T∕CACM 012-2016 金钱白花蛇快速 PCR 鉴定.docx

目摇 摇 次前言  玉1摇 范围  12摇 规范性引用文件  13摇 术语和定义  14摇 方案  25摇 仪器设备  26摇 试剂和溶液配制  27 检验程序  38摇 结果判定  49摇 结果报告  410摇 质量保证 411摇 废弃物处理 4附录 A ( 资料性附录) 金钱白花蛇快速 PCR 鉴定体系的建立  5前摇 摇 言本标准的全部技术内容为推荐性。本标准是对  中华人民共和国药典 标准的补充。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位: 中国中医科学院中药资源中心、 广东省食品药品检验所。本标准主要起草人: 袁媛、 黄璐琦、 李华、 蒋超、 杨志业、 赵玉洋、 何雅莉。请注意本标准的某些内容有可能涉及专利, 本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。玉T / CACM 0122016金钱白花蛇快速 PCR 鉴定1摇 范围本标准规定了使用快速 PCR 鉴定金钱白花蛇药材和饮片的通用方法和要求。本标准适用于金钱白花蛇药材和饮片鉴定。2摇 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。 凡是注日期的引用文件, 其随后所有的修改单 ( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准。 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准。 中华人民共和国药典 (2015 年版)GB / T 6682  分析实验室用水规格和试验方法GB / T 23632  进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程GB / T 27403  实验室质量控制规范食品分子生物学检测3摇 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3郾 1送检样品 test sample按一定规则取自某一整体的一个或多个部分, 并能反映该整体的相关信息, 可以作为判断该整体的基础。3郾 2DNA 提取 DNA extraction从样品提取出 DNA 的方法。3郾 3DNA 扩增 DNA amplification通过一定技术使一段特定的 DNA 片段拷贝数增加的过程, 可通过聚合酶链式反应技术实现。3郾 4聚合酶链式反应 polymerase chain reaction ( PCR)模板 DNA 先经高温变性为单链, 两条引物分别与模板 DNA 两条链上相应的一段互补序列发生退火, 在 DNA 聚合酶的作用下, 以四种脱氧核糖核酸 ( dNTP) 为底物, 使退火引物得以延伸, 然后不断重复变性、 退火和延伸这一循环, 使位于两段已知序列之间的 DNA 片段拷贝数呈几何倍数扩增。其扩增产物可通过多种特异性和敏感性好的方法进行分析。3郾 5阳性对照 positive control一般使用对照药材代替送检样品同法 DNA 提取、 靶核酸扩增和产物检测过程, 用于证明鉴定过程可获得目标核酸片段的操作。3郾 6阴性对照 negative control使用常见伪品药材代替送检样品同法 DNA 提取、 靶核酸扩增和产物检测过程。3郾 7空白对照 blank control以水代替送检样品同法 DNA 提取、 靶核酸扩增和产物检测过程, 用以证明提取过程中没有核酸1T / CACM 0122016污染。4摇 方案金钱白花蛇快速 PCR 鉴定应采用抽取有代表性的送检样品与对照药材比较的验证方式, 即依据金钱白花蛇特异性 DNA 序列进行鉴定。 利用碱裂解法提取金钱白花蛇模板 DNA, 以提取的 DNA 为模板进行 PCR 扩增, 荧光检测或琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物。5摇 仪器设备5郾 1摇 仪器设备所有制备样品使用的器具在使用前应灭菌处理。5郾 1郾 1摇 PCR 仪使用前应进行温度校准。5郾 1郾 2摇 手持式紫外灯可检测 365nm 紫外波长。5郾 1郾 3摇 连续可调微量移液枪至少应该包括 0郾 1  2郾 5滋L、 0郾 5  10郾 0滋L、 10  100滋L、 100  1000滋L 规格, 并包括配套一次性吸头。5郾 1郾 4摇 保温设备至少应包含 4益 与 - 20益 温区。6摇 试剂和溶液配制除另有规定外, 实验试剂为不含 DNA 和 DNase 的分析纯或生化试剂; 实验用水符合 GB / T 6682的要求; 所配制的试剂均应灭菌后保存, 并在容器上注明试剂名称、 浓度、 配制时间、 保存条件、 失效日期和配制者姓名; PCR 试剂应小量分装保存以减少污染; 材料及试剂的保存都应有防污染措施。6郾 1摇 DNA 提取缓冲液含有 0郾 5mol / L 氢氧化钠 ( NaOH) 、 1% 聚乙烯吡咯烷酮 - 40 ( PVP - 40) 、 1% 聚乙二醇辛基苯基醚 ( Triton X 100 ) 溶液: 在 800mL 去离子水中溶解 20郾 0g NaOH, 冷却至室温后加入 10g PVP 和10mL Triton X 100, 溶解后加水定容至 1L, 分装后过滤除菌。6郾 2摇 中和缓冲液含有 0郾 1mol / L 三羟甲基氨基甲烷盐酸 ( Tris - HCl) 溶液, pH 值为 8郾 0: 在 800mL 去离子水中溶解 12郾 1g 三羟甲基氨基甲烷 ( Tris) , 冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的 pH 值至 8郾 0, 加水定容至1L, 分装后高压灭菌。6郾 3摇 dNTP 混合液含有等量 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP, 使用时调整浓度至 10mmol / L。6郾 4摇 10 伊 PCR 缓冲液依据不同类型的 Taq 酶选择对应的 10 伊 PCR 缓冲液。6郾 5摇 20% PVP 溶液在 80mL 去离子水中溶解 20郾 0g PVP - 40, 加水定容至 100mL, 分装后过滤除菌, 冷却后 - 20益保存。6郾 6摇 10mg / mL BSA 溶液在 80mL 去离子水中溶解 1郾 0g 牛血清白蛋白 ( BSA) , 加水定容至 100mL, 分装后过滤除菌, 冷却后 - 20益 保存。6郾 7摇 Taq DNA 聚合酶 (5U / 滋L)检测用 Taq DNA 聚合酶应无 3爷 寅5爷 核酸外切酶活性, Taq DNA 聚合酶在 - 20益 下保存, 使用时置冰上操作。2T / CACM 01220166郾 8摇 金钱白花蛇检测用引物对序列JQBHS郾 F: 5'- GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT - 3'JQBHS郾 R: 5'- GGAATCTTATCGATATCTGAATTAGTA - 3'。用灭菌 ddH2 O 将上述引物溶解至 10滋mol / L。6郾 9摇 50 伊 TAE 电泳缓冲液在 800mL 去离子水中溶解 242g Tris, 37郾 2g 乙二胺四乙酸二钠 Na2 EDTA·2H2 O, 加入 57郾 1mL 的醋酸, 充分混匀, 加去离子水定容至 1L, 室温保存, 使用时用去离子水 50 倍稀释。6郾 10摇 6 伊 加样缓冲液在 80mL 去离子 水 中 溶 解 溴 酚 蓝 250mg, 二 甲 苯 青 250mg, 蔗 糖 250mg, 加 水 定 容 至 100mL,分装。7 检验程序为防止交叉污染, 收样、 取样、 粉碎、 DNA 提取、 核酸扩增和产物检测应在不同操作间或在同一操作间不同隔离区域进行, 进入各区域应严格按照单一方向进行, 即样品制备区寅核酸制备区寅扩增区寅检测区。7郾 1摇 取样送检样品抽样方法参照 2015 年版  中华人民共和国药典 四部药材和饮片取样法 ( 通则 0211)进行取样。 送检样品应可分成 2 批, 每批可分为同样的 3 份, 总量不应少于 20g。 收样时应检查包装的完整性, 并在样品袋上贴上标签, 填写采集数据表。 对商品包装和送样说明进行拍照记录, 照片随样品一起备档。 去除药材和饮片表面附着物, 依次使用 75% 乙醇和无菌双蒸水擦拭表面后晾干。7郾 2摇 粉碎取送检样品置乳钵、 匀浆机或球磨粉碎仪中充分研磨粉碎, 必要时加适量液氮研磨。7郾 3摇 DNA 提取称取经预处理的送检样品 20mg 置 2郾 0mL 离心管中; 加入 200滋L 提取缓冲液, 充分混匀; 加入800滋L 中和缓 冲 液, 充 分 混 匀; 12000r / min 离 心 1min 或 静 置 5min; 转 移 500滋L 上 清 液 至 一 新 的1郾 5mL 离心管, 加入 500滋L 中和缓冲液, 充分混匀; 12000r / min 离心 1min 或静置 5min; 转移上清液作为 DNA 模板待测或 - 20益 保存备用。 每个送检样品必须重复 2 次, 每 1 次从送检样品提取核酸的过程都必须设置 1 个提取空白对照。注: 使用碱裂解法提取的金钱白花蛇 DNA 可在 4益 下保存 3 天或 - 20益 下保存 7 天, 不宜长期保存。7郾 4摇 核酸扩增首次使用本方法时, 应校对 PCR 仪温控准确性, 并使用阳性对照和阴性对照以核对使用的 Taq聚合酶的适用性。7郾 4郾 1摇 对照试验PCR 检测应重复 2 次, 并设置阳性对照、 阴性对照和空白对照。7郾 4郾 2摇 PCR 反应体系在 200滋L 的 PCR 管中进行, 反应总体积为 25滋L, 反应体系包括 10 伊 PCR 缓冲液 2郾 5滋L、 dNTP混合液 (10mmol / L) 1滋L、 鉴定引物 (10滋mol / L) 各 0郾 2滋L、 Taq DNA 聚合酶 1滋L、 模板 DNA (10 50ng) 1滋L, 无菌双蒸水 19郾 1滋L。 将反应液充分混匀。7郾 4郾 3摇 PCR 反应参数将 PCR 管置 PCR 仪内进行 PCR 反应。 反应程序为: 94益 预变性 1min; 94益 变性 10s, 62益 退火延伸 10s, 30 个循环。 对扩增产物进行检测或置 4益 下保存。3T / CACM 01220167郾 5摇 扩增产物检测7郾 5郾 1摇 荧光染料显色检测PCR 反应结束后在 PCR 反应体系内加入 2滋L 100 伊 SYBR Green 玉染料, 混匀后于 365nm 紫外波长下检测荧光, 若 PCR 产物出现与阳性对照相同的荧光即为阳性结果, 反之为阴性结果。7郾 5郾 2摇 琼脂糖凝胶电泳检测取 PCR 扩增产物, 加入 6 伊 上样缓冲液混匀, 2% 琼脂糖凝胶电泳染色, 紫外波长下检测。 阴性对照和空白对照无条带, 且送检样品与阳性对照在 500  750bp 范围内有一条 DNA 条带为阳性结果,否则为阴性结果。8摇 结果判定在阴性对照、 阳性对照和空白对照结果符合规定的情况下, 若送检样品与阳性对照一致, 则判定测试结果为阳性, 否则为阴性。9摇 结果报告9郾 1摇 一般要求定性检测结果应表示为阳性 “ + 冶 或阴性 “ - 冶 。9郾 2摇 鉴定报告样品经检测后, 实验室应根据实验的具体操作程序和结果做好详细的实验记录, 出具检测报告。检测报告至少包含以下内容:送检样品的名称、 状态和明确的标识;检测依据;取样方法与日期;储存条件;检测开始和结束日期;检测负责人和实验人员;阳性对照、 阴性对照、 送检样品;特定方法取得的结果, 结果使用的单位及计算方法;检测结论;检测过程观察到的特别情况;其他需要报告的内容。10摇 质量保证检测结果应来自同一实验室样品的两份送检样品。 当一份送检样品的结果为阳性, 另一份为阴性时, 要重新测试。 可以适当增加核酸扩增反应体系中 DNA 模板量, 使两份样品得到相同结果。 每个样品应至少制备两份 DNA, 必要时需检测模板 DNA 的质量, 确保提取的 DNA 片段大于扩增片段。 核酸扩增可设置 PCR 抑制剂对照。 如果经过两次以上从核酸提取开始的重复检测, 检测结果不一致,可在检测报告中注明检测低限, 检测低限应符合最低含量水平。11摇 废弃物处理检测过程中的废弃物, 收集后在焚烧炉中焚烧处理, 有毒有害废弃物应经过除害再进行处理, 处理要符合环保要求。4T / CACM 0122016附录 A( 资料性附录)金钱白花蛇快速 PCR 鉴定体系的建立A郾 1摇 金钱白花蛇及其伪品资料金钱白花蛇为 2015 年版  中国药典 的收录品种, 来源于眼镜蛇科环蛇属动物银环蛇 Bungarusmulticinctus Blyth 的幼蛇干燥体。 目前药材市场上金钱白花蛇伪品数目很多, 质量问题严重, 其伪品共分为 3 大类: 淤形态类似的其他种属幼蛇, 包括赤链蛇、 赤链华游蛇、 中国水蛇、 铅色水蛇、 金环蛇、 黄链蛇、 黑背白环蛇等; 于拼接蛇, 系指使用金钱白花蛇头, 拼接其他伪品蛇的蛇身制成成品,主要有铅色水蛇画上横纹拼接金钱白花蛇身, 或赤链蛇、 赤链华游蛇染色后接上金钱白花蛇头制成的伪品; 盂把大条的银环蛇切开, 加工成小蛇形态, 接上金钱白花蛇头制成的伪品。对亳州、 安国、 玉林、 广州、 昆明等几个大型药材市场进行走访调查发现, 在市场上见到的金钱白花蛇伪品总共有 6 种, 分别为铅色水蛇、 中国水蛇、 赤链蛇、 赤链华游蛇、 金环蛇、 眼镜蛇, 其中最为常见的是赤链蛇和赤链华游蛇。A郾 2摇 引物设计使用 BioEdit 软件对正品金钱白花蛇以及黑眉锦蛇、 红点锦蛇、 滑鼠蛇、 赤链华游蛇、 赤链蛇等伪品的 Cytb 序列进行序列比较, 找到差异片段, 设计鉴定引物 5 ' - GAAATTTCGGCTCTATGCTTATA鄄ACCTGTCTTT - 3'和 5'- GGAATCTTATCGATATCTGAATTAGTA - 3', 见图 A郾 1。图 A郾 1摇 金钱白花蛇正伪品序列比对及引物设计结果5T / CACM 0122016A郾 3摇 实验样品采集不同药材市场与 13 家不同药房金钱白花蛇样品进行方法的适用性检测; 采集各大药材市场中存在的 24 种其他科属蛇类样品进行特异性检测, 见表 A郾 1。表 A郾 1摇 蛇类样品表No郾物种拉丁名采集地个数1乌梢蛇Zaocys dhumnades安徽亳州82乌梢蛇Z郾 dhumnades北京同仁堂13乌梢蛇Z郾 dhumnades中药资源中心14乌梢蛇Z郾 dhumnades北京永安堂15金钱白花蛇Bungarus multicinctus安徽亳州106金钱白花蛇B郾 multicinctus深圳市药品检验所27金钱白花蛇B郾 multicinctus河北安国17金钱白花蛇B郾 multicinctus各大药房137蕲蛇Agkistrodon acutus安徽亳州48蕲蛇A郾 acutus安徽黄山19蕲蛇A郾 acutus北京同仁堂110蕲蛇A郾 acutus北京永安堂111蕲蛇A郾 acutus中药资源中心112眼镜蛇Naja naja安徽亳州313孟加拉眼镜蛇Naja kaouthia安徽亳州113中国水蛇Enhydris chinensis安徽亳州214铅色水蛇Enhydris plumbea安徽亳州115铅色水蛇E郾 plumbea河北安国116赤链蛇Lycodon rufozonatus安徽亳州317竹叶青Trimeresurus stejnegeri安徽亳州118王锦蛇Elaphe carinata安徽亳州319王锦蛇E郾 carinata深圳市药品检验所120王锦蛇E郾 carinata中国食品药品检定研究院121红纹滞卵蛇Oocatochus rufodsata安徽亳州122红纹滞卵蛇O郾 rufodsata中国食品药品检定研究院123灰鼠蛇Ptyas korros安徽亳州224短尾蝮蛇Gloydius brevicaudus安徽亳州125蝮蛇Agkistrodon halys安徽亳州126黑眉锦蛇Elaphe taeniura深圳市药品检验所127黑眉锦蛇E郾 taeniura江西昌北128平颏海蛇Pelamis platurus安徽亳州229三索锦蛇Elaphe radiata河北安国130百花锦蛇Elaphe moellendorffi中国食品药品检定研究院131赤链华游蛇Sinonatrix annularis中国食品药品检定研究院132虎斑游蛇Rhabdophis tigrinus中国食品药品检定研究院133虎斑游蛇R郾 tigrina河北安国134山烙铁头蛇Ovophis monticola中国食品药品检定研究院16T / CACM 0122016A郾 4摇 PCR 反应体系的建立在 200滋L 离心管中进行 PCR 反应。 反应总体积为 25滋L, 包括 10 伊 PCR 缓冲液 2郾 5滋L、 dNTP 混合液 ( 总浓度为 10mmol / L) 1滋L、 引物溶液 ( 含正向和反向引物) 各 0郾 2滋L、 Taq DNA 聚合酶 1U、模板 / 对照 DNA (10  50ng) 1滋L, 用无菌双蒸水补足反应体积至 25滋L。 将反应液振荡混匀, 瞬时离心。 将 PCR 管置 PCR 仪内进行 PCR 反应。PCR 反应程序: 94益 预变性 1min; 94益 变性 10s, 62益 退火延伸 10s, 30 个循环, 获得扩增产物。 取出 PCR 管, 对反应产物进行检测或置 4益 下保存。取 5滋L 反应液经 1郾 5% 琼脂糖凝胶电泳, 染色后接通电源按 5V / cm 恒压进行电泳 20min, 电泳结束后, 将凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。 上述 PCR 各主要参数均经过系统的考察。A郾 4郾 1摇 碱裂解法提取蛇类材料总 DNA使用碱裂解法提取蛇类样品总 DNA, 使用通用引物 Cytb - H / Cytb - L 进行扩增, 以检测所获得蛇类样品总 DNA 是否适用于 PCR 扩增。 经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测结果表明, 利用 Cytb - H / Cytb - L引物, 所有样品均获得约 400bp 大小的扩增产物, 见图 A郾 2, 说明碱裂解法提取的 DNA 可以满足PCR 反应的要求。图 A郾 2摇 Cytb - H / Cytb - L 通用引物扩增结果M: DL2000 marker; 1: 乌梢蛇; 2: 金钱白花蛇; 3: 蕲蛇; 4: 眼镜蛇; 5: 孟加拉眼镜蛇; 6: 中国水蛇; 7: 铅色水蛇; 8: 铅色水蛇; 9: 赤链蛇; 10: 竹叶青; 11: 王锦蛇; 12: 王锦蛇; 13: 王锦蛇; 14: 红纹滞卵蛇; 15: 灰鼠蛇;16: 蝮蛇; 17: 黑眉锦蛇; 18: 平颏海蛇; 19: 三索锦蛇; 20: 百花锦蛇; 21: 赤链华游蛇; 22: 虎斑游蛇; 23: 山烙铁头蛇; C: 阴性对照A郾 4郾 2摇 金钱白花蛇分子鉴定条件考察使用设计的金钱白花蛇快速 PCR 鉴定引物对不同产地金钱白花蛇及其混伪品进行扩增, 并考察:淤退火温度: 58益 , 60益 , 62益 , 64益  于PCR 循环数: 30, 28, 26, 24, 22 个循环; 盂变性温度:94益 , 92益 , 90益 , 88益 , 86益 , 84益  榆变性和退火时间: 20s, 10s, 5s, 3s, 1s; 虞Taq 种类: rTaq DNA 聚合酶, SpeedSTAR HS Taq DNA 聚合酶, Apta DNA 聚合酶 Mix, Transfast Taq DNA 聚合酶;愚不同 PCR 仪: 9700 型 PCR 仪 ( ABI 公司) , VeritiTM 96 孔梯度 PCR 扩增仪 ( Applied Biosystems 公司) , TC - 512 型 PCR 扩增仪 ( TECHNE 公司) 。对金钱白花蛇鉴定结果进行考察, 结果表明, PCR 反应程序中, 94益 预变性 1min 后, 满足变性温度超过 88益 , 变性时间超过 5s, 退火温度在 58  64益 之间, 退火时间超过 5s, 循环数超过 28 个循环参数均可准确鉴定金钱白花蛇, 见图 A郾 3。 为增加金钱白花蛇鉴定的稳定性, 标准制定参数均在此基础上有所提高。最终确定金钱白花蛇快速 PCR 鉴定的反应程序为: 94益 预变性 1min; 94益 变性 10s, 62益 退火延伸 10s, 30 个循环。A郾 4郾 3摇 方法的适用性与特异性考察采用上述确定的程序, 对金钱白花蛇 13 批样品及 20 批伪品进行鉴定 ( 图 A郾 4、 图 A郾 5) , 结果表明该体系能稳定准确地鉴定金钱白花蛇。7T / CACM 0122016图 A郾 3摇 金钱白花蛇快速 PCR 反应的优化1: 金钱白花蛇; 2: 眼镜蛇。 A: Veriti PCR 扩增仪 ( Applied Biosystems 公司); B: 9700 型 PCR 扩增仪 ( ABI 公司);C: TC - 512 型 PCR 扩增仪 ( TECHNE 公司)。 a: r Taq ( Takara 公司); b: SpeedSTAR HS Taq ( Takara 公司); c:Transfast Taq (TransGen 公司); d: Apta Taq (Roche 公司)图 A郾 4摇 金钱白花蛇快速 PCR 鉴定不同批次正品M: DL2000 Marker; 1: 阳性对照; 2 - 14: 金钱白花蛇; 15: 阴性对照; 16: 空白对照图 A郾 5摇 金钱白花蛇快速 PCR 鉴定伪品M: DL2000 Marker; 1: 阳性对照; 2: 金钱白花蛇; 3: 黑眉锦蛇; 4: 红点锦蛇; 5: 灰鼠蛇: 6: 赤链华游蛇; 7: 赤链蛇; 8:中国水蛇; 9: 短尾蝮蛇; 10: 眼镜蛇; 11: 乌梢蛇; 12: 蝮蛇; 13: 金环蛇; 14: 铅色水蛇; 15: 王锦蛇; 16: 百花锦蛇; 17:虎斑颈槽蛇; 18: 山烙铁头; 19: 三索锦蛇; 20: 平颏海蛇; 21: 蕲蛇; 22: 双环蛇; 23: 阴性对照; 24: 空白对照8T / CACM 0122016A郾 5摇 PCR 产物荧光检测在金钱白花蛇及其伪品特异性 PCR 扩增产物中加入 2滋L 100 伊 SYBR Green 玉于 365nm 紫外波长下检测荧光, 结果仅正品金钱白花蛇有强烈绿色荧光, 伪品无荧光, 表明通过特异性 PCR 使用荧光颜色可特异性鉴定金钱白花蛇, 如图 A郾 6。图 A郾 6摇 金钱白花蛇快速 PCR 鉴定结果b: 金钱白花蛇; 1: 眼镜蛇; 2: 赤链蛇; 3: 王锦蛇; 4: 灰鼠蛇; 5: 空白对照9