2023年发酵工程实验指导书.docx

试验一红曲霉液态发酵制备红曲色素一、试验目的1、了解和把握常规育种原理、方法和根本技术；2、生疏试验室液体发酵根本技术；3、把握发酵产物提取工艺和分析检测的一般技术。二' 试验用品恒温摇床、恒温培育箱、灭菌锅、紫外分光光度计、电子天平、药物天平、高速离心机、烘 箱、pH计、红曲霉菌种、乙醇、葡萄糖、饴糖、大米粉、麦芽糖、麦芽膏、蛋白陈、酵母膏、 牛肉膏、氯化镂、甘油、硫酸镁、谷氨酸钠、硫酸镂、硝酸镂、淀粉、常用玻璃仪器等。三、试验步骤1、依据以下工艺流程图，设计具体实施方案并完成试验；液体发酵工艺流程：培育基制备一一接种一一发酵一一提取一一分析检测2、紫外分光光度法测定红曲色素色价；四、试验要求1、具体的设计方案在实施前交指导教师审核；2、要求随时观看记录试验现象；3、考察碳氮源对发酵的影响；五、试验报告要求1、每小组1份试验方案，每人1份试验报告；2、试验报告中要求对每一步操作和现象做出具体记录并解释；六、思考题1、所提取的红曲色素主要由哪些色素组成？2、红曲色素发酵是厌氧还是好氧发酵？附红曲霉相关资料红曲色素的测定承受GB4926-85法，测定方法是称取红曲米样品0.50g,放入100ml带刻度具磨口塞试管 中，参加70%乙醇至50ml,置60水浴保温2h,冷却，滤纸过滤，吸取滤液1.0ml于25ml 容量瓶中，70%乙醇稀释定容至25ml,分光光度计505nm处测定OD值，测定色价。色素色 价即为测得样品吸光度(OD值)乘以稀释倍数。红曲色素含量测定方法取l()ml研磨均匀的发酵液，400()r/min下离心15min,去上清液，沉淀参加8 () %乙醇2 0 m 1 , 6 0c保温4 h , 4000r/min离心15min,取上清液。浸提四次，合并提取液，用8 0 %乙 醇稀释，于5 10nm处测定其O D值。液态发酵培育红曲霉的最正确培育基组成为可溶性淀粉70g/L,黄豆饼粉10g/L,酵母浸膏10g/L, MgSO4 lg/L, NaNO3 2g/L, NaH2PO4 Ig/L；最正确发酵条件为培育基初始pH值为45 接种 量16%,装液量150mL/300mL,发酵时间为6d,红曲霉的酯化力达0.4678g/100mL。斜面保藏培育基1:68%米曲汁，可溶性淀粉2%,蛋白陈1%,琼脂2%,冰醋酸少许。斜面保藏培育基2：12度的麦芽汁琼脂培育基，pH5.0种子培育基1：葡萄糖 3%,黄豆饼粉 3%, NaN030.2%, MgSO4 -7H.0 0.1%液体种子培育基：玉米粉 1%,葡萄糖 2%,蛋白陈 1%, KH2PO40.25%, MgSO40.05% , pH5.0o斜面培育基：马铃薯2 0 % ,葡萄糖1.5 % ,琼脂2 % ,玉米粉1% ,接种后于3 2 培育15 2 0d。500ml 接30管。福建古田红曲霉斜面配方饴糖水:6-8%Be (换算成百分浓度12-16%), 100mL可溶性淀粉5%蛋白陈3%琼脂2-2.5%培育温度28-32 7天小米抱子培育基：250ml三角瓶中加25g 小米，水20mL接种后32培育1520d。种子培育基：可溶性淀粉3%, NaNO30.3%,酵母膏0.5%, KH2PO40.15%, MgSO4 -7H2O 0.05%o 调整pH5.5,接种后于32, 180r/min培育2d。发酵培育基：碳源、氮源由试验确定，另参力1().1%KHFO4和。.05%MgSO4 7H°O,调整pH 值到5.5,25()1111三角瓶装液量120-1501111,接种量1()%(V/V),接种后于32c 18()r/min培育96h。试验二 酵母培育中的基质代谢、呼吸和生长的参数检测与参数相关分析一、试验目的微生物的生长受自身代谢特性和环境的影响，比方在不同的介质中同一种菌的代谢特性和代 谢速率会不一样，不同的生长阶段菌的代谢也会不同。在分批培育中，随着微生物的生长，基 质的利用，代谢产物的积存，环境发生变化，从而对微生物代谢产生影响。所以测定代谢过 程的参数，如菌浓度、基质浓度、pH、溶氧浓度等，并对这些参数的时序变化进展分析及动 力学分析，可以使人们对微生物培育过程有一个量化的了解，所以检测代谢参数是过程掌握 与优化的根本前提，其中基质代谢、氧的消耗与菌体生长亲热相关。本试验力图使学生把握测定菌体浓度、基质消耗、呼吸相关的各种参数的方法，以及学会 分析这些参数的时序变化和相互间的关系。一种参数可以有不同的检测方法，本试验将选取在实际应用中比较常见的检测工程，使学 生通过试验能把握常用参数的测定方法，并且将实时测定的数据进展时序分析和多参数的关 联分析使学生对代谢的网络化有一个初步的生疏。二、试验原理在需氧代谢中，菌体生长是以基质代谢和氧的消耗为根底的，由于他们供给了生长所需要 的前体物质和能量，而且从基质和氧的消耗速率也可以反映菌生长的状况和阶段。本试验在15 L发酵罐中进展酵母培育，可保证发酵全过程生长条件的全都性较之摇瓶）， 对菌的生长代谢分析有参数的稳定性和牢靠性。酵母的生长以葡萄糖为碳源，随着葡萄糖的 利用，酵母生长同时也会产生代谢副产物一一小分子酸，因此要用氨水调整 pHo氨水消耗的多 少与糖代谢相关。分批发酵中，酵母生长会消灭延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期等阶段，通过测定菌 量就可以了解生长状况与阶段。三、器材与试剂1 .种子培育基配方（1L）酵母提取物10 g、蛋白陈20 g、葡萄糖20 g、pH 5.5o2 .发酵培育基配方（1L）酵母提取物10 g、蛋白陈20 g、葡萄糖20 g、灭菌前pH 5.5,泡敌0.1 %3 .补糖配方（1L）葡萄糖 200 g、K2HPO410 g> MgSO4 H2。l6g、NH4C1 1.4 go4 .葡萄糖测定SBA -40型谷氨酸（乳酸）-葡萄糖双功能生物传感测定，详见第四章试验五十三。5 . 15 L全自动发酵罐电极标定（1） pH电极标定将pH电极连上电极线，将发酵罐pH电极标定掌握屏幕上的斜率和截距分别设置为1和0；将电极插入pH 6.86 （称为标1）的标准缓冲液中，等pH显示的读数稳定后读取读数称为 测1）。拿出电极，用去离子水冲洗电极，并用卷筒纸轻轻的吸干电极头上的水，然后插入pH 4.00称为标2）的标准电极缓冲液中，等pH显示的读数稳定后读取读数称为测2）。电极 的斜率由下式计算得到：（标1-标2） 电极斜率=0口初在发酵罐的掌握屏幕上输入斜率，再把电极插入pH 6.86标准溶液中看pH读数与标准缓 冲液值得差距，调整截距，使读数等于标准缓冲液pHo这时的截距就是标定的截距。（2）溶氧电极的标定将发酵罐溶氧电极标定掌握屏幕上的斜率和截距分别设置为1和0;在培育基灭菌温度到 达115 0c时，调整显示屏上的斜率读数使溶氧读数为零，此时的斜率读数即为标定的斜率。 接种完毕后发酵开头时，调整截距使溶氧读数在80 %左右，此时的截距为标定的截距。四、试验操作LAG。与菌体干重的关系测定酵母是单细胞生物，它在液体中呈单个悬浮状态，因此可以通过测定发酵液的吸光度来得 知菌生长量。由于发酵液略显黄色，因此选择的波长要对黄色光吸取尽量地少，本试验选择 600 nm,测量A600o菌体干重测定的具体方法如下：取10mL发酵液，冷冻离心，转速10 000 r/min,离心lOmin,弃去上清液，得到湿菌体， 在95 枯燥箱枯燥12 h,称取干重并除以10。绘图计算得到Ab。与菌体干重的关系：菌体干重（g/mL） =aX A + b6002.基质代谢和菌体生长的关系1）种子培育基的配制及种子培育种子培育基的配制：依据种子培育基配方，配制1200 mL培育基，并用盐酸调好pH,分 装到11个500 mL的摇瓶中，每瓶100mL,用松棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸包扎好瓶口。放 入高压灭菌锅115 ,灭菌15 min。 接种：在超净工作台上用无菌接种针挑取一针斜面菌种，接入已灭菌的种子培育乐观， 包扎好瓶口，没接种一瓶种子需换一根接种针，以免染菌。 种子培育：放入30 摇床培育，转速230240 r/min,培育16 h。2）发酵培育基配制及养分发酵培育基配制：依据发酵培育基配方，计算出10 L培育液所需各成分的含量并称取。 用自来水溶解后装入发酵罐，定容至7.5 Lo用高压蒸汽直接通入发酵罐灭菌，灭菌体积掌握 在9L。灭菌条件：115 , 15 mine接种：将培育好的种子10瓶，在超净工作台上合并成2瓶，并用无菌棉塞塞好，待接种。 火焰接种法从发酵罐的接种口倒入种子，盖上接种口盖子，撤去火圈，调整溶氧浓度到80%0 余下的一瓶种子用于菌体干重测定。发酵过程掌握：培育温度：30 ；搅拌转速：200 r/min；溶氧浓度20%以上，当溶氧 低于20%时增加转速，提高供氧；残糖浓度掌握在0.5%左右，低于（）.5%时流加20%葡萄 糖，流速依据糖耗速率调整。（3）菌浓度测定发酵6 h开头取样每隔2 h取样一次，至12 h以后每隔4 h从发酵罐取出30 mL发酵液， 取其中1 mL适当稀释后用分光光度计在600 nm波长下测定吸光度（A6（）0）,要求人6。0值在 0.20.6之间，依据Ab。-干重曲线计算干重，绘制菌生长曲线，即菌体干重对时间的变化 曲线。（4）糖消耗曲线每隔4 h从发酵罐取出30 mL发酵液，取其中10 mL, 3000 r/min离心。取0.5 mL上清液 残糖。测定残糖用葡萄糖测定仪。绘制糖消耗曲线，即糖浓度对时间的变化曲线。（5）氨水消耗曲线每隔4 h记录一次氨水消耗的体积（mL）,绘制氨水消耗曲线。（6）提高溶氧的影响因素当溶氧低于20%时，分别实行提高转速或增加通气量来增加溶氧，比较两种调整方法的 效果。五、试验内容及安排第一天1 .试验原理及要求讲解。2 .配制种子培育基，灭菌。3 .标定pH电极。4 . 21:00接种、摇床培育。其次天1. 8:15配制发酵培育基，进罐灭菌。2. 12:45 移种。3. 13:00罐发酵培育。4. 取样，测定菌浓、残糖。5. 每小时按发酵批报工程记录各发酵参数。第三天1 .按发酵批报时间取样。2 .测定菌浓、残糖。3 .依据残糖进展补料。第四天1 .按发酵批报时间取样。2 .测定菌浓、残糖。3 . 13:00罐发酵完毕，放罐。4 .数据整理与计算处理。第五天撰写试验报告。六、数据记录（表2-1）表2-1发酵条件及酵母培育记录表种子编 号日期发酵批 号时间斜面接 种时间总发酵 时间0/0#2/1#4/2#6/3#8/4#12/5#16/6#种子接 种时间日期发酵接 种时间时间总发酵 时间20/7#24/8#28/9#32/10#36/11#40/12#42/13#发酵 条件葡萄 糖g/L酵母 粉g/L蛋白 陈g/L总体 积/L灭菌前pH灭菌后pH接种 pHpH 斜率pH 截距溶氧 斜率溶氧 截距发酵 温度发酵 pH操作 时间日期时间发酵总时间操作 类型/操作 参数转速/( r min1)NaOH /g状态 参数溶氧/%pH温度/糖/( g L-i)A600七、数据处理1 .计算基质得率常数Yx/So2 .绘制酵母生长速率曲线、基质消耗速率曲线。3 .绘制酵母生长曲线、基质消耗曲线、氨水补加曲线。4 .比较糖消耗与菌体生长、氨水消耗的关系。八、试验报告主要内容1 .试验原理与目的。2 .每天试验内容和原始数据记录。3 .数据总汇。4 .数据计算与分析。5 .试验体会、小结与建议意见。九、思考题6 .试验中如何保证无菌条件？7 .发酹罐培育基灭菌，蒸汽从哪里进入，哪里排出？如何操作？8 .为了到达要求的灭菌后体积，灭菌前的培育基体积应如何确定？9 .接种量如何计算？假设10 L培育液要求接种量10%,种子应培育多少?10 实行调整通气量或转速来提高溶氧，哪种方法效果更显著？11 糖消耗与菌体生长、氨水消耗有什么相关性？12 在分批培育中菌生长速率有什么特点？