TMPyP4诱导细胞自噬研究.docx

TMPyP4诱导细胞自噬研究摘 要：目的：探究TMPyP4与肿瘤细胞自噬的关系以及其诱导自噬所影响的信号通路。方法：通过免疫印迹法和荧光观察检测TMPyP4对肿瘤细胞自噬相关蛋白表达和自噬小体形成的影响以及其所影响的信号通路。结果：TMPyP4处理肿瘤细胞后检测发现自噬标记蛋白LC3B水平明显上升，而自噬降解蛋白p62水平明显降低，并且经荧光检测发现自噬小体和自噬溶酶体增多；自噬上游抑制剂和下游抑制剂分别与TMPyP4联合处理肿瘤细胞得到TMPyP4能够诱导肿瘤细胞自噬流；通过检测TMPyP4对自噬相关基因的影响，发现P-AMPKa T172的水平明显上调，而AMPKa的含量下降，并且P-mTORS2448和mTOR表达下调。结论：以上结果表明TMPyP4能够诱导肿瘤细胞自噬，并且TMPyP4通过激活AMPK信号通路抑制mTOR诱导肿瘤细胞自噬。关键词：自噬；TMPyP4；Hep-2细胞；AMPKResearchonTMPyP4inducingCellsAutophagyAuthor:GuoManfeiTutor:HuangWeiwei(NorthwestA&FUniversity，Yangling，Shaanxi，712100)Abstract: Objective: to explore the relationship between TMPyP4 andautophagy of tumor cells and the signaling pathway affected by its induction of autophagy. Methods: the effects of TMPyP4 on the expression of autophagy related proteins and the formation of autophagosomes in tumor cells and the signaling pathways were detected by westernblotting and fluorescence observation. Results: the tumor cells to detect autophagy markerprotein LC3B level rise obviously，and autophagic degradationprotein p62 level significantly decrease，and cytolysosome and autophagy-lysosome increase by the fluorescence detection； TMPyP4 can induce autophagy flow in tumor cells through the combination of autophagy upstream inhibitor and downstream inhibitor with TMPyP4. By detecting the upstream mTOR signaling pathway of TMPyP4，it was found that the level of p-ampka T172 significantly up-regulates，the content of AMPK adecreases，and the expression of p-mtor S2448and mTOR down-regulates. Conclusion: the above results suggest that TMPyP4 can induce autophagy of tumor cells and generate autophagy flow. TMPyP4 inhibits mTOR induction of autophagy in tumor cells by activating the AMPK signaling pathway.Keywords: Autophagy；TMPyP4；Hep-2细胞；AMPK1目录第1章 绪论- 1 -1.1目的和意义- 1 -1.2细胞自噬研究现状- 2 -1.2.1 自噬类型- 2 -1.2.2细胞自噬过程- 3 -1.2.3自噬的分子调节通路- 3 -1.3自噬与肿瘤的关系- 4 -1.3.1自噬的肿瘤促进作用- 4 -1.3.2自噬对肿瘤的抑制作用- 5 -1.4 TMPyP4研究现状- 6 -1.4.1TMPyP4结构- 6 -1.4.2 G-四联体稳定剂- 7 -1.4.3 TMPyP4-PDT疗法- 8 -1.5技术路线- 8 -第2章 材料和方法- 9 -2.1材料- 9 -2.1.1细胞- 9 -2.1.2试剂- 9 -2.2方法- 9 -2.2.1药物处理- 9 -2.2.2Westernblot检测- 10 -2.2.3细胞转染- 10 -2.2.4 mcherry-LC3B稳转细胞构建- 10 -2.2.5自噬小体的荧光观察- 10 -第3章 结果分析- 11 -3.1TMPyP4诱导肿瘤细胞自噬- 11 -3.2TMPyP4诱导肿瘤细胞自噬流- 12 -3.3TMPyP4诱导细胞自噬依赖的信号途径是AMPK/mTOR- 13 -第4章 讨论与结论- 15 -参考文献- 17 -致谢- 19 -I第1章 绪论第1章 绪论1.1目的和意义自噬（autophagy）之所以在生物漫长的进化过程中能够一直保留下来，与其在细胞中发挥的作用是分不开的。自噬作用发生时，大量胞质内的大分子物质以及细胞器被包裹进胞质囊泡中被降解成小分子物质。这些降解产物可以经过三羧酸循环再一次被细胞重复吸收利用并为细胞生长提供能量。所以自噬不仅通过降解过量物质来缓解细胞代谢压力，同时代谢生成的小分子物质也可以再参与细胞结构的构建，极大地对胞内物质再利用。因此可以说自噬充当了细胞的自救机制，一方面保护细胞免受外界应激，也在一定程度上减小了细胞对外界营养物质的大量需求。自噬作用除在正常细胞中的生理作用外,还在癌症等病理过程中发挥重要作用,近年来人们已经逐渐意识到自噬在癌症发生发展中具有复杂的作用。一方面,自噬在胞内发挥其分解作用而对细胞进行保护;另一方面,肿瘤细胞利用自噬减轻细胞生存压力这一特性,来帮助自身生长(Song etal.2019) 。卟啉类衍生物是一类抗肿瘤治疗领域作用非常突出的药物分子。TMPyP4因其高水溶性，高透过细胞膜的渗透性和在肿瘤细胞中的优先积累而被认为是有前途的光敏剂（Villanueva etal.1994）。光敏剂作为PDT疗法中的关键介导，在PDT治疗中的作用是无可替代的（Benov etal.2015）。辐射性光敏剂经激光照射产生活性氧，诱导癌细胞死亡（坏死或凋亡）。PDT疗法应用在肿瘤治疗上给人们带来了极大的好处。过去的几十年时间里，PDT迅速发展，且潜力巨大，可以治疗多种类型的癌症，包括食道癌和非小细胞肺癌等各种肿瘤疾病。然而，获得具有高产率单线态氧和高精度靶向癌细胞的最佳光敏剂一直是一项挑战。除了可能在PDT中用作光敏剂外,最近还开发了TMPyP4作为化学治疗药物来抑制癌细胞中的端粒酶活性。G-四链体结构的存在能够很好地抑制端粒酶发挥作用，而TMPyP4则能作为G-四链体的配合物，进一步使G-四链体结构的稳定性得到提高;G-四链体结构的形成可以通过抑制端粒酶活性来有效抑制肿瘤细胞增殖。超过80%的癌细胞都是通过激活端粒酶来克服增殖极限进行无限增殖,端粒酶能够将因每次细胞分裂而缩短的端粒延长，使端粒不会因为细胞分裂而越来越短,因此癌细胞通过增强端粒酶活性保持其染色体中端粒的完整性进而可以无限增殖下去，这也是癌细胞可以无限传代的原因。积累的证据表明端粒的单链3'突出端可以通过Hoogsteen氢键堆叠成称为G-四链体的结构。TMPyP4能够缔合并稳定G-四链体,从而阻止端粒酶作用TMPyP4治疗导致端粒进行性缩短,最终导致癌细胞因凋亡或衰老而死亡(Zhang etal.2009)。Zhu等(2019)发现在用卟啉钠作为光敏剂进行PDT(DVDMS-PDT)疗法处理大肠癌细胞时发现：卟啉钠与PDT联合致使大肠癌细胞HCT116出现自噬现象。上述研究证明卟啉类光敏剂在和PDT共用处理肿瘤细胞时能够诱导自噬。但是TMPyP4单独处理肿瘤细胞能否会引起自噬,这还需要进一步研究探讨。基于细胞自噬在肿瘤治疗上的应用,研究TMPyP4抗肿瘤活性与细胞自噬的关系,以揭示TMPyP4抗肿瘤作用的分子机制,为后面TMPyP4在临床上治疗癌症奠定基础。1.2细胞自噬研究现状1.2.1 自噬类型细胞自噬(autophagy)发生是将胞液中的多余的物质包进原生质膜来源的自噬小泡中，自噬小泡携带着其中的大分子蛋白质、细胞器等物质进入溶酶体，溶酶体充分发挥其水解作用，自噬小泡携带的内含物经过消化变成小分子物质，这些小分子物质参与胞内的各种能量代谢途径，为细胞生长代谢提供能量，被细胞重新吸收利用。自噬的发生很大程度地缓解细胞的代谢压力，同时也让胞内的资源得到极大地再利用，可以说自噬是细胞进行自我保护必不可少的重要机制。根据细胞内自噬底物运送到溶酶体腔的通路不同,哺乳动物的自噬分为以下3种类型:微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侣介导的自噬(CMA)(Yan etal.2016)。微自噬是这三种自噬中最简单的一种，不形成自噬小泡，而是由溶酶体直接吞噬需要降解的物质并在溶酶体内进行水解消化。巨自噬则是这三种中最常见的一种，也是我们通常所说的自噬，包括包裹胞内溶于水的蛋白质和受损坏死的细胞器形成自噬小泡，自噬小泡不是来自于溶酶体，而是来源于原生质膜，之后自噬小泡携带着这些需要被降解的物质进入溶酶体，溶酶体发挥其强大的水解功能将这些物质消化。从发现自噬作用以来,它就一直被视为细胞的关键保护机制,尤其在应对细胞增殖和营养缺乏的条件下起重要作用。分子伴侣介导的自噬不同于微自噬和巨自噬,它可以选择降解胞内物质。这个过程需要分子伴侣HSC70识别并结合含有一串特定氨基酸序列的蛋白质,之后分子伴侣复合物与溶酶体膜上的转运受体结合进入溶酶体降解(Shankar etal.2011)。分子伴侣介导的自噬只消化胞内水溶性的蛋白质，不能将其他物质转运自噬。Cui 等人(2015)的研究发现正常细胞中自噬的降解功能使得自噬在细胞内环境的维持中扮演着重要角色。细胞处于营养丰富且氧气充足的条件下,自噬几乎不发生,也很难观察到，这种条件下自噬发生是为了维持细胞新陈代谢帮助消化。而当细胞处于环境因子的胁迫下，自噬水平会很快升高，迅速对环境做出适应，尽量维持细胞中的能量供应。由此可见，自噬是细胞的小”守护神“，不管细胞处于何种状态，它都努力维持着细胞正常状态，保护细胞不受外界环境伤害。因此可以说,自噬是大多数细胞做出的基于环境应激的适应反应。1.2.2细胞自噬过程自噬的发生主要有四个阶段：1.底物诱导自噬前体形成2.自噬小泡形成3.自噬小泡与溶酶体融合4.自噬小泡包裹的物质在溶酶体中的降解。自噬前体慢慢形成半球状凹陷，之后包裹着已经发生坏死或者无法执行正常生理功能的细胞器，自噬前体膜不断延伸扩展，将细胞器完全包裹形成一个圆球状的自噬小泡。自噬小泡膜上有与溶酶体结合的信号蛋白，当靶向运送至溶酶体时，可以与溶酶体发生融合，内容物得到消化。当促进自噬的上游通路被激活时,细胞质中的参与自噬小泡膜构建的物质被不断募集集中，在自噬相关基因（ATG）的表达产物介导下开始形成自噬小体的双层膜。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR与自噬能否启动密切相关，它是自噬发生的开关。mTOR是位于自噬上游的信号通路调节蛋白，当其表达产生mTOR1复合物时，自噬不能发生。但是，如果激活mTOR上游通路，使其受到负调控，那么自噬就可以发生。在自噬小泡形成过程中，自噬定位蛋白LC3由型转变为型定位在自噬小体膜上，并且在自噬小体膜上募集所需的物质，因此蛋白LC3可以作为自噬标记，通过检测其含量可知自噬发生水平的高低。自噬小体装配完成之前,p62蛋白也锚定在自噬小体膜上，促进自噬发生。p62是一种寡聚化蛋白质，这使得其能够保证自噬小体准确运送到溶酶体,而LC3在这个运送定位的过程中不起作用(Moreau etal.2011)。因此,p62也可用于检测自噬发生。最后，自噬小泡被定位蛋白准确运送至溶酶体,其表面信号分子与溶酶体膜上的受体相互识别结合,溶酶体将自噬小体吸收融合形成自噬溶酶体，其中携带的物质被溶酶体酶水解(Otomo etal.2013)。水解得到的产物如氨基酸等生物分子又被运回到细胞质中,被细胞重新吸收利用。1.2.3自噬的分子调节通路（1）哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路在调节自噬的各种途径中，mTOR信号通路作为自噬调节的开关，它的作用毋庸置疑。研究表明mTOR信号通路在调控细胞生长，维持细胞新陈代谢以及细胞死亡等细胞生理功能中都发挥非常重要的作用。mTOR属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族中的一员，分子量达到300000，其位于磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路（PI3K-PKB)的下游，它能结合多种不同的蛋白质，并形成两种不同的复合物:mTOR1和mTOR2（Yang etal.2015)。当细胞营养素和生长因子丰富时，mTOR1被激活并使关键的自噬相关蛋白磷酸化，导致自噬的抑制；相反，mTOR1受到抑制时，即在能量、氨基酸等营养物质缺乏期间发生，诱导自噬。磷脂酰肌醇-3-激酶途径是mTOR信号通路的上游通路，调控着自噬发生（Luetal.2015），在细胞增殖的调控方面作用显著，但有关mTOR2在自噬中发挥的作用还未有相关研究结论。AMP活化的蛋白激酶调节mTOR1，通过细胞应激或降低细胞ATP水平来刺激AMP活化的蛋白激酶抑制mTOR1，mTOR1受到抑制可以阻止其下游信号分子特异性磷酸化抑制，自噬被激活。mTOR1的调节显示了AMP活化的蛋白激酶在自噬起始中的关键作用（Sridharan etal.2011）。（2）RAS(ratsarcoma)信号通路RAS蛋白质家族由参与控制细胞生长和存活的鸟苷三磷酸酶组成。RAS蛋白在细胞中的信号转导经由两种细胞信号转导通路进行自噬调节。RAS的激活使得磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-PKB)通路受到的刺激增加，导致mTOR1表达上调，抑制自噬相关基因表达。反过来，RAS激活也会导致促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)途径的刺激增加从而上调自噬水平（Schmukleretal.2000）。（3）MAPK信号通路MAPK/应激活化蛋白激酶信号通路是调节细胞自噬的重要信号通路。MAPK属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族，它参与了细胞内生长调节，在生长因子信号转导上发挥的作用对细胞来说非常必要。由MAPK激活的应激活化蛋白激酶进行信号转导导致关键转录因子激活，同样也对抗凋亡基因如B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的表达进行调控。研究已显示Bcl-2与Beclin-1结合可导致自噬的抑制（Limetal.2019）。现已证明，当MAPK/ERK信号通路受到刺激时，在HT-29结肠癌细胞中能够检测到自噬现象出现，这进一步说明MAPK通路与自噬之间的密不可分的联系（Ogier-Denisetal.2000）。1.3自噬与肿瘤的关系1.3.1自噬的肿瘤促进作用自噬是各种细胞面对外界应激做出的保护应对，细胞通过自噬能够在环境变化时稳态生长，所以它可能帮助各种癌症细胞免于应激刺激而存活。与正常细胞相比，自噬的上调使癌症细胞拥有更强的适应外界应激的能力，这在一定程度上有助于癌细胞增殖，从而帮助肿瘤细胞迁移以及侵袭其他组织细胞，并且增强了肿瘤细胞对治疗的抗药性。动物实验也显示通过自噬抑制携带胰腺癌异种移植物的小鼠存活时间延长。针对多种人类恶性肿瘤发生突变的RAS基因，研究发现即使存在丰富的营养物质，在H-ras或K-ras活化突变的人类癌细胞系中也具有高基础自噬水平（Guo etal.2011）在这些细胞中，抑制基础自噬相关的蛋白会显著抑制细胞生长，表明自噬可维持肿瘤细胞存活。因此，抑制肿瘤中的自噬作用，可能是一种有效抑制肿瘤细胞的新疗法。自噬对肿瘤细胞的促进作用也体现在自噬帮助肿瘤细胞从抗肿瘤药物中“逃逸”，使肿瘤细胞抵抗这些药物的能力增强。肿瘤细胞在增殖的过程中,生长分裂速度与正常细胞相比大大增加，所需要的营养也比体内正常细胞需求量更大，但是它所在的内环境却不能将所有的营养都提供给其生长,再加上新形成的肿瘤组织中还未形成足够的血管为其运输营养，肿瘤自然会通过别的途径维持细胞生长，比如增加自噬水平，这在实体性肿瘤中比较明显。肿瘤细胞没有充足的营养和适当的氧气时，就会处于能量短缺状态。这时,AMPK被信号分子磷酸化,处于激活状态的AMPK接着磷酸化mTOR的上游调控分子TSC2使TSC2处于激活状态,处于激活状态TSC2对mTORC1进行负调控(Raoetal.2019),自噬通路得到激活。当细胞处于氧气不足的状态时,肿瘤细胞的呼吸方式以无氧呼吸为主,这导致了大量的ROS的产生,ROS能够进一步破坏细胞内环境，加剧细胞内环境恶化，这使得自噬发生水平进一步升高(Jung etal.2010)。在肿瘤不断生长的过程中,肿瘤细胞通过自噬应对外界压力，最大程度保护细胞使其不受或者受到的伤害微乎其微，以便更好生长。自噬对肿瘤细胞生长的促进作用表现在两方面：一是,自噬的清除降解作用产生的小分子物质为肿瘤细胞提供营养物质,帮助肿瘤细胞扩散迁移;另外,当肿瘤细胞发生过度自噬时细胞死亡，在机体内细胞死亡会导致组织发生炎症,这使得血管进入肿瘤组织成为可能,肿瘤细胞得以从血管中吸收营养物质。因此,自噬在一定程度上促进肿瘤细胞生长。1.3.2自噬对肿瘤的抑制作用细胞在致癌因子,如生物病毒、紫外线、黄曲毒素等的影响下,细胞基因发生突变，细胞器发生损伤甚至坏死,这些剧烈变化使得细胞难以进行正常的生理活动，甚至会导致细胞死亡。由于细胞中正常的生命活动无法继续下去，细胞中产生并堆积了大量细胞毒素以及无用废弃物,细胞快速感知环境变化并立即启动自噬应对，避免受到更大的伤害。肿瘤细胞产生很大原因是因为受到致癌因子影响导致基因累计突变，而自噬能够帮助细胞应对这种剧烈变化，避免细胞向肿瘤细胞过渡。一旦自噬异常,很可能导致肿瘤细胞在体内增长。在肿瘤的治疗中，人们既发现，当自噬水平降低时，肿瘤细胞对药物的耐受明显降低。因此，通过抑制自噬降低肿瘤细胞耐药性成为治疗癌症的新策略。人们开始把目光转到自噬抑制剂上，研究能够明显阻断细胞自噬的药物。因mTOR对自噬的负调控作用，人们对mTOR在肿瘤治疗应用上充满期待。研究发现，哺乳动物中mTOR在自噬信号调节上扮演着十分重要的角色，通过多条信号通路影响着肿瘤细胞生长。雷帕霉素能够靶向结合mTOR，并且抑制mTOR正常功能，其衍生物替西罗莫斯与雷帕霉素具有同样的功能，它们都能显著上调自噬表达水平。同样也有人在研究中发现，当治疗某些癌症时，自噬发挥着相反的作用，在肿瘤治疗过程中自噬的发生导致治疗效果良好，也就是说自噬能够杀死肿瘤细胞治疗癌症。研究发现，当进行雷帕霉素处理恶性肿瘤细胞（如乳腺癌）的实验时发现，部分肿瘤细胞出现死亡现象，且这部分细胞是因为发生自噬而导致的死亡。2014年He等的相关研究表明，用二苯基丙烯酮(Chalcone)衍生物Chal-24处理肿瘤细胞常会导致肿瘤细胞发生自噬，并且发生自噬的肿瘤细胞最后发生细胞凋亡。Chal-24作为查尔酮的衍生物，其在肿瘤治疗上的作用也与查尔酮旗鼓相当。Chal-24通过激活Beclin-1通路诱导自噬发生。Beclin-1作为自噬调节基因的重要成员，参与形成能够激活自噬的磷脂酰肌醇-3-激酶复合物。急性早幼粒白血病起因是造血组织中白细胞不受限制增长，而导致正常细胞无法行使功能的恶性疾病。关于其病因形成，我们还未可知。而现在比较有用的治疗手段是利用三氧化二砷，而且有研究表明当它与全反式视黄酸联合治疗时该恶性疾病的治愈率有了很大程度的提高。目前已知三氧化二砷介导的细胞凋亡部分是由于通过上调Beclin-1进而介导自噬发生。但诱导自噬抑制肿瘤发展的机制尚不完全清楚，推测可能是由于细胞特意将将胞浆内阻碍细胞生长的毒害物质从细胞中排出中，这些物质在一定程度上引起了周围组织发生免疫炎症，同样也对周围组织造成伤害，导致遗传不稳定，致癌DNA突变率更高，最终导致更恶性的基因表型；也可能是由于自噬过程中相关基因的调节抑制了肿瘤细胞的增殖；或者自噬可以杀死发育中的肿瘤细胞。1.4 TMPyP4研究现状1.4.1TMPyP4结构图1-1 TMPyP41. 四甲基吡啶卟啉（TMPyP4）是一种四价阳离子卟啉衍生物，在肿瘤治疗上效果明显。Mikami-Terao等（2009）进行体外研究TMPyP4治疗眼癌的作用机制时发现，TMPyP4不仅可以作为光敏剂，同时还可以作为G-四联体稳定剂，可通过多种不同的途径阻止肿瘤细胞生长。TMPyP4对光敏感，当有激光存在时可发生光敏反应，杀死肿瘤细胞。当它结合人类端粒形成的四链体结构，可以与G-四联体共同发挥作用抑制端粒酶活性，使得肿瘤细胞无法无限增殖。因此，我们可以根据G-四联体的这个特点将其应用到肿瘤细胞的治疗上，阻碍肿瘤细胞生长。1.4.2 G-四联体稳定剂2. 端粒的单链3'突出端可以通过Hoogsteen氢键堆叠成称为G-四链体的结构。TMPyP4能够缔合并稳定G-四链体，从而阻止端粒酶作用TMPyP4治疗导致端粒进行性缩短，最终导致癌细胞因凋亡或衰老而死亡。大约85的癌细胞通过激活端粒酶来克服增殖极限，端粒酶的主要作用是延长端粒DNA，它由RNA和蛋白质组成，通过逆转录得到DNA序列，端粒因此能够不因细胞分裂次数增加而逐渐缩短，染色体的完整性得以保存（Fujimori etal.2011）。G- 四联体（G4-DNA）（图1-2）是一种特殊的由四条链组成的核酸结构，其中含有大量的鸟嘌呤，通过Hoogsteen氢键结合形成正方形平面结构，而两个或更多个鸟嘌呤的正方形平面结构与阳离子配位，通过-键堆叠在一起形成G-四联体结构。它们可以由DNA，RNA，LNA和PNA组成，也可以是单分子，双分子或四分子结构，存在于许多真核细胞的基因组中，其中端粒启动子区域比较常见，是近年来发展形成的抗癌药物的重要靶点（Zhang etal.2009）。G-四联体与一些关键的生物过程、多种人类遗传疾病和癌症有着密切的联系。所以，研制能够诱导和稳定G-四联体结构的抗癌新药，抑制端粒酶活性阻止癌细胞生长成为人们的迫切需要。图1-2 G-四联体1.4.3 TMPyP4-PDT疗法光动力疗法又称光化学反应，是近些年来新发展起来的一种治疗肿瘤的方法，在其被发现以后，发展十分迅速，目前已经应用在临床治疗上。其具体过程是通过各种途径将光敏剂注入人体内发生病变的部位，它可以选择性在病变部位聚集，一段时间过后，病变细胞内堆积的光敏剂会被特定波长的激光激活，这使得胞内活性氧分子的浓度大大升高，胞内活性氧浓度达到一定浓度后，会对细胞产生毒害作用，甚至杀死细胞。在细胞应对活性氧的同时，因细胞受到活性氧的细胞毒作用，细胞内产生了参与调节机体免疫反应的物质，这些物质通过调动机体免疫系统执行清除降解功能，进而抑制肿瘤细胞生长。AertsI等人在2010年的对肿瘤细胞进行的体外实验研究得到结论：PDT处理肿瘤时肿瘤细胞出现大概率死亡。与传统的抗癌疗法相比，PDT的侵袭性较小，具有更好的耐受性和良好的治疗结果。除了上述优点外，PDT与其他癌症治疗方法包括放疗、化疗比起来优势无可置疑：靶向性高，效果明显，能够在同一部位多次重复使用并且治愈率高（Wilson etal.2008）。在过去的几十年中，PDT迅速发展，具有巨大潜力，可以治疗多种类型的癌症，包括食道癌和非小细胞肺癌。光敏剂在PDT治疗中处于主体地位，好的光敏剂参与PDT治疗，是事半功倍。然而，获得具有高产率单线态氧（1O2）和高精度靶向癌细胞的最佳光敏剂一直是一项挑战（Benov etal.2015）。近年来，研究报道TMPyP4自身也具有较好的抗肿瘤功效。TMPyP4对包括肺癌（Chiang etal.2018）、宫颈癌（Chiang etal.2019）等在内的多种肿瘤细胞具有非常明显的抑制作用。2016年Zheng等人的研究发现，不同浓度的TMPyP4单独处理人肺癌细胞时，低剂量的TMPyP4促进肿瘤细胞迁移；而高剂量的TMPyP4则使大部分肿瘤细胞死亡。1.5技术路线图1-3 技术路线- 7 -第2章 材料和方法第2章 材料和方法2.1材料2.1.1细胞293T，Hep-2细胞购于国家实验细胞资源共享服务平台(北京总部)，培养细胞时均用添加10%胎牛血清（FBS）和100U/mL青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基置于37，5%CO2恒温培养箱中培养。2.1.2试剂表2-1 实验中所用试剂试剂来源氯喹（Chloroquine DdiphosphateSalt（CQ），C6628）SigmaTMPyP4（A5014）梯希爱(上海)化成工业发展有限公司siRNA上海吉玛制药技术有限公司Lipofectamine2000（11668）InvitrogenRIPA裂解液（P0013B）碧云天生物技术公司-actin抗体（AF003）碧云天生物技术公司PARP抗体（AP102）碧云天生物技术公司LY294002（S1737）碧云天生物技术公司LC3抗体（12741）CSTAMPK抗体(5Phospho-AMPK(Thr172)抗体(2870)CSTmTOR抗体(2983)CSTPhospho-mTOR(Ser2448)抗体(5536)CSTSQSTM1/P62抗体（sc-28359）蛋白酶抑制剂（CW22009）北京康维世纪生物技术有限公司HRP标记羊抗鼠（CW0102）北京康维世纪生物技术有限公司羊抗兔二抗（CW0103M）北京康维世纪生物技术有限公司BCA蛋白定量试剂盒（CW0014S）北京康维世纪生物技术有限公司2.2方法2.2.1药物处理取生长状态良好的对数期Hep-2细胞，经胰酶消化后接种到6孔板中。过夜培养后，分别加入不同浓度的TMPyP4（0µM、25µM、50µM、100µM）进行处理。处理48h后收集细胞样品用于检测其中自噬标记蛋白。对于转染细胞，在转染siRNA24h后，加入50µM TMPyP4处理24h，然后收集细胞样品进行自噬相关基因表达检测。药物处理均以DMSO作为阴性对照。2.2.2Westernblot检测将经TMPyP4处理的喉癌细胞用胰酶消化以后进行离心收集，再用适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解接着超声破碎，提取细胞总蛋白。利用BCA蛋白定量试剂盒测定样品总蛋白浓度，将不同处理组的蛋白浓度调整一致，按照比例加入5 x SDS上样缓冲液，混匀后沸水浴5min变性蛋白。根据检测蛋白质分子量大小，选择8%15%的SDS-PAGE凝胶进行电泳。电泳结束后用湿转法将检测的蛋白质转至硝酸纤维素膜。已经成功转上蛋白的NC膜分别经含5%的脱脂奶粉溶液在室温下封闭1h，一抗4孵育过夜，二抗室温孵育1h，最后用ECL发光液对蛋白进行显影，以-actin作为实验内参。2.2.3细胞转染取生长状态良好的对数期Hep-2细胞，经胰酶消化后接种到6孔板中，过夜培养。将6孔板中的培养液更换为Opti-MEM培养基，分别取5µl Lipofectamine2000和100pmol siRNA（NC：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；AMPKa：GAGGAGAGCUAUUUGAUUA）稀释于100ul的Opti-MEM培养基中，静置5min后将两种稀释液混合，再静置5min后将混合物加入6孔板中，轻轻混匀后置于培养箱中培养，6h后将培养基更换为正常培养液。2.2.4 mcherry-LC3B稳转细胞构建将生长状态良好的293T细胞接种到60mm细胞培养皿中，隔夜培养后，利用脂质体Lipofectamine2000按照使用说明将mcherry-LC3B融合基因表达质粒和慢病毒包装质粒共同转入293T细胞。转染48h以后，将收集得到的细胞培养液过滤，滤器直径0.45um，并将成功转入质粒的细胞培养液与添加有1%胎牛血清的DMEM培养基等量混合，加入到Hep-2细胞贴壁生长的培养皿中进行侵染。侵染48h后，将细胞培养基更换为嘌呤霉素含量为1ug/mL的DMEM培养基，并对侵染的细胞进进行筛选。连续筛选1w后，对存活的Hep-2细胞扩大培养并进行荧光观察鉴定。2.2.5自噬小体的荧光观察将能稳定表达mCherry-LC3B融合基因的Hep-2细胞按1×105个细胞/皿的比例接种放有无菌盖玻片的35mm细胞培养皿中培养。观察到细胞贴壁之后，加入50mM TMPyP4处理细胞，以DMSO作为阴性对照。药物处理2天后，取出细胞爬片，倒扣于载玻片上，置于BX51+DP70荧光显微镜(Olympus)下进行观察拍照1材料。- 11 -第3章 结果分析- 21 -第3章 结果分析3.1 TMPyP4诱导肿瘤细胞自噬大量的研究证实，人类多种肿瘤细胞的发生与自噬异常关系密切。而TMPyP4在抗肿瘤方面发挥的作用越来越多，研究表明一定剂量的TMPyP4可诱导癌细胞死亡，在这个过程中，TmPyP4能否引起细胞自噬以及其影响的分子通路还尚不清楚。为了探究这一问题，本课题初步研究了TMPyP4对肿瘤细胞自噬的影响。首先，以喉癌细胞Hep-2为研究对象，检测TMPyP4处理过的细胞中两种自噬标记蛋白LC3B和p62的含量变化。用不同浓度（0M、25M、50M、100M）的TMPyP4对上述喉癌细胞进行处理，结果发现标记蛋白LC3B的水平升高，而p62的蛋白水平降低，并且随着TMPyP4的浓度增加，LC3B的水平逐渐升高，p62蛋白水平则随TMPyP4浓度升高而降低。同样，用固定浓度（50M）的TMPyP4对喉癌细胞进行不同时长（0h、6h、12h、24h、48h）的处理发现，处理时间越长，LC3随着处理时间的增加其在细胞中的含量增加，p62的含量却越来越少（图3A）。LC3是自噬小体膜上的聚集蛋白，自噬形成的过程中，它在胞浆中由LC-3I型转换成LC-3II型，在自噬小体形成和募集降解物质中发挥着关键作用。p62在自噬过程中作为将要被降解的自噬小泡的受体，从而靶向自噬小泡到溶酶体进行融合分解，因此在自噬过程中p62的水平降低。TMPyP4处理过的喉癌细胞中LC3水平升高和p62水平降低，由此我们可以推测，TMPyP4可能引起细胞自噬。为了进一步检测TMPyP4对自噬的影响，利用能够稳定表达mcherry-LC3B融合蛋白的基因转染Hep-2细胞，通过mcherry蛋白显示红色荧光确定自噬过程中自噬小体和自噬溶酶体的变化情况。用50nM TMPyP4处理mcherry-LC3B稳转Hep-2细胞爬片，利用荧光显微镜观察自噬小体和自噬溶酶体含量变化。结果发现，与阴性DMSO对照相比，TMPyP4处理过的细胞中红色荧光斑点数量明显增加且亮度明显增强（图3C），表明TMPyP4能够导致自噬小体和自噬溶酶体数量增加。上述结果说明TMPyP4可能诱导肿瘤细胞自噬。图3-1 TMPyP4对Hep-2细胞自噬的影响3.2 TMPyP4诱导肿瘤细胞自噬流通过对两种自噬标记蛋白进行免疫印迹检测，得到的结果是：经过TMPyP4处理的细胞自噬募集蛋白LC3B的水平升高，而自噬降解蛋白LC3B的水平下降，这说明TMPyP4可能引起细胞自噬。细胞自噬是一个动态流动的过程，主要由以下几个步骤组成，即自噬启动、自噬小体形成，以及自噬小体与溶酶体融合，最终降解自噬小体中的内含物。TMPyP4处理细胞后导致自噬小体和自噬溶酶体水平升高，猜测可能是由于TMPyP4对细胞自噬的促进作用导致自噬小体和自噬溶酶体水平升高，也可能是TMPyP4抑制自噬小体和自噬溶酶体降解导致在细胞中积累水平升高。为了探究TMPyP4对细胞自噬流的影响，用不同的自噬抑制剂和TMPyP4共同处理细胞来检测TMPyP4对细胞的影响。LY294002是一种能够阻断三磷酸酰肌醇蛋白激酶(Phosphotidylinsitol-3-Kinase)细胞信号传导通路的蛋白激酶抑制剂，能够抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路，可以作为自噬流过程的上游抑制剂。如图4A所示，用LY294002和TMPyP4共同处理过的细胞与其单独处理相比，细胞中LC3B和p62的水平都降低，说明LY294002抑制TMPyP4诱导的LC3B水平升高。同样利用自噬下游抑制剂CQ对肿瘤细胞进行处理检测TMPyP4对细胞的影响。CQ是一种亲溶酶体剂，能够提高溶酶体中的pH，导致溶酶体酶的活性受到抑制，从而不能降解自噬小体中的内含物。结果显示，共同处理的组中LC3B和p62的水平高于单独处理组（如图4B），这是因为CQ抑制自噬溶酶体降解导致两种自噬标记蛋白积累。通过LY294002抑制TMPyP4诱导的LC3B水平升高和CQ促进TMPyP4诱导的LC3B水平升高，我们可以知道TMPyP4诱导Hep-2细胞自噬流。图3-2 TMPyP4对细胞自噬流影响3.3 TMPyP4信号通路，抑制mTOR来诱导细胞发生自噬依赖的信号途径是AMPK/mTOR以上结果表明TMPyP4能够诱导细胞自噬以及细胞自噬流产生，但它是通过什么信号通路我们还不了解，因此需要进行进一步研究确定其影响的分子通路。在调节自噬的各种途径中，mTOR信号通路是非常重要的一个环节。当细胞营养素和生长因子丰富时，mTOR1被激活并抑制关键的自噬相关蛋白基因表达，从而阻止自噬发生；相反，mTOR1受到抑制时，即在能量、氨基酸等营养物质缺乏期间发生，自噬过程发生。在营养缺乏的条件下，AMP/ATP比值升高，AMPK磷酸化水平增加，AMPK被激活，磷酸化TSC2Ser1387位点使其TSC2活化（WOLFF etal.2011），同时抑制Raptor Ser792位点的磷酸化，从而使mTOR的Ser2448位点磷酸化水平降低.根据TMPyP4处理细胞检测其对自噬相关基因的影响，发现TMPyP4处理的Hep-2细胞中P-AMPKaT172的水平明显上调，AMPKa的含量下降并且P-mTORS2448和mTOR表达下调（见图3A），这些结果表明，TMPyP4可能通过激活AMPK信号通路下调mTOR表达来引发自噬。为了进一步证实这个猜想，利用siRNA沉默AMPK基因表达检测TMPyP4对AMPK信号通路的影响，结果显示，当沉默AMPK基因表达时LC3B的胞内水平下降（图3B），说明AMPK活化能够促进TMPyP4诱导细胞自噬。图3-3 TMPyP4对AMPK信号通路影第4章 讨论与结论第4章 讨论与结论自噬除在正常细胞中帮