中草药添加对大黄鱼不同组织间GR基因表达的比较.docx

摘 要谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase）是一种极其重要的抗氧化酶，其在生物体的抗氧化系统中起着很关键的作用。为了研究中草药对GR基因表达的影响，本次实验以大黄鱼(Pseudosciaena crocea )为研究对象，通过在基础饲料中添加不同剂量的复方中草药，采用实时荧光定量PCR技术比较不同组织中该基因的表达特点。结果显示，与对照组相比，每一组实验组的谷胱甘肽还原酶的基因表达量都出现不同程度的下降，但每组之间无显著性差异（P>0.05）。研究结果为中草药作为诱饵添加剂在大黄鱼饲料中的应用提供了基础数据，也为中草药作为鱼类免疫增强剂提供了初步的研究依据。关键词：中草药；大黄鱼；谷胱甘肽还原酶；基因表达；Abstract Glutathione restorassis is a very important antioxidant enzyme that plays a key role in the body's antioxidant system. In order to study the effect of herbal medicine on gr gene expression, this experiment was based on large yellow pseudomonks. By adding different doses of the compound of herbal medicine to the main feed, gene expression in different tissues has been compared with the use of real-time fluorescence of quantitative PCR technique. Characteristics. The results showed that the expression of the glutathione gene in each experimental group decreased to varying degrees compared to the control group, but the difference between the groups was not statistically significant (P 0.05). The results provide basic evidence for the application of Chinese herbal medicine as bait supplements in the feed of large yellow fish, and provide a preliminary research base for Chinese herbal medicine as an immune booster for fish.Key words: compound Chinese herbal medicine；Pseudosciaena crocea；glutathione reductase； gene expression；目 录1 前 言12材料和方法32.1 材料、药品及仪器32.1.1 原料鱼处理32.1.2 试剂32.2 方法42.2.1 总RNA提取42.2.2 RNA凝胶电泳42.2.3 RNA定量分析42.2.4 RNA反转录42.2.5TB Green实时荧光定量PCR53 实验结果与分析63.1总RNA纯度及完整性分析63.2 熔解曲线分析63.3谷胱甘肽还原酶的基因表达水平74讨 论84.1中草药的特性与应用84.2中草药的作用机理84.3目的和意义94.4总结9致 谢10参考文献10中草药添加对大黄鱼不同组织间GR基因表达的比较1 前 言大黄鱼，外文名Larimichthys crocea，它是石首鱼科（Sciaeni-dae）有名的经济水产鱼类，它有很多别名最常见的我们叫它大黄花鱼也叫黄瓜鱼，我们中国的知名海产鱼有乌贼、带鱼、小黄鱼大黄鱼就是其中之一，它是我们福建省有名的特色经济鱼类。大黄鱼是温水中群游的鱼类，是我们中国特有的地方性海鱼，它的活动地大多是在福建、浙江沿海等，在我们福建渔业乃之全国内的渔业经济中都是举足亲重的。近年出现的大黄鱼大规模养殖，品质数量的提高，都是由于国民的喜爱与需求的增加还有大规模的出口量。我们把大黄鱼作为新鲜海食的佳品是因为它经济实惠，口感细嫩，而且富含人体必须的蛋白质，它的做法多种，我们能将它制成长期保存的黄鱼罐头以及鱼粉、鱼丸、鱼干等可综合利用。大黄鱼还可以为工业化产业提供高档胶合剂的原料。大黄鱼的药用价值体现在它可以为部分中药提供一定的原料。大黄鱼不仅口感细嫩，而且体内营养物质丰富为人体代谢、延缓衰老、提高免疫力都提供了大量的抗性成分1-3。中草药是我们平时经常用到的药效草药，它主要取自于植物的根部、茎杆、叶脉、果实还有动物的骨骼、内脏等还有一些矿物成分。由于所取的占比不同，植物药占比较高，所以我们也称呼它叫中草药。我们国家早已在古代时期就有在饲料中尝试中草药应用。我国从古代研究和探索中草药至今已发现了过万种的药用植物，这也为我们今后的发展和研究奠定了坚实的基础，为我们以后的应用与研究提供了压倒性的优势4-5。中草药比一些人工添加化学类药品更简单实用而且对受体的伤害也较低，能使个体吸收完全不浪费，也不会对环境产生影响，这些都完美的体现了它作为天然植物的特点6。通过现有药学的研究和发现，我们可以从中草药中多种免疫活性物质来研究对其它组织细胞活性的影响，发挥出它对各种免疫系统的作用，使之相互平衡。据调查中草药饲喂家畜以及水产动物都多有研究，本实验研究复方中草药饲喂大黄鱼，检测对大黄鱼生长中存在的特性以及对大黄鱼免疫系统的基因影响。为大黄鱼和中草药的研究都提供了一个新的方向，让我们更全面的去认识和研究，总结出新的报告。而太子参作为中草药的是实用性代表，太子参具有的大量微量元素能够为人体一些疾病提供良好的治疗，比如它能在炎热的夏天作为清淡饮食健脾益气、消暑生津，在保健养生方面也多有建树多用于治疗阴虚体乏、虚寒体弱、舌干口燥等。在解决改善人体缺血、糖尿病以及记忆力下降等方面，太子参成分中的各种苷类、糖类、油脂类都能起到关键性的作用。由于太子参的众多药用价值被逐渐研究发现，它也终于撕下了被人们贴下假货的标签，成功跻身为中草药行列中的上品药材。应用中太子参的药理作用：（1）抗应激能力和抗疲劳的作用，在姚勇7等的研究显示在为虾喂食含太子参的饲料时虾的抗应激能力投有了明显的增强，具体表现在承受氧能力的增加。秦汝兰8实验将小老鼠放入水中游泳对比身上加了重物的小老鼠放入水中游泳，长时间后发现负重的老鼠依然有体力，说明通过提取太子参粗多糖注射给小老鼠提高了小老鼠的抗疲劳能力，而且注射量越大效果越明显。（2）降血糖降血脂作用，夏伦祝9等的实验研究不仅证实了太子参降血糖降血脂作用，还通过对心血管病、糖尿病研究发现太子参多糖能够改善人体脂质代谢紊乱的问题。（3）袁逸铭10等的实验证实，用太子参醇提物对实验的老鼠注射，通过一段时间的养育观察发现活着的老鼠肾组织中丙二醛(MDA)有明显下降，而氧化作用是因为检测到谷胱甘肽酶的各种活力有了一定的提升，说明太子参醇提物有抗氧化作用。张振明11等的另外一个研究证明了太子参醇提物能促使实验鼠内脏中MDA的生成，所以说明太子参醇提物有抗氧化作用。太子参还具有修复记忆影像、改善肾小球硬化等多种能力。因此依据资料证实太子参作为饲料添加剂在对大黄鱼的养殖中也能取得一定的成果。（4）加强免疫功效感化，经过多次的实行尝试发现太子参的有效多糖成分以及苷类物质能够实际的提高机体的一些免疫活性功能。谷胱甘肽还原酶（glutathione restorease）是一种还原型氧化还原酶，它使用还原型NAD（P）催化氧化型谷胱甘肽（GS-SG）还原成还原型（GSH）的反应。谷胱甘肽还原酶（gr）也是人体中也有着至关重要的作用它能在人体的氧化还原系统行使它的义务，他还是人体中主要黄素酶，作用是维持细胞中还原型谷胱甘肽（GSH）含量。谷胱甘肽具有的两个重要的作用抗氧化作用和集成的排毒作用，是应为它一种含有巯基且构成成分差异小的小分子肽。它重要的生理作用还体现在排毒的整合，可以与一些药物毒素结合，进行生物态的转化，从而通过体内将那些毒害物质转化形成对机体有利的物质，而那些无用物质将会排出体外。GR它作为一种重要的抗氧化酶，它能够充分利用NADPH作为一个特殊的具有还原能力和电子供给体，来催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）让它转化成具有还原型谷胱甘肽（GSH），同时也让它拥有了对抗氧化应激的能力。防止GSSG和其他二硫键化合物的积累对于细胞膜，核酸，脂质，血红蛋白，蛋白质和酶的稳定性至关重要。因此，GR在GSH的再生，维持高的GSH / GSSG细胞内比例和生物体内细胞的氧化还原平衡中起着重要的作用，并且在抵抗逆境乃至整个生长过程中起着重要的作用。在已知的研究当中，谷胱甘肽活性是在特殊植物细胞质以及真核生物的线粒体中发现的。它的活性是受一定的环境胁迫影响但也不全是。它的大多研究都在植物体内，而动物却很少，因此也为本实验提供了一定的优势。2材料和方法2.1 材料、药品及仪器2.1.1 原料鱼处理本实验原料选取是由宁德市鼎诚水产有限公司自行繁育的健康、鲜活、规格一致，体长平均（23.45±0.83）cm，鱼体质量（34.05±8.23）g的大黄鱼幼鱼。原料大黄鱼幼鱼共分六组饲养分别为：1、2、3、4、5、6（CK），养殖在1.5T养殖桶中，养殖周时长为30d，实验组饲料中添加的太子参及其他中草药浓度见表2-1。每组设置1个平行组，每组100尾大黄鱼幼鱼。每天分2次投喂鱼体质量1%2%的饲料，视摄食情况酌情调整。养殖水体水温控制在2426之间，溶解氧大于5.0mg/L，pH值维持在8.0左右，氨氮小于0.2mg/L。常规养殖管理，做好养殖记录。30天以后，每组分别随机抽取三尾健康大黄鱼进行活体解剖实验，取脾脏组织保存于已备好的Trizol裂解液，放入超低温冰箱在-80保存备用。表2-1 实验组中草药的具体添加量组别组分用量（%）E1太子参0.5E2太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天各0.167（总1.0）E3太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天太子参0.5，其他各0.1（总1.0）E4太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓各0.111（总1.0）E5太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓、太子参0.5，其他各0.0625（总1.0）Table 2-1 the specific amount of herbal medicine added in the experimental group2.1.2 试剂TB Green Premix Ex Taq（Perfect Real time）、购自大连宝生物公司。dNTP购自大连宝生物公司。DNA Marker购自北京博迈德科技发展有限公司。引物由上海生工生物公司合成。Trizol试剂购自上海生工。2.2 方法2.2.1 总RNA提取Trizol法提取RNA，具体流程参照说明书，具体如下：1.取1.5mlEP管加入30-50mg组织块加入1ml Trizol 冰上研磨 室温静置5min ，4 12000g离心5min。2.取上清加20%体积氯仿，震荡混合，室温静置5min，4 12000g离心5min。3.取上清加等体积异丙醇（预冷），震荡混合，-20静置20min，4 12000g离心10min。取上清时需注意宁可少取也不要取到中层蛋白和下层基因组溶液，若取到则对后续RNA纯度品质造成污染。4.弃上清加1ml75%乙醇，4 12000g离心5min，干燥（干燥需干燥至EP管壁无残留乙醇，若残留乙醇过多可以用灭菌过的枪头吸出，干燥至RNA沉淀由乳白转至渐透明之间，则干燥完全），加无核酸酶水20-30L，保存于-80冰箱。2.2.2 RNA凝胶电泳1.制胶：称取4.8g琼脂糖，加40ml 10X TAE电炉加热溶解放凉加入4ul核酸染色剂，倒入制胶模具，待凝固成型。2.点样：将RNA样品顺离与RNA Loading Buffer混好，将混好的RNA样品一一点入胶孔中，设定程序121V 15min，开始电泳。3.将电泳完成的胶用凝胶成像系统观察，验证其完整性。2.2.3 RNA定量分析将RNA样品用超微量分光光度(Thermo Scientific)测定样品在260和280nm的吸收值，记录RNA样品浓度OD值用于后续实验，本次实验测定出RNA OD均值所在范围，由数据得知RNA纯度较高可进行下一步实验。2.2.4 RNA反转录以RNA样品为模板，按照PrimeScript IV 1st strand cDNA Synthesis Mix(Takara)试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成，总反应体系为10 L（如表2-2）。表2-2反转录各引物Table 2-2 reverse transcription of each primer引物名称各引物含量（L）5×BufferEnzyme Max OligdTRandom 6 mersRNA水20.50.50.51-3加至102.2.5TB Green实时荧光定量PCR根据大黄鱼基因组数据库中的基因序列设计引物，以-actin为内参基因(表2-3)，使用TB Green Premix Ex TaqTM (Takara)试剂盒，对基因进行相对荧光定量PCR检测，每个反应设2个重复。12.5 L反应体系如下：6.25 L TB Green Premix Ex TaqTM (TaKaRa)，正向和反向引物各0.5L（2 M），1 L稀释后的cDNA 模板（1:10稀释）4.25 L 水，循环参数：95 预变性 5 min，40 个循环：95 15 s，60 45 s。PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。实验重复 2 次，以平均值进行后续数据分析。根据2-Ct 方法计算出每个基因的相对表达量，所得数据用SPSS （Statistics Package for Social Science）18.0 进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），比较均值的差异显著性（p0.05）。表 2-3 大黄鱼实时荧光定量PCR引物Tab.2-3 Primers used for real-time PCR analysis from L. crocea基因名称 正向引物 反向引物gene name forward primer reverse primer谷胱甘肽还原酶 GR AGCCAAAACAGCCGTGAT CGGCTAACATAAGCATCCC-actin TCGTCGGTCGTCCCAGGCAT ATGGCGTGGGGCAGAGCGT3 实验结果与分析3.1总RNA纯度及完整性分析不同组织中总RNA样本经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示，RNA无明显降解，每个RNA样本的OD260/OD280值均为1.82.0，说明总RNA纯度较好；18S和28S条带清晰，总RNA具有较高的完整性，可继续用于后续实验。图3-1显示了不同组织中总RNA样本的电泳结果。图3-1不同样本个体的组织总RNATotal RNA of differell sample individual3.2 熔解曲线分析特异性引物进行熔解曲线分析如图3-2所示，发现熔解曲线呈现单峰，说明引物特异性较好，定量结果准确。图3-2 GR溶解曲线分析结果Figure 3-2 Results of GR dissolution curve3.3谷胱甘肽还原酶的基因表达水平图3-3 中草药在大黄鱼脾和肾组织中谷胱甘肽还原酶的基因表达水平.Fig. 3-3 gene expression level of glutathione reductase in spleen and kidney tissues of Pseudosciaena crocea.中草药对大黄鱼脾和肾组织中谷胱甘肽还原酶基因表达的影响如图3-3所示。从图3-3中可以看出，与对照组相比，各实验组中两者基因的表达均出现了不同程度的下降，E1组两者基因表达量均下降到了0.4，而E2组肾组织的表达量却上升到了1.4，脾组织的表达量下降到了0.7，E3、E4、E5组都是下降但是各组间均无显著性差异。4讨 论4.1中草药的特性与应用中草药是天然草药，性价比高，产地众多，功效普遍。而且，它在处理期间不需要复杂的设备和过程。通常在干燥，粉碎和混合后使用，这符合中国水产养殖目前的发展水平。化学药物里面所含成分复杂有大量的有害物质，中草药虽也具有毒性，但是它属于自然草药，对环境个体都很温和适应，具有一定的安全性。赵显龙等12研究中心指出，中草药的药物成分能够把有害的病原细菌有效的消灭，是因为它的药物成分能够精确地在各个组织中将发育和分裂的病原体微生物的代谢功能破坏，对病原细菌进行了抑制。正是由于它的天然性且与动物身体非常协调的具有一定安全性，因此它可以被机体正常分解后不造成危险，在体内吸收并排泄。此外，中草药还可以通过天然制剂进行排毒，与配方配合使用，并通过互相杀戮和恐惧的作用进行排毒，因此在动物肉，蛋，奶等产品中不易产生有害残留物。这也是一特色功能。在中国我们的养殖行业如今已是发展迅速，然在能在水产养殖中起到关键推动作用的就是养殖时饲喂饲料的使用，因此各种防腐剂、抗生素等饲料添加剂是必不可少的。然而造成的一些关键性危害作用就必须让我们产生警惕。能够在国内值得重视并将它广泛于水产养殖中的饲料添加剂中草药，是因为它具有众多优势，如利于吸收消化、营养成分高、对环境友好、安全纯天然这些特点13-18。由于中草药属于天然草药，在我国产量丰富价格实惠，而且药效应用广泛，因此开发和研究中草药的应用必会成为发展趋势，它将取代各种有危害的人工合成药物成为广泛应用的新型饲料添加剂。中草药取自于植物的根部、茎杆、叶脉、果实还有动物的骨骼、内脏等还有一些矿物成分，它丰富的营养物质能够改善机体活性机能，能够杀虫除害。在于其他饲料添加剂相比时它使用方便、残留毒素少、来源广泛、经济实惠、药效明显、等各种优势都值得人们对它研究。4.2中草药的作用机理通常我们把提高机体免疫能力和中草药的作用机制放到一起研究，结果发现与之相关的是它能在疾病预防和治疗中起到作用主要是通过刺激影响机体内抗病因子从而改善器官组织功能和增强抗病力，这也是它具有抗菌能力的体现。一些中草药的各种有效成分能够提高动物机体免疫性能，使其具有强大的免疫作用。在水产鱼类养殖中存在的农药危害残留的问题以及各种抗生素和化学药物导致的鱼类免疫性能下降都可通过使用中草药添加剂来改善，这就充分体现了中草药作为免疫增强剂的强大作用。它还可以满足发展无公害渔业的需求，并生产绿色水产品12-16 。国内外很多学者研究证明，在研究水产养殖的动物的抗疾病能力时中草药也可作为免疫增强剂在当中发挥重要作用。4.3目的和意义大黄鱼的水产养殖产业链的是福建省水产收入主要来源之一。由于现代科技的发展人们生活要求的提高，造成各种工业化水域污染、水域垃圾污染等等一些养殖水域污染问题，这样便导致了大黄鱼在水域养殖难度的增加病例增多。目前，在防治大黄鱼疾病中，人们还是利用一些人工合成的化学添加剂还有较普遍具有一定危害性的抗生素。然而长时间的使用这两者会造成一些扎根的危害问题出现。先说化学药品的使用，它当中的一些化学元素以及有毒物质不仅会污染水体，还会导致水体生物圈的失衡，破坏水中生物的生活环境。再说抗生素，它的作用机理是提高机体的抗病毒能力，正因如此抗生素的大量使用会导致机体周围的有害微生物承受药物作用的能力加强，也是影响到了生物圈的平衡。更有甚者还会影响人类的生活。随着人们生活品质提高，绿色无污染的水产食品得到了人们的追捧与认可，这将是未来食品消费的主流。然而那些通过人工合成化学药品以及抗生素添加剂养殖的水产加工食物必将逐渐淘汰。我们应将重点放在新型天然添加剂的研究中。因为中草药营养成份丰富,实用性强、药效能力好、加工方便、对环境污染小、药力对机体温和，还能增强培育个体的各项生理机能。为我们提供了各种新型无污染的饲料添加剂,更全面的保护了生物圈以及降低了疾病概率。它的这些优点已在广泛传播得到世界人们的肯定,是人们在未来新研究中关注的重点,这也体现了它独特药理魅力。当下，我们已将天然无公害的饲料添加剂作为入手重点。在我国中草药的来源众多物产丰富。而中草药一些独有优势，天然无污染、价格实惠、药理性强、副作用小、对环境友好以及能提高生物体的抵抗力。早已被被人们认可，并广泛用于水产以及畜牧养殖繁殖和生产当中。由于中草药在现阶段作为饲料添加剂的研究和应用不够完善，无法确定具体的中草药添加剂标准。但是我认为随着研究的不断深入，它将能够生产出高科技的产品。新型中草药饲料添加剂该具有高质量，高效性，安全性天然稳定性等，这样才能得到了国际社会的认可，还可以在绿色水产养殖业中展示它的优异性，并开辟中草药在水产养殖中应用的新研究领域。4.4总结从该实验的结果可以得出结论，喂食中草药添加剂后，黄花鱼脾肾组织中GR的表达有不同程度的降低，但两组之间无显着差异。它可以按捺住自由基对生物粉碎性的行为。但在时间用量以及各种不可控因素的影响下肾组织的基因表达程度还是会明显升高。所以之后的实验研究中我们还是要控制各种变量的准确程度以及精确性。寻找出更为有效的实验数据。为日后的继续研究或后人的实验提供更好的基础。本次的实验也是从单方面的比较得出结论，或许欠缺尚多但我依旧会努力探索。致 谢时光匆匆，转眼大学四年的学习生活就要走到尽头。回想大学的生活少不了酸甜苦辣，和同学一起度过的欢乐一起讨论学习的时光和舍友的玩闹嬉戏都将成为记忆!四年的学习生活使我受益匪浅。经历大半年时间的磨砺，毕业论文终于完稿，回首大半年来收集、整理、思索、停滞、修改直至最终完成的过程，我得到了许多的关怀和帮助。在此我要感谢在论文的选题、搜集资料和写作阶段，史晓丽老师倾注了极大的关怀和鼓励，还有陈慧玲老师在就业问题上的建议和关心。此外，我还要感谢我班的所有同学，是你们使我感受到大家庭的温暖，再次体验到了同学之间深厚的友谊。虽然马上就要毕业了，但是我们在这四年里建立的友谊将不会随着学业的完成而终结。最后，我要感谢我的家人，谢谢你们对我求学的支持，在我为了读书而无法兼顾到家庭时，一如既往地鼓励我，照顾我，替我分担本应由我承担的工作和家庭责任，是你们的无私奉献，带我走到了今天的毕业，谢谢你们！忘不了学校的每一处土地，忘不了学校的每一处笑声，今天我们以你为荣，明天你以我们为荣!参考文献1 刘家富,韩坤煌.我国大黄鱼产业的发展现状与对策J.福建水产,2011,33(05):4-8.2 张彩兰,刘家富,李雅璀,等.福建省大黄鱼养殖现状分析与对策J.上海海洋大学学报,2002,11(1):77-83.3 柯巧珍,余训凯,张永兴,等.饲料中添加胜肽和益生菌对大黄鱼生长性能和体组成的影响J.应用海洋学学报,2018,37(1):141-145.4 王家敏.复方中草药对吉富罗非鱼免疫相关基因表达的影响D.广东海洋大学,2011.5 丁自勉,石凤敏.中国中草药饲料添加剂的现状与展望J.世界科学技术-中医药现代化,2013,15(03):446-454.6 杜海江.自拟复方中草药超微粉对断奶仔猪生长性能、猪瘟免疫效果、抗氧化性、血液生化指标等的影响D.福建农林大学,2016.7 姚勇,邢华.太子参在水产动物养殖中的应用初报J.中国水产,2005,(6):82. 8 秦汝兰.太子参多糖的提取及抗疲劳作用的研究J.人参研究,2010,(3):18-19.9 夏伦祝,徐先祥,张睿.太子参多糖对糖尿病大鼠糖、脂代谢的影响J.中国药业,2009,18(9):17-18.10 袁逸铭,高湘,许爱霞,等.太子参醇提物的抗脂质氧化作用J.中国临床药理学与治疗学,2005,10(1):83-86.11 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