毕业论文太子参提取物对大黄鱼GR的影响.doc

摘 要 谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）是一种在动植物的抗氧化系统中起着至关重要作用的抗氧化酶。为了研究中草药影响GR的基因表达水平，本次以大黄鱼(Pseudosciaena crocea )的肾脏为试验对象，通过在商品化饵料中分组添加不同剂量的太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓等中草药，饲喂周期30d。采用实时荧光定量PCR技术分析GR基因在不同实验组中的的表达水平。结果显示：与对照组相比，实验组的谷胱甘肽还原酶的基因表达量都出现不同程度的下降，E2、E3组的GR基因的表达量下降最多（均为72%），E1组的表达量下降最少为（38%），但每组之间无显著性差异（P大于0.05）。本研究结果为中草药作为饵料添加剂在大黄鱼饲料中的应用提供了基础数据，也为中草药作为鱼类免疫增强剂提供了前期研究基础。关键词：中草药；大黄鱼；谷胱甘肽还原酶；基因表达 Abstract Glutathione reductase (GR) is an antioxidant enzyme that plays a crucial role in the antioxidant systems of plants and animals. In order to study the influence of Chinese herbal medicine GR gene expression level, this experiment in large yellow croaker kidney as the research object, through group in the commercialization of bait adding different doses of radix pseudostellariae, dangshen, astragalus, licorice, Chinese wolfberry, medicinal indianmulberry root, atractylodes, angelica, poria cocos, such as Chinese herbal medicine,  and the feeding cycle was 30 days.using real-time fluorescent quantitative PCR technology analysis of GR gene expression levels in different groups. The results showed that, compared with the control group, glutathione reductase gene expression in the experimental group decreased to different degrees. The expression of GR gene in the E2 and E3 groups decreased the most (72%), and that in the E1 group decreased the least (38%), but there was no significant difference between the two groups (P > 0.05). The results of this study provided basic data for the application of Chinese herbal medicine as a bait additive in the feed of Chinese croaker, and also provided the basis for the preliminary study of Chinese herbal medicine as an immune booster for fish.Keywords: Chinese herbal medicine； croaker；glutathione reductase,；gene expression 目 录1引 言1.1谷胱甘肽还原酶1.2大黄鱼1.3中草药及太子参主要简介2材料和方法2.1 材料2.1.1 主要试剂和仪器设备2.2 方法2.2.1实验动物的选择、分组及试验设计2.2.2总RNA提取2.2.3 RNA凝胶电泳2.2.4 RNA定量分析2.2.5 RNA反转录2.2.6实时荧光定量PCR3 实验结果及分析3.1总RNA纯度及完整性分析3.2 熔解曲线分析3.3谷胱甘肽还原酶的基因表达水平3.3.1中草药在大黄鱼肾组织中谷胱甘肽还原酶的基因表达水平4讨 论4.1 中草药的应用及其作用4.2 投喂中草药对大黄鱼谷胱甘肽还原酶基因表达的影响4.3总结致 谢参考文献 太子参提取物对大黄鱼谷胱甘肽还原酶基因表达的影响1引 言1.1 谷胱甘肽还原酶谷胱甘肽还原酶(gluathione reductase)无处可以不在，广泛应用存在于原核和真核生物中，不仅是在氧化技术还原反应中起主导作用的酶之一，也是一种黄素蛋白酶，对维持正常细胞中还原型谷胱甘肽量多少有着重要作用。谷胱甘肽(GSH)能够清除机体内的O2-及H2O2等，由半胱氨酸，甘氨酸和谷氨酸组成的三肽组合物，是机体组织主要的非蛋白质巯基化合物，也是机体内高效的低分子清除剂,因此谷胱甘肽是衡量机体抗氧化能力的关键指标，在保证巯基蛋白的还原性、防止血红蛋白氧化、巯基结合蛋白活性的保持及维持细胞的完整性起着关键的作用1。GR作为一种重要的抗氧化酶，它将还原型谷胱甘肽(GSH）氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG)是通过利用还原型辅酶作为唯一的还原力和电子供体进行的，以此来抵抗氧化应激2。防止GSSG和其他二硫化合物的积累，以及对酶、细胞膜和蛋白质的稳定性起着至关重要。因此，GR对GSH的再生、维持胞内高比率GSHGSSG及平衡生物体内氧化还原有重大的意义，在抗逆性甚至整个生长发育过程中起着关键作用。许多实验研究已经证明在植物的细胞质中，叶绿体，线粒体和溶酶体都是有GR活性的存在，并且会在非生物胁迫中增加，岳川等推测已经成功克隆的茶树的谷胱甘肽还原酶基因，对茶树在抵御非生物逆境胁迫中起着关键的作用3。朱守晶等根据组织表达的结果进行分析后，推测克隆的苎麻谷胱甘肽还原酶基因BnGR1在减轻镉胁迫对苎麻的毒害方面发挥作用4。但是，有关GR在动物中起到作用的相关报道较少。1.2 大黄鱼大黄鱼(Pseudosciaena crocea)，英文名为large yellow croaker，又称桂花黄鱼、黄金龙，属于亚热带性鱼类，分布于中的海南、东海以及黄海的南部。它的肉质较好且味道鲜美、低胆固醇，含有丰富的脂肪、蛋白质、维生素以及对机体产生的自由基有消除作用的微量元素硒，并且含高度不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸等，是我国东部沿海的重要养殖鱼类之一。近年来，养殖规模不断扩大，虽然对社会经济发展有很大的促进作用，但还是存在如病害频繁出现，产品质量下降，产业管理和产业链水平持续降低，环境、水质污染等问题，经济损失严重，影响了产业的发展5-6。由于目前防治病害方法存在抗药性、药物残留等局限性，提高鱼类自身免疫已然成为人们需要急需探究的新课题。1.3 中草药及太子参主要简介中草药是中医中常用的一些药材，主要由植物的叶、茎、果，动物的内脏、皮肤、骨骼等和些许矿物组成而来，环保性高，成本较为低廉。三农记、淮南子等均详细明确记载了如何有效使用中草药饲喂家禽的方法，并且说明中草药对其生长发育有促进作用以及对防治病害的作用7-8。由于中草药的普遍使用和近几年来国家倡导的绿色安全无公害水产养殖技术的不断推行，中草药作为天然的成分，已然成为水产医学研究的重点内容。其具有低毒、抗病害、抗药性等特点，主要成分极易被消化吸收，而不易被吸收的成分可顺利排出体外，一般不会对机体造成药物残留等副作用，价格便宜，资源丰富优点，有望成为鱼病防治的新宠9。中草药普遍含有促生长物质、免疫物质和比较稳定的糖类、脂类等。其中每一种成分都有其特别的作用效果，对预防鱼类疾病将起到关键作用，另外，在渔业的日常管理中，中草药也被用作免疫刺激剂和鱼类饵料添加剂。例如，部分的糖脂蛋白氨基酸等组分能在某种程度上提升消化酶的分泌能力以及鱼类的基础代谢率，还可以进一步提高鱼类对营养物质的利用率，促进其生长发育。免疫类的物质和蛋白氨基酸的参与可以提升鱼的免疫力和抗病能力；以不同中草药如黄芪 、黄芩和党参等配制的药物饵料投喂大黄鱼，虽然对大黄鱼的非特异性免疫功能有很大的提升 ，但是不能使其免于特异性的感染10；中草药在我国鱼类疾病的防治方面有着很长的历史，积累了大量的经验。因此，合理使用中草药添加剂，不但可以缓解化由于抗生素和学药物导致的问题，也可以进一步解决水产养殖中的药物残留问题。中草药从古到今经常被用作水生动物饲料的添加剂，主要是依据其可以提高机体的免疫力和抗病能力，同时对于水动物饲料添加剂中草药的研究也越来越受到重视。太子参是由三萜皂苷和多糖等物质组成的活性物质，可以从石竹科植物孩儿参的干燥块根中提取得到，能够提高抗病力和免疫力、抗氧化、降血糖及抗疲劳等作用，也是生活中常用的一种中草药。太子参作为名贵的中草药其被认可的功效有：补气益脾，滋养津液。太子参品质的高低取决于太子参根块的饱满程度、是否香味浓郁、还有就是含糖量的高低。其药理作用有：（1）抗疲乏、缓解紧张（2）提高人体抵抗力（3）SOD样作用（4）延年益寿（5）止咳、抗菌、抗病毒作用。据药学专家的研究表明，太子参不但含有锌、铜、硒、铁等丰富的微量元素，而且含有大量的氨基酸如Lys、Phe、Thr、Ile、Leu 等8种人体必需氨基酸，同时，太子参还含有大量的麦芽糖、多糖PHPA和PHPB，其次，研究还表明太子参还含有丰富的太子参苷A、尖叶丝石竹皂苷D及3-O-D葡萄糖苷等活性物质11-13。水产动物中，目前常见将太子参作为饵料添加在南美白虾和福瑞鲤中的研究。如王芸等报道经过复方中草药投喂南美白对虾能有效改善其抵御病害侵染的能力，而且根据投喂时间的延长而改善能力也不断提高14。李义等用黄芪等多种中草药作为饵料增添剂，能有效提高罗氏沼虾的免疫功能15。但是迄今为止，将太子参及其他的中草药作为饵料添加剂应用在大黄鱼中的研究还尚未见报道。本论文以大黄鱼为研究对象，尝试将以太子参为主的中草药作为饵料添加剂应用在大黄鱼饲料中，通过分析大黄鱼体内谷胱甘肽还原酶基因表达的变化，在一定水平上分析中草药添加剂对大黄鱼抗氧化酶系的影响，也为中草药影响鱼类免疫的研究提供基础数据。 2材料和方法2.1 材料2.1.1 主要试剂和仪器设备TB Green Premix Ex Taq（Perfect Real time）TM、rTaq DNA Polymerase、dNTP均购于大连宝生物公司。DNA Marker购自北京智达汇成科技有限公司。引物由上海生物科技公司合成。Trizol试剂购自生工。2.2 方法2.2.1 实验动物的选择、分组及试验设计实验所用大黄鱼来源于宁德市鼎诚水产有限公司自行繁育的健康、规格一致，平均体长（23.45±0.83）cm，体质量（34.05±8.23）g的大黄鱼幼鱼。养殖于6个养殖桶中，分别为对照组（C）和实验组（E），按科学的饲养方法进行饲养管理。对照组投喂商品化饵料，实验组添加太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天等中草药，各实验组中添加的中草药不同，添加终量分别为0.5%（太子参组）和1%（其他中草药组）如表2-1所示，喂养周期30 d。30 d后分别对实验组和对照组大黄鱼进行取样。每组随机取3尾健康个体，进行活体解剖，分离得到的肾组织固定在Trizol裂解液中，超低温冰箱保存备用。表2-1 实验组中草药的具体添加量Table 2-1 the specific amount of herbal medicine added in the experimental group组别组分用量（%）E1太子参0.5E2太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天各0.167（总1.0）E3太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天太子参0.5，其他各0.1（总1.0）E4太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓各0.111（总1.0）E5太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓、太子参0.5，其他各0.0625（总1.0）2.2.2 总RNA提取用Trizol法提取RNA，提取方法按照说明书要求，具体如下：1、研磨 取1.5 ml EP管加入30-50 mg组织块加入装有1 ml Trizol的离心管中，将离心管插在装有碎冰的烧杯上进行研磨，直至没有大块组织为止。2、研磨之后配平，放在冰上静置5 min，在4、12000g转速下离心5 min。将上清液移入新的离心管中，再用移液枪取1/5体积氯仿混合摇匀，置冰上5 min，温度、转速同上离心15 min。3、用合适的移液枪取上清，加入等量的预冷异丙醇（为了沉淀RNA），震荡混合，-20下静置20 min，温度、转速同上离心10 min。取上清时需注意宁可少取也不要取到中层蛋白和下层基因组溶液，若取到则对后续RNA纯度品质造成污染。4、将上清液弃去后取1 毫升75%乙醇对RNA沉淀进行洗涤，条件同上离心5 min后干燥（干燥需干燥至EP管壁无残留乙醇，若残留乙醇过多可以用灭菌过的枪头吸出，干燥至RNA沉淀由乳白转至渐透明之间，则干燥完全），加无核酸酶水20-30 L，于-80冰箱保存备用。2.2.3 RNA凝胶电泳1.制胶：用电子天平称取2.4 g的琼脂糖于烧杯中，加20 ml 1X TAE电炉加热溶解放凉，加入2 L核酸染色剂，倒入制胶模具，待凝固成型。2.点样：将RNA样本与RNA上样缓冲液（Loading Buffer）进行混合，将混合后的RNA样本依次点入对应的胶孔，设定程序121V，15 min，开始电泳。3.将电泳完成的胶用凝胶成像设备观察，验证其完整性。2.2.4 RNA定量分析将RNA样品用超微量分光光度(Thermo Scientific)测定其在260和280nm的吸收值，并将RNA样品浓度记录保存用于后面实验。2.2.5 RNA反转录以RNA样品为模板，按照PrimeScript IV 1st strand cDNA Synthesis Mix(Takara)试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成，总反应体系为10 L（如表2-2）。表2-2反转录各引物Table 2-2 reverse transcription of each primer引物名称各引物含量（L）5×Buffer2Enzyme Max 0.5OligdT0.5Random 6 mers0.5RNA1-3水加至10 2.2.6 实时荧光定量PCR根据大黄鱼基因组数据库中的基因序列设计引物，以-actin作为内参基因(引物序列表2-3)，采用TB Green 预混合 Ex TaqTM (Takara)试剂盒，以相对荧光定量PCR方法检测基因，每个反重复两次。12.5 L反应体系如下：6.25 L TB Green 预混合 Ex TaqTM (TaKaRa)，上下游引物均为0.5 l（2 M），取1 L的cDNA 进行1:10稀释，4.25 L 水。循环参数：在温度为95摄氏度下预变性五分钟，进行40 个循环：95 15 s，60 45 s。PCR反应后分析熔解曲线。重复两次实验，取平均值进行分析。所有基因的相对表达量用2-Ct 计算，所得数据用SPSS 19.0 （社会科学统计软件包）统计数据，然后采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）平均值的差异显著性（P0.05）。表 2-3 大黄鱼实时荧光定量PCR引物Tab.2-3 Primers used for real-time PCR analysis from L. crocea基因名称 正向引物 反向引物gene name forward primer reverse primer 谷胱甘肽还原酶 GR AGCCAAAACAGCCGTGAT CGGCTAACATAAGCATCCC-actin TCGTCGGTCGTCCCAGGCAT ATGGCGTGGGGCAGAGCGT3 实验结果及分析3.1 总RNA纯度及完整性分析通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测分析RNA的浓度和完整性。本实验得到的RNA，经过电泳以后，发现18s、28s条带清晰，无明显smear，说明RNA具有较高的完整性（图3-1）。RNA的OD值测定是检测RNA质量的重要指标，RNA的OD260/280在1.8-2.0之间，说明其质量较好，完整性较高，若比值大于2.2说明RNA存在降解，比值小于1.8则可能存在污染。本实验获得的的OD260/280均值在1.7-2.1，（表3-1），表明提取的RNA质量高，可用于后续实验。图3-1 部分RNA电泳图Figure 3-1 partial RNA electrophoresis diagram表3-1RNA的定量结果Table 3-1 The quality and quantity of RNA 样品编号OD260/280浓度（g/L）样品编号OD260/280浓度（g/L）Ki-E1-11.810.87Ki-E4-12.091.80Ki-E1-22.101.64Ki-E4-22.121.50Ki-E1-32.061.30Ki-E4-32.101.02Ki-E2-11.911.41Ki-E5-11.931.40Ki-E2-22.051.24Ki-E5-22.031.33Ki-E2-32.031.41Ki-E5-32.031.21Ki-E3-12.011.33Ki-C12.031.12Ki-E3-21.901.44Ki-C22.021.55Ki-E3-32.091.72Ki-C31.931.30注：Ki（Kidney）为肾脏，E为实验组，C为对照组3.2 熔解曲线分析特异性引物的熔解曲线分析如图3-2所示，结果表明，熔解曲线呈现单峰，说明引物有良好的特异性以及准确的定量结果。图3-2 GR溶解曲线分析结果Figure 3-2 Results of GR dissolution curve3.3 谷胱甘肽还原酶的基因表达水平3.3.1中草药在大黄鱼肾组织中谷胱甘肽还原酶的基因表达水平图3-2 中草药在大黄鱼肾组织中谷胱甘肽还原酶的基因表达水平.FIG.3-2 The gene expression  of glutathione reductase in kidney of Chinese croaker.中草药在大黄鱼肾组织中谷胱甘肽还原酶的基因表达水平如图3-2所示。可以看出，与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降，E2、E3组的GR基因的表达量下降最多，均为72%，E1组的表达量下降最少为38%，但是各组间无明显的差异性（P大于0.05）。4讨 论4.1 中草药的应用及其作用中草药一般由多种成分组成，相对复杂，但由于每种成分的相互促进，使得每味中草药不仅能表现出其主要的功能，其他的协助作用也能表达，对机体的生理功能起到重要的调节作用，是简单的化学合成药物不能比较的。中草药之所以能有效提高水产动物的胸腺、骨髓、脾和肾等免疫器官的指数，是因为含有糖类、黄酮类、蛋白质多肽类、醌类化合物和生物碱等生物活性物质16-17。此外，中草药的有效成分还可以显著提高生物体的固有免疫物质的活性，如CAT、SOD、GSH-PX、溶菌酶、磷酸酶、补体成分3、补体成分4等16,18 。有试验表明在凡纳滨对虾的饲喂添加复方中草药饲料，其肝胰脏和肠道消化酶活性显著提高19；由党参、茯苓、甘草、白术和黄芪组成的中草药配方，其中黄芪是常用于提高免疫力的中草药，这个配方能够抑制自由基，阻止脂质过氧化反应，在一定程度上降低丙二醛的生成，同时，不仅能增强奶山羊的抗氧化能力，也能提高其血清和乳腺组织中抗氧化酶的活性，增强其抗氧化能力20；黄芪、党参、女贞子的组方不仅增加了绵羊屠宰体增重以及改善了其血液抗氧化功能，还促进了谷胱甘肽还原酶（GR）和超氧化物歧化酶(SOD）活性，降低了血浆MDA含量15。4.2 投喂中草药对大黄鱼谷胱甘肽还原酶基因表达的影响 本论文通过在基础饲料中添加太子参等中草药，饲喂大黄鱼，分析基因的相对表达变化，率先分析中草药对大黄鱼肾组织中谷胱甘肽还原酶基因表达的影响。不同实验组中的表达结果显示，大黄鱼在饲喂中草药后，GR基因的表达发生变化，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降，其中E2、E3（太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天）组的GR基因的表达量下降最多，均为72%。生物体内存在的活泼自由基会破坏其机体内的结构。例如会损伤组织细胞以及导致细胞膜结构的损坏。中草药中还包含有很多的抗氧化物质，这些物质成分不仅能抑制自由基的生成，也能阻止生物体内的自由基进行氧化。同时，自由基对机体的损害也可以通过利用中草药的活性物质来抑制，中草药含有的多种活性物质能够对生物机体内的抗氧化物质的抗氧化作用起到促进的作用。除此之外，为改善或者促进机体内自由基的清除，我们可以充分利用超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)之间的相互促进作用，对机体内的自由基起到一定的清除作用，促进机体内自由基的清除，从而保护器官（如脾、心脏、肾等）免受损伤、降低过氧化反应及其降解产物的累积以提高机体的抗病免疫能力。其中谷胱甘肽在体内利用自由基和巯基（-SH）结合转化成易代谢的酸性物质，进而对氧自由基的排出起到促进作用。同时谷胱甘肽作为GSH-PX和GST两者的底物，能有效阻止脂质过氧化产物的生成、对细胞恢复功能起到关键作用、对细胞内含巯基的酶的活性有保护作用以及阻止因巯基氧化引起的蛋白质变性，从而进一步降低自由基对DNA的攻击、对DNA的损害和突变22。而GR作为一种黄素蛋白氧化还原酶，对于维持机体内还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽比的稳定性和保持氧自由基平衡有着关键作用23。 4.3 总结从本实验结果得出大黄鱼在投喂中草药添加剂之后，肾组织的GR表达量均呈现不同程度的下降，但各组之间均无显著性差异，说明中草药的有效成分虽然可能通过多种渠道抑制自由基对生物体的破坏以及在一般情况下生物体内会不断产生多种多样的抗自由基的活性物质，自身也能持续地清除自由基，以此来保护机体免受损害，但因本实验的中草药组分复杂、剂量不单一，可能存在一定的排斥作用导致部分有效活性组分表达不出来。本实验研究是在基因表达层面上的分析，基因的功能最终要体现在蛋白质即酶活的水平，基因表达层面和蛋白表达层面的表达变化规律，或许会不一样，下一步的工作是要从酶活的水平上分析该基因及其他的抗氧化酶的活性变化。总之，中草药作为饵料添加剂可以提高水产动物的免疫性能，但是考虑到生物体内复杂的生物学变化，本研究后续还有很多工作需要进行。致 谢论文的写作，是四年时间里的最后一次系统地和最有深度地学习。在写作的字斟句酌过程中，真正将之前对有关专业的一知半解和分散知识点转化为准确且为自己所有的知识。论文的完成既是一次考验，又是一次收获。在整个四年学习过程中，不仅仅收获了专业知识，更多的是学会如何思考、实践和表达，还有战胜自己。庆幸在这段时光中所遇到的恩师益友，无论在学习还是生活上都给予了我无私的帮助和指引，让我在诸多方面都有所成长。感恩四年里留给我的这笔宝贵财富，在今后的生活实践中都将使我受益匪浅。其次，感谢我的室友们，从遥远的家来到这个陌生的城市里，是你们和我共同维系着彼此之间亲人般的感情，维系着寝室那份家的融洽，感谢四年里一直以来在学习中的沟通和帮助，在生活中的包容、理解和鼓励，同样从你们那受益良多。感谢我的爸爸妈妈，感恩之情非言语能表达。焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿。导师的教诲，同学间无瑕的友情，家人深切的期望，都是我今后人数道路中不断前进的最大动力!在论文即将完成之际，我的情绪无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮忙，请接受我诚挚的谢意!参考文献1 李倩,李焱,周铜水.新鲜丹参根酸水解产物及其抗氧化活性研究犤J.安徽医药,2017,21(10):1785-1789.2 陈瑷,周攻自由基医学基础与病理生堙M.北京:人民卫生出版社,2002.131147.3 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