氨基酸分析 .ppt

1第二章第二章 氨基酸分析氨基酸分析2 苯丙苯丙酮酮尿症尿症（PKU）是一种常）是一种常见见的氨基酸代的氨基酸代谢谢病，病，是由于是由于苯丙氨酸苯丙氨酸（Phe）代）代谢谢途径中的途径中的酶酶缺陷，使得缺陷，使得苯丙氨酸不能苯丙氨酸不能转变转变成成为为酪氨酸，酪氨酸，导导致苯丙氨酸及其致苯丙氨酸及其酮酮酸蓄酸蓄积积，并从尿中大量排出。，并从尿中大量排出。本病在本病在遗传遗传性氨基酸代性氨基酸代谢谢缺陷疾病中比缺陷疾病中比较较常常见见，其，其遗遗传传方式方式为为常染色体常染色体隐隐性性遗传遗传。临临床表床表现现不均一，主要不均一，主要临临床特征床特征为为智力低下、精神神智力低下、精神神经经症状、湿疹、皮肤抓症状、湿疹、皮肤抓痕征及色素脱失和鼠气味等、痕征及色素脱失和鼠气味等、脑电图脑电图异常。如果能得异常。如果能得到早期到早期诊诊断和早期治断和早期治疗疗，则则前述前述临临床表床表现现可不可不发发生，生，智力正常，智力正常，脑电图脑电图异常也可得到恢复。异常也可得到恢复。苯丙酮尿症（PKU）3病因病因:苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一。正常人每日需要苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一。正常人每日需要的的摄摄入量入量约为约为200500毫克，其中毫克，其中1/3供合成蛋白，供合成蛋白，2/3则则通通过过肝肝细细胞中苯丙氨酸胞中苯丙氨酸羟羟化化酶酶（PAH）的）的转转化化为为酪氨酸，酪氨酸，以合成甲状腺素、以合成甲状腺素、肾肾上腺素和黑色素等。苯丙氨酸上腺素和黑色素等。苯丙氨酸转转化化为为酪氨酸的酪氨酸的过过程中，除需程中，除需PAH外，外，还还必必须须有四有四氢氢生物蝶呤生物蝶呤（BH4）作）作为辅为辅酶酶参与。基因突参与。基因突变变有可能造成相关有可能造成相关酶酶的活的活性缺陷，致使苯氨酸性缺陷，致使苯氨酸发发生异常累生异常累积积。治疗治疗:主要是饮食疗法。开始治疗的年龄愈小，效果愈好。主要是饮食疗法。开始治疗的年龄愈小，效果愈好。苯丙酮尿症（PKU）1.氨氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在75200Da之间，其化学通式为之间，其化学通式为R-CH(NH2)-COOH，在生物体，在生物体内出现的氨基酸都是内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生物来源的多肽中出型，仅在少数微生物来源的多肽中出现现D型氨基酸。型氨基酸。2.氨氨基酸分析技术的发展始于基酸分析技术的发展始于1820年，由年，由Braconnot最早最早将甘氨酸从白明胶水解物中分离出将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来。来。3.色色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。1941年，年，Martin等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，Moore、Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在1958年，年，Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析制造了自动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是经典的方法。经典的方法。氨基酸分析氨基酸分析组成蛋白质的组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外、都种氨基酸除甘氨酸外、都有一个不对称碳原子，即有一个不对称碳原子，即-碳碳原子原子。-碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和氢原子和R基团，不同氨基酸的基团，不同氨基酸的R基团不同。基团不同。每种氨基酸有每种氨基酸有D-构型和构型和L-构型，蛋白质中构型，蛋白质中的氨基酸都是的氨基酸都是L-构型。构型。RHCCOOH_NH2_氨基酸的基本结构及性质氨基酸的基本结构及性质6 氨基酸的基本结构及性质氨基酸的基本结构及性质n氨基酸是分子中氨基酸是分子中含有含有氨基和羧基氨基和羧基的一类化合物。的一类化合物。n组成蛋白质的氨基酸只有二十种。其中有组成蛋白质的氨基酸只有二十种。其中有八种八种为为人人体必需体必需氨基酸。氨基酸。n人体必需的氨基酸：人体内不能合成，只有靠食物人体必需的氨基酸：人体内不能合成，只有靠食物供给的氨基酸供给的氨基酸。n各种蛋白质含氨基酸的种类和数量都各不相同。各种蛋白质含氨基酸的种类和数量都各不相同。7中文名称英文名称三字母缩写单字母缩写分子量等电点甘氨酸GlycineGlyG75.076.06丙氨酸AlanineAlaA89.096.11缬氨酸ValineValV117.156.00亮氨酸LeucineLeuL131.176.01异亮氨酸IsoleucineIleI131.176.05苯丙氨酸PhenylalaninePheF165.195.49色氨酸TryptophanTrpW204.235.89酪氨酸TyrosineTyrY181.195.64天冬氨酸Aspartic acidAspD133.102.85组氨酸HistidineHisH155.167.60天冬酰胺AsparagineAsnN132.125.41谷氨酸Glutamic acidGluE147.133.15赖氨酸LysineLysK146.199.60谷氨酰胺GlutamineGlnQ146.155.65甲硫氨酸MethionineMetM149.215.74精氨酸ArginineArgR174.2010.76丝氨酸SerineSerS105.095.68苏氨酸ThreonineThrT119.125.60半胱氨酸CysteineCysC121.165.05脯氨酸ProlineProP115.136.302020种氨基酸的中英文名称及缩写种氨基酸的中英文名称及缩写 人体必需氨基酸人体必需氨基酸赖氨酸赖氨酸 H2N(CH2)4CHCOOH缬氨酸缬氨酸 CH3CHCHCOOH蛋氨酸蛋氨酸CH3SCH2CHCOOH苏氨酸苏氨酸 CH3CHCHCOOH亮氨酸亮氨酸CH3CHCH2CHCOOH苯丙氨酸苯丙氨酸 CH2CHCOOH异亮氨酸异亮氨酸CH3CH2CHCHCOOH色氨酸色氨酸 CH2CHCOOH2、几种常见的氨基酸、几种常见的氨基酸 名称名称俗称俗称结构简式结构简式氨基乙酸氨基乙酸-氨基丙酸氨基丙酸-氨基氨基-苯基丙酸苯基丙酸 -氨基戊二酸氨基戊二酸 甘氨酸甘氨酸 丙氨酸丙氨酸 谷氨酸谷氨酸 苯丙氨酸苯丙氨酸 10氨基酸的分类氨基酸的分类1 1、根据氨基酸的酸碱性、根据氨基酸的酸碱性酸酸性性氨氨基基酸酸碱碱性性氨氨基基酸酸中中性性氨氨基基酸酸氨基酸氨基酸11酸性氨基酸酸性氨基酸二个羧基二个羧基一个氨基一个氨基天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸碱性氨基酸碱性氨基酸一个羧基一个羧基二个或二个以上氨基二个或二个以上氨基赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸组氨酸组氨酸中性氨基酸中性氨基酸一个羧基一个羧基一个氨基一个氨基实际水溶液呈弱酸性实际水溶液呈弱酸性：电离能力电离能力 COOH NH2122 2、根据氨基酸的化学特性、根据氨基酸的化学特性疏水性：疏水性：Ala Val Leu Ile Phe Pro Met带电：带电：Arg Lys Asp Glu(His)极性：极性：Ser Thr Cys Asn Gln His Tyr Trp特殊：特殊：Gly(Pro)氨基酸的分类氨基酸的分类13带电氨基酸带电氨基酸14极性氨基酸极性氨基酸15氨基酸的立体化学氨基酸的立体化学 由蛋白质水解的氨基酸都为由蛋白质水解的氨基酸都为-氨基酸，除甘氨氨基酸，除甘氨酸外，所有酸外，所有-C-C都为手性碳原子。都为手性碳原子。天然的氨基酸均为天然的氨基酸均为L-L-氨基酸氨基酸16-CDEP修修饰饰的的Fe3O4磁微球用于手性化合拆分磁微球用于手性化合拆分图图3.9 不同功能化磁微球作用不同功能化磁微球作用DL-色氨酸后毛色氨酸后毛细细管管电电泳分离泳分离图图(A)以及相以及相对应对应的峰面的峰面积图积图(B)，(a)0,(b)100,(c)200,(d)300 mg17氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质v1.溶解度溶解度v2.熔点熔点:高高v3.旋光性有旋光性旋光性有旋光性v4.味感：味感：D-氨基酸大氨基酸大多带甜味，多带甜味，L-氨基酸有氨基酸有苦、甜、鲜、酸等四种苦、甜、鲜、酸等四种不同味感。不同味感。v1.两性性质：氨基酸分子两性性质：氨基酸分子中含有氨基及羧基，使其既中含有氨基及羧基，使其既能象酸又能象碱一样解离；能象酸又能象碱一样解离；v2.与甲醛作用：与甲醛作用：v3.与与2,4-二硝基氟苯作用：二硝基氟苯作用：v4.与茚三酮的作用：与茚三酮的作用：v5.与异硫酸苯酯的作用：与异硫酸苯酯的作用：v6.与荧光胺的作用：与荧光胺的作用：v7.与与5,5-双硫基双硫基-双双(硝基硝基苯甲酸苯甲酸)反应反应18等电点等电点概念：概念：将氨基酸水溶液的酸碱度加以适当地调节，使氨基将氨基酸水溶液的酸碱度加以适当地调节，使氨基酸的酸性电离程度与碱性电离程度相等。此时，氨基酸带酸的酸性电离程度与碱性电离程度相等。此时，氨基酸带有的正电荷数目和负电荷数目相等，此溶液的有的正电荷数目和负电荷数目相等，此溶液的pH值称为值称为氨基酸的等电点，用氨基酸的等电点，用 pI 表示。表示。在等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀在等电点时，氨基酸的溶解度最小，易沉淀等电点可用酸碱滴定方法测定，也可通过等电点可用酸碱滴定方法测定，也可通过pK值计算值计算侧链无解离基团时：侧链无解离基团时：pI=(pK1+pK2)/2侧链有解离基团时侧链有解离基团时,pI相当于氨基酸的两性离子状态两相当于氨基酸的两性离子状态两侧的基团侧的基团pK值和的一半值和的一半19pH=pI净电荷为零净电荷为零在电场中不移动在电场中不移动pH pI带负电荷带负电荷等电点等电点要使氨基酸达到等电状态：要使氨基酸达到等电状态：中性氨基酸：中性氨基酸：pI pH 7 pI pH 7 加少量酸加少量酸酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI pH 7 pI pH 7 pI pH 7 加碱加碱20与茚三酮的显色反应与茚三酮的显色反应水合茚三酮水合茚三酮CO221蓝紫色化合物蓝紫色化合物 根据根据COCO2 2的量或蓝紫色的深浅程度的量或蓝紫色的深浅程度 作为作为-氨基酸定量分析的依据。氨基酸定量分析的依据。与茚三酮的显色反应与茚三酮的显色反应22氨基酸的斑点分析氨基酸的斑点分析 大多数氨基酸不含有特征发色基团。因此，氨基酸的大多数氨基酸不含有特征发色基团。因此，氨基酸的分析依赖于分析依赖于衍生化反应衍生化反应。n对衍生化试剂的要求是对衍生化试剂的要求是反应快反应快，并且，并且 产物与试剂本身的产物与试剂本身的光谱性质有明显的差异光谱性质有明显的差异。n常用的衍生化试剂常用的衍生化试剂有有2 2，4-4-二硝基氟二硝基氟 苯、荧光胺苯、荧光胺及邻苯二甲醛等。及邻苯二甲醛等。n根据产物性质的不同，衍生化试剂可分为根据产物性质的不同，衍生化试剂可分为显色显色剂剂及及荧光衍生化试剂荧光衍生化试剂两大类。两大类。23斑点显色分析法斑点显色分析法 茚三酮茚三酮是氨基酸的斑点显色分析中非常简单的是氨基酸的斑点显色分析中非常简单的衍生化试剂。衍生化试剂。它可以与它可以与一级和二级胺一级和二级胺在酸性介质中在酸性介质中pHpH（3 34 4）加热反应，反应产生氨、二氧化碳和）加热反应，反应产生氨、二氧化碳和蓝蓝-紫色紫色的络合物的络合物。一级和二级胺的检测波长分别为。一级和二级胺的检测波长分别为570570和和440nm440nm。若二者同时存在，一般在。若二者同时存在，一般在500 nm500 nm处测处测定，灵敏度有所降低。定，灵敏度有所降低。24另一种常用的显色反应试剂是另一种常用的显色反应试剂是2 2，4-4-二硝基氟苯二硝基氟苯，它可以与样品中氨基酸及一级和二级胺反应，生它可以与样品中氨基酸及一级和二级胺反应，生成成黄色络合物黄色络合物，检测波长在，检测波长在420nm420nm。该法测定的。该法测定的是是氨基酸的总量氨基酸的总量。斑点显色分析法斑点显色分析法25斑点荧光分析法斑点荧光分析法荧光胺荧光胺是用于氨基酸分析的高灵敏荧光衍是用于氨基酸分析的高灵敏荧光衍 生化试剂，可用于氨基酸的表面分析，如生化试剂，可用于氨基酸的表面分析，如 薄层色谱。薄层色谱。邻苯二甲醛（邻苯二甲醛（OPAOPA）是用于氨基酸荧光分是用于氨基酸荧光分 析的另一种常见的衍生化试剂。析的另一种常见的衍生化试剂。26色谱方法测定氨基酸色谱方法测定氨基酸离子交换色谱法离子交换色谱法反相色谱分析法反相色谱分析法液相色谱液相色谱-质谱法质谱法毛细管电泳法毛细管电泳法气相色谱法气相色谱法27离子交换色谱法离子交换色谱法离子交换色谱的离子交换色谱的基本原理基本原理是基于带电荷的阴阳离是基于带电荷的阴阳离 子与带相反电荷的离子交换基团的相互作用。子与带相反电荷的离子交换基团的相互作用。氨基酸、肽和蛋白质在溶液中带电荷，可与离子氨基酸、肽和蛋白质在溶液中带电荷，可与离子 交换基团产生静电作用而保留。交换基团产生静电作用而保留。其其固定相固定相应具有分离效能高、物化性质稳定、柱应具有分离效能高、物化性质稳定、柱 容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和 构象完好。构象完好。28阳离子交换树脂阳离子交换树脂：强酸型磺酸化的：强酸型磺酸化的 聚苯乙烯聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。二乙烯基苯共聚物。阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：只有在特殊情况下只有在特殊情况下 用于强酸性氨基酸的分析。用于强酸性氨基酸的分析。离子交换色谱法离子交换色谱法291 1、直接检测法、直接检测法 离子交换色谱法用于氨基酸分析时，可在离子交换色谱法用于氨基酸分析时，可在200nm200nm处对各种氨基酸进行直接检测，检出限处对各种氨基酸进行直接检测，检出限在在1 110 pmol10 pmol之间。之间。30（1 1）选择性差选择性差：生物样品中多种内源：生物样品中多种内源 性成分在性成分在200 nm200 nm处均有吸收；处均有吸收；（2 2）背景高背景高：HPICHPIC常用的各种溶剂在常用的各种溶剂在 200 nm 200 nm处也有吸收。处也有吸收。直接检测的缺点直接检测的缺点312 2、柱后衍生化法、柱后衍生化法衍生化是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。衍生化是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直接用紫外大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直接用紫外法检测，需要先将氨基酸衍生为具有法检测，需要先将氨基酸衍生为具有较强紫外较强紫外或或荧光吸荧光吸收收的衍生物。的衍生物。为了提高灵敏度及选择性，一般采用柱后衍生化，再用为了提高灵敏度及选择性，一般采用柱后衍生化，再用紫外或荧光法对产物进行检测。紫外或荧光法对产物进行检测。常用衍生化试剂：茚三酮、邻苯二甲醛、荧光胺。常用衍生化试剂：茚三酮、邻苯二甲醛、荧光胺。32柱后衍生化法的优点柱后衍生化法的优点1 1、几乎不需要样品处理步骤，蛋白质水解产物可以、几乎不需要样品处理步骤，蛋白质水解产物可以直接进样分析直接进样分析；2 2、反应产物与副产物的混合物、反应产物与副产物的混合物无需分离无需分离；3 3、离子色谱柱的稳定性高，因而样品间的、离子色谱柱的稳定性高，因而样品间的重现性好重现性好；4 4、反应无需完成，产物也可以是多种。只要混合时、反应无需完成，产物也可以是多种。只要混合时间及反应产物的比例是一定的，则分析的重现性间及反应产物的比例是一定的，则分析的重现性就不会受到影响。就不会受到影响。5 5、对反应产物的稳定性要求低，因为反应及检测几、对反应产物的稳定性要求低，因为反应及检测几乎是同时进行的。乎是同时进行的。33氨基酸分析仪氨基酸分析仪 原理：原理：采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。析。两种系统：两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。钠盐系统一次最多分析约钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸；锂盐系统一次最多分析约种氨基酸；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸。种氨基酸。分析效果：分析效果：灵敏度（最低检测限）比灵敏度（最低检测限）比HPLC柱前衍生方法柱前衍生方法稍低以外（稍低以外（HPLC：0.5pmol；氨基酸分析仪：；氨基酸分析仪：10pmol)，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，都优于其他分析方法。，都优于其他分析方法。35氨基酸分析仪氨基酸分析仪日立日立71807180全自动生化仪全自动生化仪样品的制备样品的制备（一）蛋白质的水解（二）游离氨基酸样品的制备（三）生理体液样品的前处理（一）蛋白质的水解（一）蛋白质的水解 用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在的都要进行水解处理，水解方法有三种：1、酸水解法：标准水解法，水解彻底，但色氨酸被破坏。2、碱水解法：用NaOH作为水解剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏氨酸等被破坏。3、酶水解法：水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破环，但水解时间长，而且不易水解完全。（二）游离氨基酸样品的制备（二）游离氨基酸样品的制备 游离氨基酸的样品在分析前必需进行磨碎、脱脂、提取、脱盐、去蛋白、脱色等处理。在进行分析前建议使用C18小柱处理一下。（三）生理体液样品的处理（三）生理体液样品的处理 生理体液的样品首先要除去样品中的蛋白质，获得游离氨基酸。除去蛋白质化学方法为：1、苦味酸法 2、三氯乙酸法 3、乙醇沉淀法 4、磺基水杨酸法（常用的方法）41反相色谱分析法反相色谱分析法反相色谱法是以反相色谱法是以表面非极性载体为固定表面非极性载体为固定 相相，以极性，以极性溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。反相色谱分析法的反相色谱分析法的效率效率比离子色谱法比离子色谱法高高；用于氨基酸分析一般采用用于氨基酸分析一般采用柱前衍生化柱前衍生化。衍生化不仅可。衍生化不仅可以提高氨基酸被检测的信号强度，而且可以提高氨基以提高氨基酸被检测的信号强度，而且可以提高氨基酸的疏水性，从而可以用反相色谱法进行分离。酸的疏水性，从而可以用反相色谱法进行分离。42HPLCHPLC法测定复合氨基酸胶囊中氨基酸的含量法测定复合氨基酸胶囊中氨基酸的含量43HPLCHPLC法测定复合氨基酸胶囊中氨基酸的含量法测定复合氨基酸胶囊中氨基酸的含量4445HPLC-蒸发光散射法蒸发光散射法46反相高效液相色谱法与离子交换色谱法测定氨基酸对比反相高效液相色谱法与离子交换色谱法测定氨基酸对比47反相高效液相色谱法与离子交换色谱法测定氨基酸对比反相高效液相色谱法与离子交换色谱法测定氨基酸对比48反相高效液相色谱法与离子交换色谱法测定氨基酸对比反相高效液相色谱法与离子交换色谱法测定氨基酸对比49液质联用法液质联用法大多数氨基酸本身不具有紫外吸收大多数氨基酸本身不具有紫外吸收,也不发射荧光也不发射荧光,不能直不能直接检测；接检测；传统的氨基酸分析方法为离子交换色谱法传统的氨基酸分析方法为离子交换色谱法,该方法操作繁琐该方法操作繁琐,成本高成本高;目前多用反相高效液相色谱法目前多用反相高效液相色谱法,分析周期至少需要分析周期至少需要半小时以上半小时以上,后来发展起来高效毛细管电泳法。后来发展起来高效毛细管电泳法。虽然有较虽然有较大改进大改进,但仍需要采用化学衍生技术及梯度洗脱以提高其分但仍需要采用化学衍生技术及梯度洗脱以提高其分离、检测性能离、检测性能,衍生化的缺点是费时费力而且损害准确性衍生化的缺点是费时费力而且损害准确性,而且而且 完全依靠保留时间来定性完全依靠保留时间来定性,准确度不高；准确度不高；LC-MS联用技术利用三级四极质谱仪的分离和定性能力联用技术利用三级四极质谱仪的分离和定性能力,提供了可靠的、精确的相对分子量和结构信息提供了可靠的、精确的相对分子量和结构信息,显著提高了显著提高了准确度、灵敏度准确度、灵敏度,操作非常简单操作非常简单,节省了样品准备时间和分节省了样品准备时间和分析时间析时间。50液质联用法液质联用法51液相色谱液相色谱 -质谱联用技术分析质谱联用技术分析1818种游离氨基酸种游离氨基酸5253毛细管电泳具有毛细管电泳具有微量微量、灵敏灵敏和和柱效高柱效高的的 特点，特点，适合于氨基酸适合于氨基酸手性分离手性分离和复杂样和复杂样 品中的氨基酸品中的氨基酸分析。分析。用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用 两种分两种分离模式：离模式：毛细管区带电泳毛细管区带电泳和和胶束电动毛细管电胶束电动毛细管电泳泳。检测方式主要有检测方式主要有紫外法紫外法和和荧光法荧光法。毛细管电泳法毛细管电泳法54毛细管电泳法可以进行毛细管电泳法可以进行柱前、柱内和柱后衍生化柱前、柱内和柱后衍生化。柱内衍生化柱内衍生化要求反应速度快，一般采用串联或要求反应速度快，一般采用串联或 “夹心饼夹心饼”两种形式，具有两种形式，具有试剂和样品用量少试剂和样品用量少的的 优点。优点。柱后衍生化柱后衍生化可以避免柱前或柱内衍生化时其他可以避免柱前或柱内衍生化时其他 化合物对衍生反应的干扰，缺点是柱后反应装化合物对衍生反应的干扰，缺点是柱后反应装 置体积大，会引起色谱峰变宽而降低分离效果。置体积大，会引起色谱峰变宽而降低分离效果。毛细管电泳法毛细管电泳法55毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸56毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸57毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸毛细管电泳法快速测定血清中游离氨基酸58气相色谱法气相色谱法气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、柱效高、容易和质谱联用等优点。柱效高、容易和质谱联用等优点。氨基酸含有羧基、羟基、氨基和硫基等极氨基酸含有羧基、羟基、氨基和硫基等极 性基团，需要先对其性基团，需要先对其衍生化衍生化。59两步法两步法是先将羧基用短碳链脂肪醇酯化，是先将羧基用短碳链脂肪醇酯化，然后再用各种酸酐将然后再用各种酸酐将N-N-（OO、S S）基团乙酰）基团乙酰 化。化。一步法一步法是用烃基氯甲酰酯在水、醇类和吡是用烃基氯甲酰酯在水、醇类和吡 啶介质中将氨基酸一步衍生化生成啶介质中将氨基酸一步衍生化生成烃基碳烃基碳 氧酰烃基酯氧酰烃基酯。衍生化方法衍生化方法60氨基酸选择性反应的分析方法氨基酸选择性反应的分析方法1 1、显色分析法、显色分析法2 2、荧光法、荧光法3 3、微生物方法、微生物方法4 4、酶分析法、酶分析法61显色分析法显色分析法有几种显色试剂只有当干扰物预先除去后有几种显色试剂只有当干扰物预先除去后才有定量分析的价值。才有定量分析的价值。在有些情况下可以通过改变试剂的组成或在有些情况下可以通过改变试剂的组成或反应条件以便进行某一种氨基酸的选择性反应条件以便进行某一种氨基酸的选择性测定。测定。62荧光法荧光法色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在紫外光照射下色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在紫外光照射下会产生荧光，其它氨基酸与某些有机试剂反应会产生荧光，其它氨基酸与某些有机试剂反应之后其产物才会产生荧光。之后其产物才会产生荧光。相对于显色法，荧光分析法的相对于显色法，荧光分析法的选择性和灵敏度选择性和灵敏度要好要好。63微生物方法微生物方法微生物方法用于氨基酸分析的微生物方法用于氨基酸分析的原理原理是：有些微生物是：有些微生物的生长和复制需要特定氨基酸的存在。的生长和复制需要特定氨基酸的存在。在有限量的氨基酸存在下微生物的生长将受到限制。在有限量的氨基酸存在下微生物的生长将受到限制。利用利用浊度分析法浊度分析法或或测定乳酸生成量的增加测定乳酸生成量的增加可对微生可对微生物的生长进行评价。物的生长进行评价。微生物方法适合于各种生物样品，可用于大量样品微生物方法适合于各种生物样品，可用于大量样品的批量分析，而且分析耗费低。的批量分析，而且分析耗费低。64酶分析法酶分析法一种酶对氨基酸某一种异构体的特异性可一种酶对氨基酸某一种异构体的特异性可 以用于以用于D D或或L L型氨基酸的测定。在这一应用型氨基酸的测定。在这一应用 中氨基酸氧化酶非常有用。中氨基酸氧化酶非常有用。65存在的问题及发展趋势存在的问题及发展趋势氨基酸分析中最主要的问题是来自氨基酸分析中最主要的问题是来自环境的氨基环境的氨基酸的干扰酸的干扰；微量氨基酸的分析微量氨基酸的分析仍然是一个富有挑战性的课仍然是一个富有挑战性的课题；题；氨基酸构型分析及手性拆分氨基酸构型分析及手性拆分也是国内外研究的也是国内外研究的热点。热点。66研究应用研究应用-测定血浆中氨基酸测定血浆中氨基酸67研究应用研究应用-口服水解蛋白成分分析口服水解蛋白成分分析68研究应用研究应用-羊肉氨基酸成分分析羊肉氨基酸成分分析69研究应用研究应用-鱼肉中氨基酸含量分析鱼肉中氨基酸含量分析70研究应用研究应用-慢性肝病研究慢性肝病研究思考：思考：分析多肽的结构特点，思考为什么蛋白质的种类如此丰富？分析多肽的结构特点，思考为什么蛋白质的种类如此丰富？练习题：练习题：有有2个甘氨酸和个甘氨酸和2个丙氨酸，发生成肽反应，能有几种产物？个丙氨酸，发生成肽反应，能有几种产物？思考题：思考题：有有3个甘氨酸和个甘氨酸和3个丙氨酸，发生成肽反应，能有几种产物？个丙氨酸，发生成肽反应，能有几种产物？本章作业：本章作业：茚三酮是鉴定氨基酸的最简便方法，查阅文献，茚三酮是鉴定氨基酸的最简便方法，查阅文献，写一篇利用茚三酮鉴定氨基酸在实际应用中的写一篇利用茚三酮鉴定氨基酸在实际应用中的小论文。小论文。