【生物】基因工程的基本操作程序第一课时 2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptx

情境导入情境导入转基因抗虫棉你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤呢？1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。非转基因抗虫棉转基因抗虫棉第三章 基因工程3.2 基因工程的基本操作程序基因表达载体培育转基因抗虫棉的四个步骤与载体拼接与载体拼接 普通棉花普通棉花（无抗虫特性）（无抗虫特性）棉花细胞棉花细胞抗虫棉抗虫棉（有抗虫特性）（有抗虫特性）导入导入抗虫基因抗虫基因重组重组DNADNA分子分子1.1.目的基因的目的基因的筛选与获取筛选与获取2.2.基因表达基因表达载体的构建载体的构建3.3.将目的基因将目的基因导入受体细胞导入受体细胞4.4.目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定一、一、目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。1.概念：主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子2.实例：转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。苏云金芽孢杆菌产生Bt 基因伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）表达破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫导入抗虫棉培育棉花细胞3.目的基因的筛选：方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对4.目的基因的获取：获取目的基因的方法：从基因文库中获取人工合成利用PCR获取和扩增目的基因PCR .PCR是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。DNA半保留复制体外PCR扩增仪控制温度*利用PCR获取和扩增目的基因聚合酶链式反应要点回顾:体内DNA复制要点回顾:体内DNA复制解旋酶DNA聚合酶模板：原料：能量：酶：DNA的两条母链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶复制特点:边解旋边复制 半保留复制碱基互补配对原则条件复制原则:ATPDNA体内复制所需的基本条件:参与的组分参与的组分在在DNADNA复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶DNADNA母链母链4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸引物是一小段能与 的一段碱基序列_的_DNA母链互补配对短单链核酸35DNA母链35引物35引物35DNA母链（通常20-30个核苷酸）在PCR技术中，解旋没有用解旋酶，而是利用DNA的热变性和复性原理当温度超过90时，双链DNA解聚为单链。当温度下降到50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。当温度上升到72左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。变性延伸复性变性变性90-9590-95C C延伸延伸7272C C复性复性5050C C整个过程可整个过程可以在以在PCRPCR仪仪中自动完成中自动完成循环循环3030轮轮左右左右PCRPCR管管 每循环一次，目的基因增加1倍9255753553Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因PCR技术原理图解：925575变性3553925575退火925575延伸925575变性925575退火925575延伸925575变性925575退火视频：PCR反应过程 由于由于一个一个循环得到的循环得到的产物产物又可以作为又可以作为下一个下一个循环的循环的模板模板，因而，因而每每一次循环后一次循环后目的基因的量可以目的基因的量可以增加一倍增加一倍。即成即成 形式扩增形式扩增（约为约为 ，其中，其中n n为为扩增循环的次数扩增循环的次数）指数指数2n常采用常采用琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳来鉴定来鉴定PCRPCR的产物。的产物。变性变性9090以上以上延伸延伸7272左右左右复性复性5 500左右左右基本过程PCR的结果：PCR产物的鉴定：n代后，DNA分子有_个n代后，DNA链有_条第_代出现完整的目的基因n代后，含引物的DNA分子有_个n代后，含其中一种引物的DNA分子有_个n代后，共消耗_个引物第n代复制，消耗了_个引物n代后，完整的(等长）目的基因有_个2n2n+132n2n+1-22n2n-2n2n-1根据PCR技术找出以下规律：图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：1PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。不是完整的模板DNA分子；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段2.图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？535535第三次循环33第3轮；1/44图2是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列），都不合理，请分别说明理由。第1组：；第2组：。引物和引物会因局部发生碱基互补配对而失效引物自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效3如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。5要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5端分别添加上限制酶的识别序列6如果循环n次，则共需消耗多少对引物？共需消耗2n1对引物思考:获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解 不能原因那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？二、二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心 位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段，RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录。位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段，终止转录。1.目的：2.组成鉴别和筛选出含有目的基因的受体细胞注意：目的基因必须插入到 与 之间DNA复制的起始位点，DNA聚合酶识别和结合位点使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可以，并且可以遗传遗传给下一代，给下一代，同时使目的基因能够同时使目的基因能够表达表达和和发挥作用发挥作用。启动子 终止子辨析：辨析：“启动子与终止子启动子与终止子”和和“起始密码子与终止密码子起始密码子与终止密码子”启动子与终止子位于DNA分子中，作用：起始和终止转录过程。启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，作用：起始和终止翻译过程。获取目的基因3.过程重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点DNA连接酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。限制酶限制酶基因表达载体构建模式图载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接 正向连接 反向连接11221221221 12.使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况?补充补充知识点：知识点：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质。(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落)33不能转录不能转录为信使为信使RNARNA，不能编码不能编码蛋白质。蛋白质。能能转录转录相应的信使相应的信使RNARNA，能编码能编码蛋白质蛋白质 编码区编码区：非非编码区编码区原核原核细胞的细胞的基因基因结构结构有有调控调控遗传信息表达的核苷酸遗传信息表达的核苷酸序列，序列，包括包括启动子和终止子启动子和终止子非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：补充补充知识点：知识点：2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构35非编码区非编码区非编码区非编码区内含子内含子 外显子外显子 转录转录mRNAmRNA前体前体加工加工翻译翻译肽链肽链启动子启动子终止子终止子成熟成熟mRNAmRNA编码区编码区真核细胞的真核细胞的基因结构基因结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列有有调控作用调控作用的核苷酸序列，包括位于的核苷酸序列，包括位于编码区编码区上游上游的的RNARNA聚合酶聚合酶结合位点等结合位点等原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有和具有调控作用的调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的原核细胞与真核细胞的基因结构比较基因结构比较连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码