【生物】基因工程的基本操作程序课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptx

苏云金杆菌苏云金杆菌与载体拼接与载体拼接 普通棉花普通棉花（无抗虫特性）（无抗虫特性）棉花细胞棉花细胞抗虫棉抗虫棉提取提取表达表达BtBt基因基因导入导入BtBt基因基因重组重组DNA分子分子培育转基因抗虫棉的简要过程培育转基因抗虫棉的简要过程问题探讨1.1.目的基因的目的基因的筛选与获取筛选与获取2.2.基因表达基因表达载体的构建载体的构建3.3.将目的基因将目的基因导入受体细胞导入受体细胞4.4.目的基因的目的基因的 检测与鉴定检测与鉴定（核心工作）第第2节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1基因表达载体的构建2 2目的基因的筛选与获取3 3将目的基因导入受体细胞4 4目的基因的检测与鉴定四个步骤：基因表达载体的构建（核心）基因表达载体的构建（核心）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序有了目的基因，我们才能有了目的基因，我们才能赋予赋予一种生物一种生物以以另一种生物的遗传特性另一种生物的遗传特性。使目的基因在使目的基因在受体细胞中稳定存在受体细胞中稳定存在，并可并可进行遗传、表达和发挥作用进行遗传、表达和发挥作用。载体载体进入受体细胞稳定表达进入受体细胞稳定表达，才能实现，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。一种生物的基因在另一种生物中的转化。确定目的基因是否确定目的基因是否真正在受体细胞中真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达稳定遗传和正确表达。第第2节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取1.1.目的基因目的基因（1 1）概念：）概念：用于用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；等的基因；如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相 关的基因。关的基因。主要是主要是编码特定蛋白质编码特定蛋白质的基因，也可以是具有的基因，也可以是具有调控作用的因子调控作用的因子一资资料料：苏苏云云金金杆杆菌菌通通过过产产生生苏苏云云金金杆杆菌菌伴伴胞胞晶晶体体蛋蛋白白（BtBt抗抗虫虫蛋蛋白白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将科学家将“杀虫基因杀虫基因”转入棉花中，棉花产生转入棉花中，棉花产生Bt Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因目的基因思考：思考：1.Bt1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？抗虫蛋白的抗虫原理是什么？2.2.抗虫棉中的抗虫棉中的BtBt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？当当BtBt抗虫蛋白被抗虫蛋白被分解为多肽分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。BtBt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中碱性环境中才能表现出才能表现出毒性，而人和牲畜的毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性胃液呈酸性，肠道细胞也，肠道细胞也没有特异性受没有特异性受体体，因此，因此，BtBt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响对对BtBt基因的表达产物基因的表达产物-Bt-Bt抗抗虫蛋白有较为深入的了解虫蛋白有较为深入的了解BtBt基因是培基因是培育转基因抗育转基因抗虫棉较为合虫棉较为合适的目的基适的目的基因因目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取2.2.筛选合适的目的基因筛选合适的目的基因方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。DNADNA测序仪测序仪核苷酸序列比对核苷酸序列比对氨基酸序列比对氨基酸序列比对u越来越多基因的功能和结构被分析。一苏云金杆菌的杀虫作苏云金杆菌的杀虫作用于用于BtBt基因有关基因有关掌握了掌握了BtBt基因基因的序列信息的序列信息苏云金杆菌制剂苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害可防治棉花虫害实例：利用利用PCRPCR技术获取和扩增技术获取和扩增（重点）（重点）cDNAcDNA文库文库直接获取直接获取人工合成人工合成基因文库（基因文库（P82P82了解了解）（化学合成法）：根据测序技术或从（化学合成法）：根据测序技术或从GenBankGenBank等序列数据库等序列数据库中掌握了目的基因的序列后，用中掌握了目的基因的序列后，用DNADNA合成仪进行人工合成合成仪进行人工合成基因组文库基因组文库从生物体内用限制酶直接得到从生物体内用限制酶直接得到获获取取目目的的基基因因的的具具体体方方法法3.3.目的基因的获取目的基因的获取目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一一提取提取提取提取苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌抗虫基因抗虫基因？快速获得大量抗虫基因快速获得大量抗虫基因（3）利用PCR获取和扩增目的基因目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一PCRPCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR是是一一项项根根据据DNADNA半半保保留留复复制制的的原原理理，在在体体外外提提供供参参与与DNADNA复复制制的的各各种种组组分分与与反反应应条条件件，对对目目的的基基因因的的核核苷苷酸酸序序列列进进行行大大量复制的技术。量复制的技术。3.3.目的基因的获取目的基因的获取PCRPCR由由穆里斯穆里斯等人于等人于19851985年发明，为此，穆里斯于年发明，为此，穆里斯于1 1993993年获得诺贝尔化学奖年获得诺贝尔化学奖。PCRPCR技术技术：P PCRCR是是_ 的缩写，是一项根据的缩写，是一项根据_ _ _ 的原理，在的原理，在_ _ _提供参与提供参与DNADNA复制的复制的_ _与与_ _，对，对 _ _ _ _进行进行_ _的技术；的技术；聚合酶链式反应聚合酶链式反应DNADNA半保留复制半保留复制体外体外各种组分各种组分反应条件反应条件目的基因的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列大量复制大量复制全称全称聚合酶链式反应聚合酶链式反应DNADNA半保留复制半保留复制体外（体外（PCRPCR扩增仪扩增仪/PCR/PCR仪）仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因可以在短时间内大量扩增目的基因原理原理操作环境操作环境目的目的优点优点（3）利用PCR扩增目的基因目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一结合体内结合体内DNADNA复制过程，思考复制过程，思考PCRPCR的进行需要哪些条件？的进行需要哪些条件？PCR扩增仪扩增仪温故知新：回顾DNA的复制过程体内DNA复制过程解旋酶DNA聚合酶体内DNA复制需要模板、原料、引物、酶、能量等引物目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一DNA复制的方向复制的方向引物引物DNA母链母链DNA的复制方向的复制方向总是从总是从子链的子链的5端向端向3端端延伸延伸引物从模板链引物从模板链3 3端结合端结合DNA复制所需的基本条件:参与的组分参与的组分在在DNA复制中的作用复制中的作用 解旋酶解旋酶DNA母链母链4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNA聚合酶聚合酶引物引物提供提供DNA复制的模板复制的模板合成合成DNA子链的原料子链的原料打开打开DNA双链双链催化合成催化合成DNA子链子链使使DNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的（体外用耐高温的DNA聚合酶）聚合酶）（体外用高温代替）（体外用高温代替）（2种）种）引物是一小段能与_的一段碱基序列_的_DNA母链互补配对短单链核酸35DNA母链35DNA母链35引物35引物目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一（3）利用PCR扩增目的基因DNA双链解旋之后双链解旋之后DNA聚合酶无法直接聚合聚合酶无法直接聚合游游离的脱氧核苷酸，必须离的脱氧核苷酸，必须由引物提供由引物提供3端之后才端之后才能开始能开始连接脱氧核苷酸。由于连接脱氧核苷酸。由于DNA双链是反相双链是反相平行的，所以需要平行的，所以需要两种引物两种引物。复制原则复制原则:碱基互补配对原则碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）（保证复制的准确进行）引物引物设计引物的依据是：设计引物的依据是：_ _引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因是：，原因是：_ _使用的一对引物的序列相同吗？使用的一对引物的序列相同吗？_ _引物设计的要求（或引物失效的原因）引物设计的要求（或引物失效的原因）a._a._ b._ b._每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因 _两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因 _两种引物都结合在两种引物都结合在DNADNA模板链的模板链的_端端 脱氧核苷酸连接在引物的脱氧核苷酸连接在引物的_端进行延伸端进行延伸目的基因两端的核苷酸序列目的基因两端的核苷酸序列为了便于扩增的为了便于扩增的DNADNA片段与表达载体连接，需在引物的片段与表达载体连接，需在引物的5 5端加上限制酶的酶切位点端加上限制酶的酶切位点不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列*两种引物才能确保两种引物才能确保DNADNA的两条链同时被扩增的两条链同时被扩增3 3防止引物自身环化防止引物自身环化防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合3 3每种引物内部不能发生局部碱基互补配对每种引物内部不能发生局部碱基互补配对两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对35DNA母链35DNA母链35引物35引物引物长度不宜过短，防止引物随机结合目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）DNADNA模板模板引物引物（2 2种种）稳定的缓冲溶液稳定的缓冲溶液（一般添加（一般添加MgMg2+2+）四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)激活激活真核细胞和细真核细胞和细菌的菌的DNADNA聚合酶聚合酶基本过程变性复性延伸基本条件:（3）利用PCR扩增目的基因控制温度控制温度能量能量:热能，热能，dNTPdNTP水解释放的能量水解释放的能量检测方法检测方法完成后，常采用完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。来鉴定产物。(90(90以上）以上）(50(50左右）左右）(72(72左右）左右）（含目的基因）（含目的基因）3 35 53 35 53 35 53 35 5A.A.变性变性90以上以上，双链双链DNA解聚为单链解聚为单链B.B.复性复性50左右左右，两种两种引物引物与两条单链与两条单链DNA结合结合C.C.延伸延伸72左右左右，4种脱氧核种脱氧核苷酸苷酸在在Taq酶酶的作用下，的作用下，合成新的合成新的DNA链链3 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 5目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一基本过程（3）利用PCR扩增目的基因碱基互补配对原则碱基互补配对原则第一轮循环的第一轮循环的产物产物作作为第二轮反应的为第二轮反应的模板模板，经过经过变性、复性和延变性、复性和延伸伸三步产生第二轮循三步产生第二轮循环的产物；环的产物；第二轮循环的第二轮循环的产物产物作为第三作为第三轮反应的轮反应的模板模板，经过经过变性、复变性、复性和延伸性和延伸三步三步产生第三轮的产生第三轮的产物；产物；第二轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物第三轮的产物完成后，常完成后，常采用采用琼脂糖琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳来来鉴定鉴定PCRPCR的的产物产物目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一基本过程（3）利用PCR扩增目的基因PCR小结目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一受热变性受热变性引物引物 耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶(1)(1)过程：过程：（3 3）结结果果：1 1个个模模板板DNADNA分分子子经经过过n n轮轮PCRPCR，以以_方方式式扩扩增增，可可以以扩扩增增出出 个个DNADNA片段，共需要引物数量为片段，共需要引物数量为 个。个。指数指数2 2n n2 2n n1 12 2(2)DNA复制方向：复制方向：。5端3端观看视频，跟随视频画出前观看视频，跟随视频画出前三个循环的过程，并思考：三个循环的过程，并思考：u为了保证目的基因的完整为了保证目的基因的完整，在实际操作中，用于在实际操作中，用于PCR的模板往往会保留目的基的模板往往会保留目的基因前后的一小段序列，那因前后的一小段序列，那么几轮循环后会么几轮循环后会出现只有出现只有目的基因片段（等长）目的基因片段（等长）的的DNA分子？分子？目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一（3）利用PCR获取和扩增目的基因相关计算观看视频，跟随视频画出前观看视频，跟随视频画出前三个循环的过程，并思考：三个循环的过程，并思考：u为了保证目的基因的完整，为了保证目的基因的完整，在实际操作中，用于在实际操作中，用于PCR的模板往往会保留目的基的模板往往会保留目的基因前后的一小段序列，那因前后的一小段序列，那么几轮循环后会么几轮循环后会出现只有出现只有目的基因片段（等长）目的基因片段（等长）的的DNA分子？分子？三轮三轮目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一（3）利用PCR获取和扩增目的基因相关计算思维拓展思维拓展复制复制次数次数DNA分子分子总数总数0 011 12 23 3n n21=222=423=82n)复制复制n次后次后DNA总数总数:2n2）含）含母母链的链的DNA占总数的比例：占总数的比例：22 12-1=3）只只含含子子链的链的DNA占总数的比例：占总数的比例：亲亲代代DNA（2条链）条链）无论无论DNA复制多少次，含母链的复制多少次，含母链的DNA数永远是数永远是2第第1 1次复制次复制第第2 2次复制次复制第第3 3次复制次复制2-2 2思维拓展思维拓展复制复制次数次数脱氧核苷酸链脱氧核苷酸链总数总数0 021 12 23 3n n221=4222=8223=1622n=2n+1)复制复制n次后次后脱氧核苷酸链总脱氧核苷酸链总数数:2）新合成新合成的的脱氧核苷酸链数脱氧核苷酸链数：2n+1一个一个DNA分子中含有分子中含有2条脱氧核苷酸链条脱氧核苷酸链 亲亲代代DNA （2条链）条链）第第1 1次复制次复制第第2 2次复制次复制第第3 3次复制次复制2n+1-211个目的基因进行个目的基因进行PCRPCR扩增扩增,循环循环n n次，得到多次，得到多少个目的基因？含引物的少个目的基因？含引物的DNADNA分子分子有多少个？有多少个？11个个DNADNA分子进行分子进行PCRPCR扩扩增增,循环循环n n次，理论上至次，理论上至少需要多少个少需要多少个引物引物？2 2n n思维拓展思维拓展复制复制n n次，需要的引物数次，需要的引物数=新合成的脱氧核苷酸链数新合成的脱氧核苷酸链数找一找：复制找一找：复制n n次，次，含有引含有引物物的的脱氧核苷酸链脱氧核苷酸链有多少？有多少？2n+1-22n+1-2思维拓展思维拓展一个一个DNA分子复制分子复制n次，则次，则消耗的消耗的脱氧核苷酸数脱氧核苷酸数若亲代若亲代DNA分子含分子含有胞嘧啶有胞嘧啶脱氧核脱氧核苷酸苷酸m个，经过个，经过n次复制次复制需要消耗需要消耗胞嘧胞嘧啶啶脱氧核苷酸数脱氧核苷酸数:m（2n-1）第第n次复制次复制需胞嘧啶脱氧核苷酸需胞嘧啶脱氧核苷酸数数:m.2n-1 亲亲代代DNA（2条链）条链）第第1 1次复制次复制第第2 2次复制次复制第第3 3次复制次复制总的总的DNA数数 X m-亲代亲代DNA的的m（原本就有的）（原本就有的）碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶、引物模板、能量、酶、引物解旋酶解旋酶催化催化体外体外复制复制细胞内细胞内（主要在细胞核内）（主要在细胞核内）耐高温耐高温的的DNADNA聚合酶聚合酶解旋酶解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA在在高温高温下变性解旋下变性解旋大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子uPCR与DNA复制过程比较目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一（3）利用PCR扩增目的基因比较项目PCR细胞核内DNA复制场所试管中细胞内方式半保留全连续局部区域复制半保留半不连续全链复制起始位点引物3端复制起始位点酶仅一种DNA聚合酶（Taq酶）多种酶反应条件温度变幅大温和解旋高温解旋解旋酶解旋引物DNA片段，保留在复制的子链中RNA片段，不保留在复制的子链中产物引物界定的片段核基因组循环次数人为设置与细胞分裂同步联系模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）酶:均需DNA聚合酶引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成补充2.PCR技术与细胞内DNA复制的比较目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一1.下列有关体内DNA复制与PCR比较的叙述，正确的是A.二者合成子链的方向相同，均从5端3端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制不需要引物，PCR反应需要引物D.二者遵循的碱基互补配对方式相同，且均需要ATP提供能量学以致用 链接典例拓展3 35 53 35 53 35 53 35 5A.A.变性变性90以上以上，双链双链DNA解聚为单链解聚为单链B.B.复性复性50左右左右，两种两种引物引物与两条单链与两条单链DNA结合结合C.C.延伸延伸72左右左右，4种脱氧核种脱氧核苷酸苷酸在在Taq酶酶的作用下，的作用下，合成新的合成新的DNA链链3 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 5目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一基本过程（3）利用PCR扩增目的基因碱基互补配对原则碱基互补配对原则思维拓展思维拓展新合成的脱氧核苷酸链上都有引物，即每个新合成的脱氧核苷酸链上都有引物，即每个DNADNA都有引物都有引物找一找：找一找：复制复制n n次，次，含有引物含有引物的的脱氧核苷酸链脱氧核苷酸链有多少？有多少？复制复制n n次，含有引物的次，含有引物的DNADNA有多少？有多少？2n2n+1-2大本大本78 题 2小本小本141 题 13cd小本小本141 题 13cdef用用PCR可以可以扩增增mRNA吗？mRNAmRNA不可以直接扩增，需要将它不可以直接扩增，需要将它逆转录逆转录成成cDNAcDNA再进行扩增。再进行扩增。1.1.逆转录酶逆转录酶以以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补的互补的DNADNA链链，形成，形成RNA-DNARNA-DNA杂交杂交分子分子；2.2.核酸酶核酸酶H H降解降解RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链链，使之变成，使之变成单链单链DNADNA；3.3.以单链以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下合成另一条互补的的作用下合成另一条互补的DNADNA链，形链，形成成双链双链DNADNA分子分子，即，即cDNAcDNADNADNA片段的扩增及电泳鉴定探究探究实践实践实验原理实验原理（1）DNA 片段的扩增利用 PCR 可以在体外进行 DNA 片段的扩增。PCR 利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制 DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次 PCR一般要经历30次循环。（2）DNA 片段的电泳鉴定 DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关。凝胶中的 DNA 分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。加样孔电源琼脂糖凝胶电泳DNA片段的片段的电泳鉴定电泳鉴定材料用具材料用具（1）仪器（2）用具PCR PCR 仪、微量离心管、微量移仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）装置（包括电泳仪电泳槽等）4 4种脱氧核苷酸的等量混合液、种脱氧核苷酸的等量混合液、2 2种引物、种引物、DNA DNA 聚合酶、模板聚合酶、模板 DNA DNA、扩增缓冲液、无菌水、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等琼脂糖和核酸染料等PCR仪微量离心管微量移液器电泳装置方法步骤方法步骤（1）DNA片段的扩增用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方或PCRPCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分参照下表的参数，设置好PCRPCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCRPCR仪中进行反应。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）循环程序循环程序变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性94,5 min94,5 min/3030次次94,30s94,30s55,30s55,30s72,1min72,1min最后最后1 1次次94,1min94,1min55,30s55,30s72,1min72,1min10倍浓缩的扩增缓冲液倍浓缩的扩增缓冲液5L20mmol/L的的4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸的的等量等量混合液混合液1L20 mol/L的引物的引物I2.5L20 mol/L的引物的引物II2.5LH2O28-33L15U/L 的的 Taq DNA 聚合聚合酶酶12U模板模板DNA510L总体积总体积50L琼脂糖凝胶电泳的操作步骤配制琼脂糖溶液制备凝胶制备凝胶加样电泳观察记录DNADNA片段的扩增及电泳鉴定注意说明注意说明1 1.为避免外源DNADNA等因素的污染，PCRPCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。结果：片段相同的DNA分子会停留在相同的条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。1 2 3 4 5 6u1：Marker、标准大小的DNA分子u2：目的基因u3-5：不同循环次数的PCR产物u6：清水琼脂糖凝胶电泳目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一2 2至至5 5都为含目的基因的都为含目的基因的DNADNA片段片段,因为因为引物是引物是依据目的基因的核苷酸序列设计的，引物只依据目的基因的核苷酸序列设计的，引物只能和含目的基因的能和含目的基因的DNADNA片段结合，并在耐高温片段结合，并在耐高温的的DNADNA聚合酶的作用下延伸聚合酶的作用下延伸应用：在刑侦学中，只要能获取痕量DNA，就可以应用PCR技术，大量扩增，结合凝胶电泳，判断个体之间的亲缘关系。琼脂糖凝胶电泳目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用。构建基因表达载体（核心工作）基因表达载体由哪些部分组成二基因表达载体的构建基因表达载体的构建1.基因表达载体的目的（1 1）使目的基因在受体细胞中）使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，且，且可以遗传可以遗传给下一代；给下一代；（2 2）使目的基因能够使目的基因能够在受体细胞中在受体细胞中表达和发挥作用表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成位置：位置：功能：功能：RNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，位，驱动基因转录驱动基因转录出出mRNA，最终获得最终获得蛋白质蛋白质基因的上游基因的上游（一段有特殊结构（一段有特殊结构的的DNA片段）片段）紧挨转录的起点紧挨转录的起点能控制表达所需要的特殊性状。能控制表达所需要的特殊性状。位置：位置：功能：功能：基因的下游（一段基因的下游（一段特殊的特殊的DNA片断）片断）终止终止mRNA的转录的转录用来鉴别或筛选含有目的基因的细胞用来鉴别或筛选含有目的基因的细胞基因表达载体的构建基因表达载体的构建二DNA复制的起始位点复制的起始位点，DNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。=复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因注意：目的基因必须插入到注意：目的基因必须插入到 与与 之间。之间。启动子启动子 终止子终止子3.基因表达载体的构建过程基因表达载体构建模式图基因表达载体构建模式图载体载体（质粒）（质粒）DNADNA分子分子（含目的基因）（含目的基因）限制酶限制酶处理处理带有带有黏性末端或黏性末端或平末端平末端的切口的切口带有带有相同黏性末端或平相同黏性末端或平末端末端的目的基因片段的目的基因片段DNADNA连接酶连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种同一种二基因表达载体的构建基因表达载体的构建培育抗虫棉的简要过程培育抗虫棉的简要过程使用一种使用一种DNADNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？限制酶进行切割，共有几种连接情况？问题探讨载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连目的基因自连质粒自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接质粒与质粒连接正向连接正向连接 反向连接反向连接112212 2212211思考：1、启动子和终止子分别是转录的起点和终点吗？提示：不是。启动子是转录的起始信号，而非转录的起始位点；终止子是转录的终止信号，而非转录的终止位点。启动(终止)转录启动(终止)翻译作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三个相邻碱基本质启动(终止)子启始(终止)密码子2、完成下表结果：片段相同的DNA分子会停留在相同的条带，因此可以鉴别PCR的产物是否为目的基因。1 2 3 4 5 6u1：Marker、标准大小的DNA分子u2：目的基因u3-5：不同循环次数的PCR产物u6：清水琼脂糖凝胶电泳目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取一2 2至至5 5都为含目的基因的都为含目的基因的DNADNA片段片段,因为因为引物是引物是依据目的基因的核苷酸序列设计的，引物只依据目的基因的核苷酸序列设计的，引物只能和含目的基因的能和含目的基因的DNADNA片段结合，并在耐高温片段结合，并在耐高温的的DNADNA聚合酶的作用下延伸聚合酶的作用下延伸基因表达载体的构建复制复制原点原点标记基因标记基因KanRKanR启动子启动子多克隆位点终止子终止子XbaIXbaIHindIIIHindIIIBamHIBamHISmaISmaIpBI121pBI121表达载体表达载体HindIII HindIII 酶切酶切HindIIIHindIIIHindIIIHindIIIBamHIBamHICCCAAGCTTAAGCTTGGGTTCGAACCCCCTAGG BtBt基因基因GGATCCGGGTTCGAA核心步骤核心步骤HindIIIHindIIIHindIIIHindIIIBamHIBamHIAGCTTCCTAGG BtBt基因基因GGATCCATTCGAA同一种限制酶切CGATTAGCTTAAACGATTA G CTTA如何改进?DNADNA连接连接酶酶ACGACGATTTTAGCTTAAGCTTAABtBt基因基因ACGACGATTTTAGCTTAAGCTTAABtBt基因基因Bt基因Bt基因Bt基因Bt基因HindIIIHindIIIBamHIBamHIAGCTTBtBt基因基因ACCTAGG用两种限制酶切CGATTGATCCGADNADNA连接连接酶酶GCGATAGTTCCGATCCAAGCTTAGBt基因HindIIIHindIIIHindIIIHindIIIBamHIBamHICCCAAGCTTAAGCTTGGGTTCGAACCCCCTAGG BtBt基因基因GGATCCGGGTTCGAA原则：1.限制酶切位点不得破坏目的基因和载体上的各类有功能的基因2.用两种酶切割，可以避免目的基因自接，质粒自身环化，目的基因与质粒倒接3.用于切割目的基因和质粒的限制酶必须是同种酶复制复制原点原点标记基因标记基因KanRKanR启动子启动子多克隆位点终止子终止子XbaIXbaIHindIIIHindIIIBamHIBamHISmaISmaIpBI121pBI121表达载体表达载体小本小本137 题 9小本小本137 题 12大本大本73 体体验区区 题 1(2016(2016全全国国课课标标卷卷，40)40)某某一一质质粒粒载载体体如如图图所所示示，有有人人将将此此质质粒粒用用B BamamH H 酶酶切切后后，与与用用B BamamH H 酶酶切切获获得得的的目目的的基基因因混混合合，加加入入DNADNA连连接接酶酶进进行行连连接接反反应应，用用得得到到的的混混合合物物直直接接转转化化大大肠肠杆杆菌菌，结结果果大大肠肠杆杆菌菌有有的的未未被被转转化化，有有的的被被转转化化。被被转转化化的的大大肠肠杆杆菌菌有有三三种种，分分别别是是含含有有环环状状目目的的基基因因、含含有有质质粒粒载载体体、含含有有插插入入了了目目的的基基因因的的重重组组质质粒粒的大肠杆菌。回答下列问题：的大肠杆菌。回答下列问题：(1)(1)如如果果用用含含有有氨氨苄苄青青霉霉素素的的培培养养基基进进行行筛筛选选，在在上上述述四四种种大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞中中，未未被被转转化化的的和和仅仅含含环环状状目目的的基基因因的的细细胞胞是是不不能能区区分分的的，其其原原因因是是_ _ _ _ ；并并且且_ 和和_ _ 的的细细胞胞也也是是不不能能区区分分的的，其其原原因因是是_ _ _ 。在在上上述述筛筛选选的的基础上，若要筛选基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有还需使用含有_的固体培养基。的固体培养基。二者均不含有氨芐青霉素抗性二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有质粒载体含有目的基因的重组质粒含有目的基因的重组质粒 二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素四环素即含有重组质粒的大肠杆菌在其中不能生长，而含有普通质粒的大肠杆菌能生长将目将目的基的基因导因导入受入受体细体细胞的胞的方法方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入原核细胞农杆菌转化法农杆菌转化法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法CaCa2+2+处理处理法（感受态细胞法）法（感受态细胞法）（我国科学家独创（我国科学家独创)将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞三转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。（双子叶植物、裸子植物（双子叶植物、裸子植物)（叶肉细胞（叶肉细胞)（受精卵（受精卵)（大肠杆菌（大肠杆菌)基因枪法基因枪法（单子叶植物（单子叶植物)1.1.花粉管通道法花粉管通道法或或在植物受粉后一定时间内，在植物受粉后一定时间内，剪去剪去柱头柱头，将，将DNADNA溶溶液液滴在花柱切面滴在花柱切面，使，使目的基因通过目的基因通过花粉管通道花粉管通道进入胚囊。进入胚囊。用用微量注射器微量注射器将含将含目的基因的目的基因的DNADNA溶液直接注入溶液直接注入子房子房中；中；花粉管通道法导入外源花粉管通道法导入外源DNA将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞三（一（一)将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞是我国科学家是我国科学家周光宇周光宇在在1987年独创的。将年独创的。将重组重组DNA滴加到植滴加到植物受粉后形成的物受粉后形成的花粉管通道花粉管通道内，进入内，进入卵细胞、合子或早期胚胎卵细胞、合子或早期胚胎细胞细胞中。此方法中。此方法直接、简便且经济直接、简便且经济，已应用于水稻、小麦、棉，已应用于水稻、小麦、棉花、大豆等多种植物中。花、大豆等多种植物中。2.2.农杆菌转化法农杆菌转化法-双子叶植物、裸子植物双子叶植物、裸子植物目的基因插目的基因插入到农杆菌入到农杆菌TiTi质粒的质粒的T-T-DNADNA中中重组重组DNADNA转转入农杆入农杆菌菌农杆菌侵农杆菌侵入植物将入植物将目的基因目的基因带入植物带入植物细胞细胞 含外源目的含外源目的基因的重组基因的重组DNADNA整合到植整合到植物细胞的基物细胞的基因组中因组中目的基目的基因遗传因遗传特性稳特性稳定维持定维持和表达和表达农杆菌转化法步骤：农杆菌转化法步骤：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞三（一（一)将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞构建基因表达载体构建基因表达载体TiTi质粒质粒目的基因目的基因含目的基因的含目的基因的重组重组TiTi质粒质粒转入转入农杆菌农杆菌导入导入植物细胞植物细胞目的基因插入植物目的基因插入植物细胞染色体细胞染色体DNADNA中中植物细胞植物细胞植物组织培养植物组织培养表现出新性状的植株表现出新性状的植株总结：农杆菌转化法流程图总结：农杆菌转化法流程图 该过程经过该过程经过_次拼接、次拼接、_次导入次导入第一次拼接第一次拼接_第二次拼接第二次拼接_第一次导入第一次导入_第二次导入第二次导入_将目的基因拼接到将目的基因拼接到Ti质粒的质粒的T-DNA上上插入目的基因的插入目的基因的T-DNA拼接到受体细拼接到受体细胞染色体的胞染色体的DNA上（非人工操作）上（非人工操作）两两两两将含目的基因的将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌质粒重新导入农杆菌含目的基因的含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）导入受体细胞（非人工操作）2.2.农杆菌转化法农杆菌转化法-双子叶植物、裸子植物双子叶植物、裸子植物将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞三（一（一)将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞 基因枪法又称微弹轰击法，是基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力利用压缩气体产生的动力，将包，将包裹在金属颗粒表面的表达载体裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中打入受体细胞中，使目的基因，使目的基因与其整合并表达的方法。与其整合并表达的方法。3.3.基因枪法基因枪法适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞三（一（一)将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞基因枪法意图1.1.显微注射法显微注射法操作程序：操作程序：（为什么常选用受精卵作（为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？为受体细胞呢？)体积大，易操作。体积大，易操作。全能性高，易培全能性高，易培养成完整个体。养成完整个体。将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞三（二（二)将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞提纯提纯含目的基因表达载体含目的基因表达载体受精卵受精卵显微注射显微注射移植移植到输卵管或子宫到输卵管或子宫受精卵发育受精卵发