫小鼠，能诱导小鼠产生与哺乳动物诱导小鼠产生与哺乳动物dsDNAdsDNA发生反应的发生反应的IgGIgG自身抗自身抗体。体。用各种构建的质粒载体进行的质粒用各种构建的质粒载体进行的质粒DNADNA的免疫并未的免疫并未发现抗发现抗DNADNA抗体的产生。抗体的产生。DNADNA疫苗接种有自身免疫倾向的小鼠，重复给药并疫苗接种有自身免疫倾向的小鼠，重复给药并没有启动或加重具有狼疮倾向个体的疾病发生及发展没有启动或加重具有狼疮倾向个体的疾病发生及发展过程。过程。4 4、其它不良反应、其它不良反应 进进行行的的期期临临床床试试验验表表明明，未未观观察察到不可接受的不良反应。到不可接受的不良反应。八、八、DNADNA疫苗的应用疫苗的应用 （一）感染性疾病（一）感染性疾病 （二）肿瘤（二）肿瘤 （三）自身免疫病与变态反应（三）自身免疫病与变态反应表表 病毒的病毒的DNADNA疫苗疫苗病毒病毒抗原抗原免疫途径免疫途径动物模型动物模型流感病毒流感病毒HIV-1HIV-1，2 2SIVSIVFIVFIVHTLV-1HTLV-1HBVHBVHCVHCVHEVHEV狂犬病毒狂犬病毒NPNP，HAHAenvenv混合，混合，envenv，gaggag混合，混合，envenvenvenv，rexrexHBsAgHBsAg，envenvC C，E2E2ORF3 ORF3 GPGP肌注，基因枪，皮下，肌注，基因枪，皮下，静注，静注，in.in.肌注，基因枪，静注，肌注，基因枪，静注，鼻内，阴道内鼻内，阴道内肌注，基因枪，静注肌注，基因枪，静注肌注肌注肌注肌注肌注，皮下肌注，皮下肌注肌注肌注，基因枪，皮下肌注，基因枪，皮下小鼠、鸡、猪、小鼠、鸡、猪、雪貂雪貂小鼠、恒河猴、小鼠、恒河猴、猿猴、人猿猴、人恒河猴恒河猴大鼠大鼠兔兔小鼠、猿猴小鼠、猿猴小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠、猴小鼠、猴病毒病毒抗原抗原免疫途径免疫途径动物模型动物模型伪狂犬病毒伪狂犬病毒登革热病毒登革热病毒麻疹病毒麻疹病毒脑心肌炎脑心肌炎LCMVLCMV轮状病毒轮状病毒猿猴病毒猿猴病毒4040牛疱疹病毒牛疱疹病毒柯萨奇病毒柯萨奇病毒埃博拉病毒埃博拉病毒HSV-1HSV-1，2 2细小病毒细小病毒CRPVCRPVRSVRSVIE180,gD,gCIE180,gD,gCpreMpreMenvenvHA,NPHA,NPVP1VP1NPNPVP6,VP4,VP7VP6,VP4,VP7T-AgT-AggDgDVP1VP1，混合，混合NP,GPNP,GPgB,ICP27gB,ICP27，gD2gD2VP1VP1L1L1F F肌注，基因枪肌注，基因枪基因枪基因枪肌注肌注肌注肌注肌注，皮下，基肌注，皮下，基因枪，口服因枪，口服肌注肌注肌注，皮下肌注，皮下肌注肌注基因枪基因枪肌注，眼内肌注，眼内肌注肌注肌注肌注肌注，皮内肌注，皮内小鼠，猪小鼠，猪小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠牛牛小鼠小鼠小鼠，豚鼠小鼠，豚鼠小鼠，豚鼠小鼠，豚鼠狗狗兔兔小鼠小鼠表表 病毒的病毒的DNADNA疫苗（续）疫苗（续）表表 细菌的细菌的DNADNA疫苗疫苗细菌细菌细菌细菌抗原抗原抗原抗原接种途径接种途径接种途径接种途径动物模型动物模型动物模型动物模型结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体破伤风杆菌破伤风杆菌破伤风杆菌破伤风杆菌肺炎支原体肺炎支原体肺炎支原体肺炎支原体沙眼衣原体沙眼衣原体沙眼衣原体沙眼衣原体伤寒沙门菌伤寒沙门菌伤寒沙门菌伤寒沙门菌Hsp65Hsp65Hsp65Hsp65，Ag85A,B,CAg85A,B,CAg85A,B,CAg85A,B,C19kDa.AhpC19kDa.AhpC19kDa.AhpC19kDa.AhpCOspAOspAOspAOspA破伤风毒素破伤风毒素破伤风毒素破伤风毒素ELIELIELIELIMOMPMOMPMOMPMOMP，CTPCTPCTPCTPOmpCOmpCOmpCOmpC肌注肌注肌注肌注肌注肌注肌注肌注,皮下皮下皮下皮下肌注肌注肌注肌注肌注肌注肌注肌注小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠表表 寄生虫的寄生虫的DNADNA疫苗疫苗寄生虫寄生虫寄生虫寄生虫抗原抗原抗原抗原接种接种接种接种途径途径途径途径动物动物动物动物模型模型模型模型考德里体考德里体考德里体考德里体硕大利什曼原虫硕大利什曼原虫硕大利什曼原虫硕大利什曼原虫锥虫锥虫锥虫锥虫约氏疟原虫约氏疟原虫约氏疟原虫约氏疟原虫夏氏疟原虫夏氏疟原虫夏氏疟原虫夏氏疟原虫日本血吸虫日本血吸虫日本血吸虫日本血吸虫 MAP1MAP1MAP1MAP1gp63gp63gp63gp63trans-sialidasetrans-sialidasetrans-sialidasetrans-sialidase，ELIELIELIELICSP,