解淀粉芽孢杆菌中基因敲除体系的建立.docx

摘要目的：解淀粉芽孢杆菌在自然环境中广泛分布，易于分离和培养，对人类和人类无毒无害。其代谢物丰富，具有广谱抗菌活性，抗逆性强，生长快，稳定性好，在植物病害的防治中具有多种有益作用，非常适合生物的大规模生产和应用。本研究基于实验室中先前的实验并使用现有的质粒pKSV7，本研究尝试选择合适的反向筛选标记以使无痕基因操作成为可能，并为解淀粉芽孢杆菌C10的遗传修饰提供强大的工具。方法：相关研究显示，在菌体内体外胸腺嘧啶类似物5-FU可以生成有毒物质5-dUMP，利用这一原理可以敲除解淀粉芽孢杆菌C10内的upp基因，之后获得C10upp这一突变菌株，基于这一底盘细胞可以进行自杀型基因敲除载体pKSU-amyA的构建，此载体内含有upp基因，并成功敲除了C10中的amyA基因片段。结果：1. 构建的pKSV7-upp载体经酶切以及测序确认载体构建成功。在探索解淀粉芽孢杆菌C10的电转化条件后，确定通过LB培养基过夜培养的解淀粉芽孢杆菌 C10在LBS培养基（每升水0.5 M山梨糖醇，10克氯化钠，10克胰蛋白胨和5克酵母提取物）中转接，同时添加0.64%甘氨酸溶液，0.05%Tween 80（w/v）溶液，1.02%DL -苏氨酸溶液，32 振荡培养至 OD600=0.9。重悬感受态细胞时用MSG缓冲液（0.5 M山梨糖醇，0.5 M甘露糖醇和10甘油）。电转化时预设电压为2000V，电击时间为5ms,电击后加900 uL复苏培养基（LB培养基里加0.5 M山梨醇，0.38M甘露醇），180rpm 32复苏3h，涂布含Cm的LB平板。2. 经过对upp基因敲除菌株C10upp菌株和原始菌株 C10进行了生长曲线测定，发现upp基因的缺失对菌株生长速率没有影响。以此为依据可以在解淀粉芽孢杆菌的遗传学改造过程中将upp基因作为菌株的反向筛选标记基因。3. 在pKSV7载体中移入upp基因，再一次将含有upp表达盒的反向筛选质粒 pKSU通过接合转移导入解淀粉芽孢杆菌C10upp。将重新导入upp基因的突变菌株C10upp（pKSU）和突变菌株 C10upp在 0.35mM的5-FU的平板上涂布，在此平板上含有upp基因的突变菌株C10upp（pKSU）出现生长异常，这表明含有upp基因的菌株对5-FU具有较高的敏感度，这一现象也从侧面表明了在对解淀粉芽孢杆菌进行遗传学改造时，upp基因可以作为一种反向标记基因。4. 构建敲除载体pKSU-amyA，经过电转化进入突变菌株C10upp，经过氯霉素与5-FU敏感性检测后，得到突变菌株C10uppamyA。同时对突变菌株C10uppamyA进行了淀粉酶水解实验。实验结果显示，突变菌株C10uppamyA由于-淀粉酶基因的缺失，不能形成水解圈。实验的成功证实了解淀粉芽孢杆菌C10中基因敲除体系的成功建立，为后续在解淀粉芽孢杆菌C10中的遗传操作奠定了基础。关键词：解淀粉芽孢杆菌；载体构建；upp；基因敲除AbstractObjective: Bacillus amyloliquefaciens is widely distributed in the natural environment, easy to isolate and culture, non-toxic and harmless to humans and humans. It is rich in metabolites, has broad-spectrum antibacterial activity, strong stress resistance, fast growth, and good stability. It has a variety of beneficial effects in the control of plant diseases and is very suitable for large-scale production and application of organisms. This study is based on previous experiments in the laboratory and uses the existing plasmid pKSV7. This study attempts to select suitable reverse screening markers to enable traceless gene manipulation and provides a powerful tool for genetic modification of Bacillus amyloliquefaciens C10 .Methods: Using the principle of 5-FU, a thymine analog in vitro, to produce 5-dUMP, which is toxic to bacteria, the upp gene in Bacillus amyloliquefaciens C10 was knocked out to obtain a mutant strain C10upp. Based on this chassis cell, The suicide gene knockout vector pKSU-amyA with the upp gene was successfully knocked out of the amyA gene fragment in C10.Results:1. The constructed pKSV7-upp vector was successfully digested with enzyme digestion and sequencing. After exploring the electrotransformation conditions of Bacillus amyloliquefaciens C10, it was determined that Bacillus amyloliquefaciens C10 cultured overnight in LB medium in LBS medium (0.5 M sorbitol per liter of water, 10 g sodium chloride, 10 g tryptone and 5g yeast extract), while adding 0.64% glycine solution, 0.05% Tween 80 (w / v) solution, 1.02% DL-threonine solution, shake culture at 32 until OD600 = 0.9. Resuspend competent cells with MSG buffer (0.5 M sorbitol, 0.5 M mannitol and 10% glycerol). The preset voltage during electrotransformation is 2000V, and the electric shock time is 5ms. After the electric shock, 900 uL recovery medium (0.5 M sorbitol and 0.38M mannitol in LB medium) is added, and the cells are recovered at 180 rpm and 32 ° C for 3 hours. flat.2.After determining the growth curve of the upp gene knockout strain C10upp and the original strain C10, it was found that the deletion of the upp gene has no effect on the growth rate of the strain. Therefore, the upp gene can be used as a reverse screening marker gene to genetically modify Bacillus amyloliquefaciens.3.By constructing the pKSV7 vector containing the upp gene, the reverse selection plasmid pKSU containing the upp expression cassette was once again introduced into Bacillus amyloliquefaciens C10upp by conjugation transfer. The mutant strain C10upp (pKSU) and mutant strain C10upp that reintroduced the upp gene were coated on a 0.35 mM 5-FU plate, and C10upp (pKSU) could not grow normally on a 5-FU plate, indicating that the upp gene replenished strain was recovered The sensitivity to 5-FU was proved, and the upp gene was proved to be the feasibility of reverse marker gene in the genetic modification of Bacillus amyloliquefaciens.4.Construction of the knockout vector pKSU-amyA, which was transformed into the mutant strain C10upp by electrotransformation. After the sensitivity detection of chloramphenicol and 5-FU, the mutant strain C10uppamyA was obtained. At the same time, amylase hydrolysis experiments were performed on the mutant strain C10uppamyA. The experimental results showed that the mutant strain C10uppamyA could not form a hydrolysis circle due to the deletion of the -amylase gene. The success of the experiment confirmed the understanding of the successful establishment of the gene knockout system in Bacillus amyloliquefaciens C10, which laid the foundation for subsequent genetic manipulation in Bacillus amyloliquefaciens C10.Key words: Bacillus amyloliquefaciens; vector construction; upp; gene knockout第一章 前言1.1 解淀粉芽孢杆菌芽孢杆菌（Bacillus）在自然界中分布较为广泛，此种细菌的抗菌活性与抗应激能力均较强。在细菌的自然生长代谢中，芽孢杆菌会分泌以挥发性抗菌物质、小分子抗菌脂肽、大分子抗菌蛋白为主的抗菌物 1。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是日本学者福本（Fukumoto）于1943年首次发现的。由于解淀粉芽孢杆菌的外观和性能特征与枯草芽孢杆菌非常相似，其16SRNA对比同源性高达99。它最初被列为枯草芽孢杆菌的亚种之一。直到1967年，一些学者利用DNA杂交技术发现解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌是不同的品种2。解淀粉芽孢杆菌属于革兰氏阳性杆菌的一种，此细菌为耗氧菌，在自然界有较为广泛的分布，其优点如下：不会对环境造成污染，且不会对动物与人类有损害；分离培养菌株的成功率较高；具有丰富的代谢产物，如大环内酯类、抗菌蛋白、脂肽类等物质，具有良好的抑菌性，可抑制动植物病原菌的生长；代谢产物应用十分广泛等。解淀粉芽孢杆菌代谢产物的主要用途为食物保鲜、动植物细菌病的防治等，因而应用前景十分广泛 3。表1.1是常见的 B. amyloliquefaciens 菌株的应用。表 1-1 部分报道的 B. amyloliquefaciens 菌株及其应用Table1-1 Partially reported B. amyloliquefaciens strains and their applicationsB.amyloliquefaciens 菌株应用参考文献S76-3 iturin, plipastatin 和 surfactin，用于植物病害防治 Gong et al. 20154DSM1061 中性植酸酶，饲料添加剂Xu et al. 20155FZ42 Bacilysin，抗菌物质 Wu et al. 20146 LPL061 EPS Han et al. 20156Huang et al. 20147 HR62 发酵液作为生物有机肥防治番茄枯萎病LL3-聚谷氨酸 Cao，et al. 20118SD-32 bacillomycin D Tanaka,et al. 20149 TA208 三唑核苷和鸟苷Zhang et al. 201110 ATCC 23842 -淀粉酶Gangadharan et al.200811 CH86-1 纤溶酶Lee et al. 201012 FZB42 Amylocyclicin Scholz et al. 2014131.2同源重组在长久的生物进化与自然选择过程中，不同基因型个体的产生主要依赖于个体内的基因重组及不同个体间的遗传物质交换，之后进行自然选择从而优胜劣汰，人类的进化过程就是好基因与不好基因的长期积累与交换。从这一角度考虑，自然界中的每个个体都是经过基因重组之后产生的。当前人类已知的基因重组技术主要包括以下几种：同源重组、转座重组、非同源重组与位点特异性重组等。其中发生最为广泛的是同源重组，其在所有的生物体中几乎都会发生，是重要的染色体遗传信息交换方式。同源重组的例子主要有：真核生物中姐妹染色单体的基因交换、细菌的转导与重组、细菌与低等真核生物的转化等。这种方式又称一般重组，是受损细胞损伤修复的主要方式。在分子生物学实验中，同源重组技术应用广泛且常用于基因敲除与基因克隆之中。当前主要存在的同源重组分子模型主要有三种：双链断裂修复模型、单链侵入模型与双链侵入模型。一、 双链侵入模型一、 相关学者在研究真菌基因转化遗传机制的过程中，为对此机制进行解释提出了异源双链交叉结构这一模型，这就是双链侵入模型。通过分子生物学研究显示，此模型中不存在基因复制，在基因重组过程中会形成接头结构。该模型形成的关键是原有的基因链断裂，重新连接之后形成接头结构。这一模型已成为标准，在其他模型中也含有这一接头结构，可作为重组间隙体。然而此模型在个体内具有较低的发生频率，这是由于重组过程的触发必须要求在同一位置、同时切断两个基因分子。二、 单链侵入模型1975年Meselson与Radding构建了单链入侵模型，此模型的构建是以Holliday模型为基础，对其进行修改与添加之后形成单链入侵模型。对此模型的解释是在两个DNA分子中，在随机位点切割一个DNA分子的一条单链，此单链暴露出的末端对另一个分子进行入侵，找到与之相互补的序列之后两者结合，将原来的DNA链替换下来。之后以剩余的链为模板，利用DNA聚合酶对缺口进行填补。之前被替换下的DNA链降解消失，其剩余末端连接到另一个分子中新合成的基因链上，这就是霍利迪接头的形成过程。霍利迪接头形成之后马上被异构化，之后被拆分为几个部分。因而这一模型中的双链是不对称的。三、双链断裂修复模型Szostak于1983年研究酿造发酵时，提出了以基因重组为基础的双链断裂修复模型。对这一模型的主要解释为：首先在核酸内切酶或其他因素的作用下参与重组的DNA双链发生断裂，在核酸内切酶的作用下，核酸外切酶进行扩展形成缺口并促进3'单链粘性末端的生成。其中一个3'末端对另一个进行入侵，双链DNA中的同源区域对供体双链DNA的一条单链进行取代，因此形成了单链双链DNA与D环。以3'端为引物，以未拆散的单链DNA作为模板进行基因的修复与复制，在DNA聚合酶的作用下形成了Holliday连接子共两个。最后与前两中模型类似的是，这两个Holliday连接器被拆分为多个部分。总结来说，无论是真核生物还是原核生物，其基因重组主要为以上三种模型。上述三种模型之间的关系为相互联系与补充，且更多研究显示，最常见的重组方式为在双链断裂的情况下引起的同源重组。1.2.1 RecA重组系统RecA重组系统的主要组成部分为RecA蛋白与RecBCD复合蛋白，属于大肠杆菌自带的非外源同源重组系统。RecA蛋白具有的特征主要包括单链DNA结合活性与DNA依赖的ATPase活性，前者表示RecA蛋白可以与大量单链DNA结合在一起，每个RecA单体平均可以结合的核苷酸数量为4个，此为耗能过程；后者表示RecA蛋白可以作为ATP酶将ATP水解，产生能量，在存在DNA的环境中促进基因链的交换。在重组过程中，RecA蛋白的作用十分重要。在体外条件下，RecA蛋白可以对同源DNA分子间的配对、缔合、分支迁移与链交换的过程起到促进作用。相关研究发现，以RecA蛋白为催化条件的链交换与同源配对过程可分为三个时期：（1） 预结合，首先在RecBCD酶的作用下，单链DNA形成3'端突出。RecA蛋白积聚在这一DNA单链上，这就是核酸蛋白丝状复合物的形成过程；（2） 结合，预结合形成的核酸蛋白丝状复合物中，RecA蛋白寻找同源双链DNA用以使之与单链DNA之间进行垂直配对，这就是RecA单链DNA复合体三元的形成过程；（3） 链交换，单链DNA对双链DNA进行入侵，在进行同源配对之后将其同源部分取代。之后单链DNA与互补链形成配对碱基，这就是D环的形成过程。RecBCD这一蛋白质十分复杂，RecBCD酶属于核酸外切酶的一种，其具有单链/双链核酸外切酶活性与线性解旋酶活性。后者主要是指RecBCD酶可以利用水解产生的能量解旋线性双链。复杂蛋白对同源重组过程的促进作用主要为：蛋白首先结合于双链缺口上，解链之后在这一位点产生DNA单链。同时由于RecBCD酶属于核酸外切酶的一种，因而在细菌中可以降解线性分子。其必须以环状质粒靶向载体为媒介才可利用微生物本身的RecA重组系统。本文中1.4节主要描述了这一应用策略。1.2.2Red同源重组尽管Red同源重组系统是以传统同源重组技术为基础进行改善之后形成的，但是此方式依然存在缺点：首先这种方式对同源臂的要求更高，需要其靶基因达到一定的长度；其次应用Dicer酶的前提是必须构建环状质粒，这样就会增加实验成本、工作量及实验操作的复杂程度，但是其重组效率依然无法提高。在对重组体进行筛选时，需要耗费大量人力物力。近年来，以线性DNA为介导的同源重组技术十分热门，该技术在进行基因操作，如基因敲除、片段修饰、基因取代、缺失、插入时使用的同源臂为大体一致的左右两臂。相比于传统特定位点消化法来说，这一方法可以避免一些基因操作过程，如质粒的构建、消化与连接等，这样就使得基因操作更加简便快捷，有利于人工成本与时间成本的节约。在重组过程中可以选择目标片段为以PCR或直接合成得到的线性DNA片段，在目标细胞中将片段转化进去，从而诱导重组细胞的蛋白质表达过程。对大肠杆菌染色体中Red同源重组系统利用的首次报道出现在1998年。Murphy第一次通过研究发现，P. utilis的Red同源重组功能可以取代大肠杆菌中本身携带的同源重组功能。在之后十年的研究中，研究的热门逐渐转向以细菌为基础的Red同源重组系统，之后这一技术被广泛应用于同类基因工程菌的遗传修饰中。Exo、bet和gam共同组成了噬菌体Red重组系统。Exo蛋白是exo基因的产物，该基因可以5'末端对双链DNA进行降解，形成3'突出末端，因此，在5'-3'的方向，其具备核酸外切酶活性。环状三聚体是Exo蛋白的活性形式。在Exo蛋白的内部，其一端容纳单链DNA分子，另一端容纳双链DNA分子，在其内部这三个单体分子相互连接形成通道，这是一个结构决定功能的典型例子。beta产物即单链结合蛋白由bet基因产生，分子量达到28KD。要想形成新的双链片段，单链结合蛋白可以与单链相结合，从而使互补链退火。具有与特性的重组蛋白还有以下几种：真核Rad52蛋白（大肠杆菌Rac噬菌体）、RecT蛋白（大肠杆菌Rac噬菌体）、Erf蛋白（沙门氏菌P22噬菌体），这些蛋白都可以使互补单链DNA退火。线性DNA的重组过程由Exo蛋白和Beta蛋白来完成。Gam蛋白是gam基因的产物，其分子量为16KD。在大肠杆菌中，该蛋白可以避免线性DNA片段被降解，并且可以使RecBCD蛋白复合物的核酸外切酶活性受到抑制。1.3解淀粉芽孢杆菌的转化方法枯草芽孢杆菌目前有五种将外源DNA引入枯草芽孢杆菌的转化方法，例如噬菌体转导14，原生质体15，自然转化16，重组方法17和电穿孔18。前两种方法是将DNA引入芽孢杆菌的重要方法19。1.3.1 原生质体转化法在对芽孢杆菌进行外源质粒转化过程中，其最大的阻碍是较厚的细胞壁会阻碍质粒的进入。原生质体转化法的原理是用溶菌酶提前处理菌体，溶解其细胞壁后形成原生质体，这样导入外源质粒就会更加方便，成功导入之后将其转移至再生培养基中重新恢复细胞壁。这一方法较为传统，Chang 和 Cohen在研究中使用了枯草芽孢杆菌原生质体转化法，以此为参考可以在芽孢杆菌原生质体转化的过程中调配所需的培养基与缓冲液。同时这一方法也是多种芽孢杆菌进行外源质粒转化的重要方式 15。 1.3.2自然转化法自然转化法的主要依据是菌体具有的能力为可形成天然感受态，可以将外源DNA重组进入基因组中。B.subtilis DNA 转化方法是由Spizizen所发明的经典方式16。然而这一方法的应用率较低，这是由于其具有很低的转化效率。以此为基础李瑞芳改进了这一转化方法，有利于菌体形成感受态，但是对转化效率的提高并无帮助。1.3.3电转化法 当前电转化法在实验中应用较为广泛，这是由于其具有转化效率高、操作简便、适用菌种范围广泛、周期较短等优点。在长期的研究过程中，针对不同的菌株研究出参数不同的电转化法。Xue等在地衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的外源质粒转化实验中就是运用的电转化法18。然而在实际操作中，其主要障碍是对转化条件的要求十分苛刻，因此下一步必须探讨研究对电转化法中参数的调节。但是，由于繁重的工作量和耗时的实验过程，这两种方法并未得到广泛使用20。通常使用自然转化和重组方法将DNA引入枯草芽孢杆菌，结果是某些枯草芽孢杆菌的转化效率很高16,17。但是，这两种方法的转化效率与某些基因密切相关，例如群体感应组件和能力主调节子comK。这些基因的不同结构导致转化效率的巨大差异21,22。因此，天然转化和重组方法在菌株中具有特异性。与其他方法相比，电穿孔是一种常见的省时的转化方法，已被广泛用于枯草芽孢杆菌18-20,23,24。尽管枯草芽孢杆菌的电穿孔方法已经研究了很多年，但对于所有枯草芽孢杆菌仍没有标准和通用的方案。由于解淀粉芽孢杆菌的巨大工业价值，对于基因操作的各种方法，研究人员也提出了更高的要求。当前非常多的菌株已有全基因组测序结果被发表，因而出现了越来越多的位点可用于基因操作，在这种情况下，为加快菌株转化的效率，必要的是简便高效的基因操作方法。不幸的是，解淀粉芽孢杆菌的遗传操作通常限于转化步骤。与其近亲枯草芽孢杆菌相比，解淀粉芽孢杆菌菌株在转化方法上具有更大的缺点：首先，解淀粉芽孢杆菌不能形成天然的感受态，不可以用诸如枯草芽孢杆菌的PCR片段转化；其次，一些解淀粉芽孢杆菌菌株转化效率低，甚至不能完全转化25。所报道的解淀粉芽孢杆菌菌株的大多数转化都需要电穿孔。通常，将山梨糖醇或蔗糖添加到培养基中以增加渗透压，或者甘氨酸或丝氨酸可以削弱细胞壁以增加转化效率25,26。 Zakataeva等发表了通过噬菌体转导来完成解淀粉芽孢杆菌的转化27。然而对于普通实验室而言，这种操作方法所需的材料获得十分困难，而且具有复杂的操作过程，因而不是十分适用。因此，研究淀粉芽孢杆菌转化方法具有重要的理论意义和应用价值。1.4 芽孢杆菌属中的遗传操作策略 不管是大规模的染色体遗传工程，还是单基因敲除实验，简便有效的遗传操作是必须的。如何将敲除的DNA元件如何转化成受体细菌，有以下几种适用于芽孢杆菌属的基因操作方法。1.4.1. 利用自杀质粒进行基因敲除在宿主细菌中，无法进行复制的质粒就叫做自杀质粒。在运输DNA元素的过程中，这一质粒应用十分广泛28。图1-1表明了基因敲除的过程。在进行基因敲除时，自杀质粒与同源臂连接到一起，之后在宿主菌株进行转化。在宿主菌株中自杀质粒不能进入自主复制过程，因而当发生细胞分裂时，新复制的细胞中就会失去自杀质粒，这样在进行抗生素平板筛选时这些转化体就会被筛选出去。留下来的转化体都具有抗生素抗性，这些转化体的形成是在RecA介导下，染色体上相应的同源序列与同源臂之间发生同源重组，之后这些质粒就会整合于细胞染色体中，在之后的细胞分裂中也不会丢失，因而具有抗性。在经过抗生素筛选之后留下来的菌株就是第一次同源重组之后形成的转化体。在此转化体内染色体中存在同源臂两组，其中之一可以发生第二次分子内同源重组，之后将质粒从染色体上分离出来，再对染色体进行检测，其主要表现出两种结果：第一种是染色体恢复了野生型，另一种是用已构建的同源臂替换原始序列。二者可以通过PCR进行区分。在大多数芽孢杆菌菌株的报道中，图1.5中的C是特定的抗生素抗性标记。若被敲除的基因数量较少甚至只有一个，菌株的抗生素抗性标记就可以迅速构建突变菌株。若不将抗性标记用于菌株，则很少会发生第二次同源重组，这样就必须使用反向筛选标记。图1-1利用自杀质粒进行基因敲除图示Table 1-1 Gene knockout using suicide plasmid 1.4.2 利用条件自杀型质粒进行基因敲除这种质粒有两种常见的类型。一种是具有温度敏感性复制起始位点的温度敏感型质粒29。另一种是无法进行自主复制，但能借助其它质粒完成复制过程的质粒30。自杀质粒的形成原因有两种：培养温度发生变化或者辅助质粒被消除。近年来，该质粒以低转化效率，被用于部分菌株，参与基因敲除过程。对于温度敏感型质粒来说，要进行基因敲除，首先要有适合质粒复制、培养并富集的温度，并在此条件下获得转化体，为完成基因同源重组提供充足的碱基。然后改变培养温度，让质粒无法自主复制，只能通过基因同源重组，将质粒整合到其它辅助质粒上，以获得抗生素抗性，从而存活下来。之后在对应的抗生素平板上完成筛选过程并获得单次交换菌株，后续筛选流程同自杀质粒。1.4.3 基于线性DNA片段进行基因敲除随着功能基因组学的快速发展，基因敲除成为开展基因功能研究的重要内容。目前，基于线性DNA片段的基因敲除方法最适合用于大量基因组转化，它不需要耗时的载体构建流程。以下是枯草芽孢杆菌进行基因敲除的一般过程。首先通过PCR制备线性DNA片段，该片段的组成结构包括末端的同源臂以及同源臂中间的抗性筛选标记。然后将获得的DNA元件转化进待进行基因敲除的菌株，末端的两组同源臂经两次重组被融入到染色体中，从而替换需敲除的序列。为去除染色体上标记的抗生素抗性，学者们研究出两种方法：一是于体外建立仅包含同源臂而没有抗性标记的DNA元件，该元件必须包含合适的反向筛选标记基因；二是对抗性基因进行两次重组替换，即在DNA元件的反向筛选标记的两端，加入重复或具特异性的DNA序列，并通过基因同源重组或位点特异性重组除去染色体上的抗性标记。这种基因敲除方法适合于具有天然能力的菌株，例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）31。在大肠杆菌中，RecBCD复合物的核酸外切酶活性可迅速切割导入细胞的线性片段。但是，可以通过引入噬菌体编码的重组酶来克服这种不稳定性。例如，大肠杆菌中噬菌体的red和gam基因能有效避免因温度、湿度或其它原因造成的DNA大分子链断裂或化学结构改变，同时，还有利于发生同源重组。研究表明，40-60 bp的同源臂有助于基因敲除试验的进行32。1.4.4 无痕基因操作方法基因敲除过程中，由于抗生素抗性标记的存在，可能会存在一些负面影响，相关研究表明，无痕基因操作方法能有效降低重组菌株对抗性筛选标记的携带率，是目前研究特异基因型生物的有效手段。基于线性DNA片段的基因敲除方法，通过一次同源重组替换目的基因后，使DNA元件整合到染色体中以取代靶基因，为去除抗性标记，需要再进行第二次同源重组。一般情况下，发生同源替换的可能性不高，而且离开适当的抗性标记或辅助质粒的帮助，重组菌株很难筛选成功，甚至不可能。在利用自杀质粒进行基因敲除时也出现类似情况，这种质粒不能进行自主复制，必须借助于染色体上的其它辅助质粒才能完成，自杀质粒需要经过两次同源重组替换，才能除去染色体上的抗性标记物以及质粒。在对Bacillus subtilis的研究中，研究者采用了无痕基因操作技术，并取得很大成效。虽然有所区别，但两种方法都是为了提高筛选重组菌株的可能性。2002年，Fabret等人报告了由枯草芽孢杆菌PCR转导的无标记基因操作技术。作者用upp进行反向筛选标记，来对尿嘧啶磷酸转移酶进行编码（UPRTase）31。要完成反向筛选，第一步是在培养基中加入5-氟尿嘧啶（5-FU），该物质在URRTase的作用下形成5-F-UMP，再通过生物代谢作用转化为5-F-dUMP。 5-F-dUMP能起到抑制细胞生长的作用。二是需要利用反向筛选基因，消灭菌株的活性。除需要两组同源臂、DNA元件、抗性标记以及反向筛选标记外，还需引入两个正向重复（DR）于上下同源臂内。利用同源臂将DNA元件融合进菌株中，通过第一次重组，使菌株获得抗生素抗性，并确保染色体上存在upp，增加菌株对5-氟尿嘧啶的敏感性。为完成基因敲除，还要对获得的两个同源重组菌株进行筛选，让抗性物被标记，upp表达盒和多余的DR从染色体上脱落。 DR是最初存在于染色体上的序列，因此所得的突变体不会像位点特异性重组一样在染色体上留下外来序列。这也是第一个报告upp在芽孢杆菌中的使用的研究。尽管这种线性片段转化方法不适用于其他物种，包括解淀粉芽孢杆菌，但是upp反向筛选标记已被广泛使用32,33。 2006年，Zhang等人在枯草芽孢杆菌中引入了另一种类型的反向筛选标记毒性蛋白35。研究表明，大肠杆菌的mazF基因促进RNA干扰酶的表达，这种内源RNA的过表达激活细胞程序性死亡36。作者以mazF基因进行反向标记，引入的线性片段包含两组同源臂、两个正向重复序列以及标记基因三部分。首先通过两组同源臂将整个元件整合到染色体上。然后相邻DR序列间发生第二次重组，从而去除抗性标记。将IPTG表达mazF添加至筛选培养基以抑制未经历第二同源重组的菌株。Moeimoto等继续使用mazF为反向筛选标记基因，但用到的DNA元件结构有所差异106。Yu（2010）等的研究与前人不同，他对线性元件中缺乏IPTG诱导型启动子的严格性进行了研究37。这些研究说明，大肠杆菌的载体构建受Pxyl、maz F等基因的影响，而且，upp的使用频次高于mazF。Liu等研究出一种新型无标记基因敲除方法，该方法中用到的反向筛选标记基因为木糖启动子与抗生素抗性基因的结合体（2008）38，所获得的菌种具有新霉素抗性，上游同源臂的片段是UP、下游是DN，上下同源臂之间是G，同时还有araR和氯霉素抗性基因。具体操作方法如下：首先使上下同源臂之间发生同源重组，形成DNA元件与染色体的结合体，因为araR的存在，此时新霉素已经没有抗性。在基因敲除过程中，两个同源臂由于具有同源区域，存在发生基因重组的可能性，一旦发生同源重组，DNA元件就会脱离染色体，从而实现基因的无痕消除。在这种状况下，要保持新霉素的抗性，可以用新霉素作为筛选基。Yan等在2008年将Cre / lox应用于枯草芽孢杆菌39。 Cre / lox最先由Sternberg等人提出，并被广泛用于新型基因打靶，属于特异性重组酶的一种，它以较高的重组效率，被广泛用于基因工程40。重组酶Cre可以在不借助其它辅助因子或蛋白质的情况下，使该重组酶系统的两个loxP位点发生特异性重组，随着基因重组的发生，两个正向重复loxP位点之间的DNA序列可能会缺失，而反向重复的双位点间的DNA序列可能反向。当应用于基因敲除时，loxP位点保留在最终突变体中。因此，当将突变连续引入同一菌株中时，两条染色体上剩下的loxP位点之间可能发生意外的重组。所以，作者在开展研究时，引入lox位点的两个突变位点，lox71和lox66，二者形成一个双突变的lox位点lox72，这是Cre无法识别的，从而避免了由意外重组引起的染色体结构变化。 通过PCR在体外构建用于敲除的DNA元件，包括上游和下游同源臂，抗性标记，lox71以及lox66位点。在诱导该片段转变为宿主细菌，并用相应的抗生素进行筛选后，该染色体上融入lox71以及lox66两个突变位点。然后，用辅助质粒pTSC催化Cre重组酶的表达，从而促进同源重组的发生，并完成抗生素敏感菌株的筛选，最后，通过改变