酶联免疫吸附试验 .ppt

酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验Enzymeslinkedimmunosorbentassay简简 介介19711971年，瑞典学者年，瑞典学者EngvailEngvail和和PerlmannPerlmann、荷兰学者、荷兰学者Van SchuursVan Schuurs分别报道将免疫技术发展为分别报道将免疫技术发展为检测体液中检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验试验。ELISA ELISA 就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。应相结合而建立的一种新技术。该技术应用非常广泛，几乎所有的该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性可溶性抗原抗原-抗抗体系统均可用以检测。体系统均可用以检测。酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。而证明发生了相应的免疫反应。所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量。或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量。基基 本本 原原 理理l先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性并保持其免疫活性。l测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。l用洗涤的方法洗去多余的分离抗原用洗涤的方法洗去多余的分离抗原-抗体复合物和抗体复合物和游离成分。游离成分。l然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。量测定。1 1，固，固 相相 载载 体体固相载体在固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常中载体的材料很多，最常用的是用的是聚苯乙烯聚苯乙烯。聚苯乙烯聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。的价格低廉，所以被普遍采用。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以小试管。以微量滴定板微量滴定板最为常用，专用于最为常用，专用于EILSA的产的产品称为品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为板，国际上标准的微量滴定板为812的的96孔式孔式。聚苯乙烯聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的因此，每一批号的ELISA板在使用前须事板在使用前须事先检查其性能。先检查其性能。常用的检查方法为：常用的检查方法为：以一定浓度的人以一定浓度的人IgG（一般为（一般为10ng/ml）包被包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于数之差，应小于10%。2 2，包，包 被被抗原或抗体固定到固相载体过程称为抗原或抗体固定到固相载体过程称为包被包被(coating)。抗抗原原或或抗抗体体蛋蛋白白质质与与聚聚苯苯乙乙烯烯固固相相载载体体是是通通过过物物理理吸吸附附结结合合的的，靠靠的的是是蛋蛋白白质质分分子子结结构构上上的的疏疏水水基基团团与与固固相载体表面的疏水基团间的作用力相载体表面的疏水基团间的作用力。这这种种物物理理吸吸附附是是非非特特异异性性的的，受受蛋蛋白白质质的的分分子子量量、等等电电点点、浓浓度度等等的的影影响响。载载体体对对不不同同蛋蛋白白质质的的吸吸附附能能力力是是不不相相同同的的，大大分分子子蛋蛋白白质质较较小小分分子子蛋蛋白白质质通通常常含含有有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgGIgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在FcFc段上，抗体结合点暴露于外，段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。不易吸附不易吸附在聚苯乙烯载体上的在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗例如，在检测抗DNADNA抗体时，需用抗体时，需用DNADNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如30W30W紫外灯，紫外灯，75cm75cm照射照射1212小时），以增加小时），以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的物素化的DNADNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入酶联免疫试无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入酶联免疫试剂盒板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。剂盒板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的抗心磷脂抗体的ELISAELISA，酶联免疫试剂盒试剂一般采用这种包被方式。，酶联免疫试剂盒试剂一般采用这种包被方式。3 3，封，封 闭闭封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后其后的步骤中干扰物质的再吸附。的步骤中干扰物质的再吸附。封闭是否必要，封闭是否必要，取决于取决于ELISA模式及具体的实验条件。并非所模式及具体的实验条件。并非所有的有的ELISA均需封闭，封闭不当反而会使阴性均需封闭，封闭不当反而会使阴性OD增高。增高。一般说来，一般说来，双抗体夹心法双抗体夹心法，只要，只要酶标记物是高酶标记物是高活性活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被单抗腹水直接包被时，时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在但在间接法间接法测定中，封闭一般是不可少的。测定中，封闭一般是不可少的。抗原抗体反应特点抗原抗体反应特点1 1，抗原抗体反应，抗原抗体反应l可逆性可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡。种动态平衡。解离后的的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲解离后的的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯抗体或抗原（亲和层析纯抗体）。和层析法来提纯抗体或抗原（亲和层析纯抗体）。l最适比例最适比例在恒定量的抗体中加入递增量的抗原可以形成抗体在恒定量的抗体中加入递增量的抗原可以形成抗体复合物。该反应曲线的高峰部分是抗原抗体比例最复合物。该反应曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。即出现假阳性或假阴性。体过剩带和抗原过剩带。即出现假阳性或假阴性。l特异性特异性抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。高度的特异性。这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物中测定某一特定物质，而不需要先分离待测物。合物中测定某一特定物质，而不需要先分离待测物。2 2，敏感性，敏感性在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感水平，酶反应测定法的敏感度约为度约为510g/ml，免疫测定中凝胶扩散法和，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应相仿。浊度法的敏感度与酶反应相仿。而酶标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍，而酶标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍，达达ng/ml水平水平。方方 法法 类类 型型酶联免疫吸附试验的主要技术类酶联免疫吸附试验的主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、竞型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。争法、捕获法等。1 1，双抗体夹心法：，双抗体夹心法：此法常用于检测抗原此法常用于检测抗原它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和和B分分别与固相载体上的抗体别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体和酶标记抗体B结合，结合，形成形成抗体抗体A-待测抗原待测抗原-酶标抗体酶标抗体B复合物复合物，复合，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。性反应类型。本法只适用于二价或二价以上大分子抗原，而本法只适用于二价或二价以上大分子抗原，而不能用于测定半抗原等小分子物质。不能用于测定半抗原等小分子物质。抗抗 体体 A A待测抗原待测抗原酶标抗体酶标抗体B包被物包被物2 2，间接法测定抗体，间接法测定抗体此法常用于测定抗体此法常用于测定抗体将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原抗原-待待测抗体测抗体-酶标二抗的复合物酶标二抗的复合物，复合物的形成量，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。抗抗 原原待测抗体待测抗体酶标二抗酶标二抗包被物包被物l此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。l间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的包被的1/10乃至于乃至于/100。3 3，竞，竞 争争 法法此法既可用于检测抗原和半抗原的此法既可用于检测抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体定量测定，也可用于测定抗体用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。度与待测物含量成反比。限量的的抗体限量的的抗体酶标抗原酶标抗原 样品抗原样品抗原酶标多于样品酶标多于样品显色程度深显色程度深样品多于酶标样品多于酶标显色程度浅显色程度浅显色程度与待测物含量成反比显色程度与待测物含量成反比包被物包被物4 4，捕获法（反向间接法），捕获法（反向间接法）主要用于测定血清中某种抗体亚成分主要用于测定血清中某种抗体亚成分以目前最常用的以目前最常用的IgM测定为例，因血清中针对某测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性种抗原的特异性IgM和和IgG同时存在，而后者可同时存在，而后者可干扰干扰IgM的测定。因此，先针对的测定。因此，先针对IgM的第二抗体的第二抗体(如羊抗人如羊抗人IgM链抗体）连接于固相载体，用以链抗体）连接于固相载体，用以“捕获捕获”样品中所有样品中所有IgM；洗涤除去；洗涤除去IgG等无关等无关物质，然后加入特异性抗原与待测物质，然后加入特异性抗原与待测IgM结合；再结合；再次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二抗抗-IgM-抗原抗原-酶标抗体复合物，加酶底物显色后，酶标抗体复合物，加酶底物显色后，即可对待即可对待IgM进行定性和定量测定。进行定性和定量测定。针对针对IgM的第二抗体的第二抗体待测物待测物其中含有其中含有IgM和和IgG特异性抗原与特异性抗原与IgM结合结合酶标抗体酶标抗体包被物包被物IgGIgG等无关物质等无关物质被洗脱被洗脱5 5，ABS-ELISAABS-ELISAABSABS为亲和素、生物素系统的略语。亲和素与为亲和素、生物素系统的略语。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1 1个个亲和素分子有亲和素分子有4 4个生物素分子的结合位置个生物素分子的结合位置，可，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与亲和素和生物素与ELISELIS偶联起来，就可大提高偶联起来，就可大提高ELISAELISA的敏感度的敏感度。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISAELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素酶结合物，以放大反应信号。后连接亲和素酶结合物，以放大反应信号。l生物素生物素-亲和素酶联吸附试验（亲和素酶联吸附试验（BA-ELISABA-ELISA）：待检抗原与固相抗体反应后，再加入生物素化待检抗原与固相抗体反应后，再加入生物素化第二抗体，形成抗原第二抗体，形成抗原-抗体抗体-生物素化第二抗体复生物素化第二抗体复合物，然后与酶标亲和素作用，并通过底物而合物，然后与酶标亲和素作用，并通过底物而显色。显色。抗抗体体包被物待测抗原待测抗原生物素化二抗生物素化二抗酶标亲和素酶标亲和素l生物素生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验亲和素复合物酶联免疫吸附试验（ABC-ELISAABC-ELISA）：）：l抗体与待检抗原作用，再与生物素化第二抗体结抗体与待检抗原作用，再与生物素化第二抗体结合形成抗原合形成抗原-抗体反应体系，抗体反应体系，l再加入亲和素与酶标记生物素按一定比例共温形再加入亲和素与酶标记生物素按一定比例共温形成的亲和素成的亲和素-生物素生物素-过氧化酶复合物（过氧化酶复合物（ABCABC），使），使之与生物素化抗抗体作用，之与生物素化抗抗体作用，l此时，此时，ABCABC中尚未饱和的亲和素结合部位可与抗中尚未饱和的亲和素结合部位可与抗抗体分子上生物素结合，从而形成抗体分子上生物素结合，从而形成ABCABC标记体系，标记体系，最后通过底特显色。最后通过底特显色。本法相当敏感，适用于检测微量抗体。本法相当敏感，适用于检测微量抗体。抗抗体体待待测测抗抗原原生物素化的二抗生物素化的二抗生物素生物素-过氧化酶过氧化酶包被物包被物亲亲和和素素（从链霉菌中提取的链霉亲和素）（从链霉菌中提取的链霉亲和素）具具 体体 步步 骤骤l包被包被l封闭封闭l加待测物加待测物l加一抗，二抗加一抗，二抗，或抗原等，或抗原等l显色显色包包 被被l用用包被液包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶稀释包被抗体至合适浓度，包被酶联板（聚乙烯微量反应板），每孔联板（聚乙烯微量反应板），每孔100。l用保鲜膜包好用保鲜膜包好，4过夜。过夜。如急用，包被如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好后，清洗也可用，但最好过夜。过夜。l次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。l用用PBST洗液，洗洗液，洗45次。次。每次在每次在洗板机洗板机清洗酶联板上震荡清洗酶联板上震荡23min后，后，在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步。在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步。包包被被液液0.05MPH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液Na2 2CO3 31.59g；NaHCO3 32.93g；加蒸馏水至加蒸馏水至1000mlPBST洗洗液液2000mlPBS+1mlTween-20PBS：NaCl8g；KCl0.2g；Na2 2HPO4 41.42g；KH2 2PO4 40.27g；加加1000ml蒸馏水定容，调蒸馏水定容，调PH至至7.4洗洗板板机机封封 闭闭l用用封闭液封闭液封闭，每孔封闭，每孔100。室温下，在微量振荡器上，封闭室温下，在微量振荡器上，封闭2h。l弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。l用用PBST洗液，洗洗液，洗45次。（同包被）次。（同包被）l用保鲜膜包好，用保鲜膜包好，4可保存一个月。可保存一个月。封封闭闭液液l 10%10%小牛血清小牛血清（1ml1ml小牛血清加到小牛血清加到9ml 19ml 1PBSPBS中混匀）。中混匀）。l 5%5%脱脂奶粉（用洗液稀释）脱脂奶粉（用洗液稀释）脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用。高质量的速特点是价廉，可以高浓度使用。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。应用。加标准样及样品加标准样及样品l待测样或标准一抗：待测样或标准一抗：用用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔洗液进行稀释到适合浓度，每孔100l，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器上孵育上孵育2小时。清洗。小时。清洗。l二抗：二抗：用用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔洗液进行稀释到适合浓度，每孔100l，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器上孵育上孵育1小时。清洗。小时。清洗。注注意意l 抗体抗原反应比较快，一般抗体抗原反应比较快，一般1212个小时就个小时就达到峰值。延长反应时间容易出现非特异达到峰值。延长反应时间容易出现非特异结合，但反应时间不能少于结合，但反应时间不能少于1.51.5小时。小时。l 二抗的使用浓度（一般，二抗的使用浓度（一般，1 1：1000010000稀释）稀释）应当进行预实验确定，二抗的反应时间不应当进行预实验确定，二抗的反应时间不能过长，容易出现非特异反应。一般，反能过长，容易出现非特异反应。一般，反应应40604060分即可。分即可。OPD OPD 显显 色色l临用前取临用前取A A液液5.14ml5.14ml，B B液液 4.86ml4.86ml加入加入OPD(OPD(邻苯二胺，在邻苯二胺，在-20-20中保存）中保存）0.0040g0.0040g（约（约4 4小片），溶解后加入小片），溶解后加入50l50l的的30%H30%H2 2OO2 2，配成显色液。（，配成显色液。（OPDOPD要充分混要充分混匀，否则容易出现个别孔颜色太深）匀，否则容易出现个别孔颜色太深）l 显色液每孔显色液每孔100l100l。避光显色。避光显色1520min1520min。l 用用2mol2molL HL H2 2SOSO4 4终止反应，每孔终止反应，每孔50l50l显显色色液液lA液：液：0.2molLNa2HPO4Na2HPO412H2O71.7g加水至加水至1000mllB液：液：0.1molL柠檬酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸19.2g柠檬酸，加水至柠檬酸，加水至1000ml结结 果果 判判 定定酶标测定仪检测（酶标测定仪检测（429nm429nm），），测定测定ODOD值：值：待测孔（待测孔（P P）与对照孔（）与对照孔（NN）的比值（）的比值（P P：NN）大于）大于1.51.5或或2 2者为阳性者为阳性注意：要有阴性，阳性对照注意：要有阴性，阳性对照。影影 响响 因因 素素1 1 标本的影响标本的影响l溶血标本及混有红细胞的血清采用溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISAELISA法检测法检测易产生假阳性易产生假阳性可能是溶血血清中含有过氧化酶物质可能是溶血血清中含有过氧化酶物质l标本受细菌污染标本受细菌污染 因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶l标本保存不当标本保存不当在冰箱中保存过久的标本，在间接法在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISAELISA测定中会导致本底过深、测定中会导致本底过深、造成假阳性造成假阳性l塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性内会使样本内抗原含量下降造成假阴性l标本凝固不全标本凝固不全 血清中仍残留部分纤维蛋白原血清中仍残留部分纤维蛋白原2 2 试试 剂剂 影影 响响ELISAELISA检测试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂检测试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，使用质劣的灵敏度与特异性存在一定的差别，使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此，试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此，选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。3 3 操作技术的影响操作技术的影响 l吸量的准确性吸量的准确性吸量不准确，直接影响检测结果。因此加样器也要经常清洗，吸量不准确，直接影响检测结果。因此加样器也要经常清洗，定期校准定期校准 l温浴影响温浴影响抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求 l加样次序影响加样次序影响 有时我们在加样过程中，常常会遇到个别标本未离心等情况，有时我们在加样过程中，常常会遇到个别标本未离心等情况，为了节约时间，往往这时我们会先加酶结合物，然后等标本分为了节约时间，往往这时我们会先加酶结合物，然后等标本分离好后再加标本，这样常常会造成假阴性。离好后再加标本，这样常常会造成假阴性。l洗涤方法对结果的影响洗涤方法对结果的影响 洗涤是洗涤是ELISAELISA操作的重要环节，手洗条件一致性较差，对结果影操作的重要环节，手洗条件一致性较差，对结果影响较大，全自动洗板机使用不当也会影响结果响较大，全自动洗板机使用不当也会影响结果4 4 干扰物质的影响干扰物质的影响有人认为大约有人认为大约40%40%的人血清标本中含有非特异的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果性干扰物质，可以不同程度影响检测结果 ；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其他物常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其他物质等质等CD4+CD4+、CD8+CD8+检测试剂盒检测试剂盒lBA-ELISABA-ELISAl双抗体夹心双抗体夹心ABC-ELISAABC-ELISAl用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，l往包被抗体的微量孔中依次加入往包被抗体的微量孔中依次加入待测待测T T淋巴细胞、生物素化的抗淋巴细胞、生物素化的抗CD4+CD4+抗体、抗体、HRPHRP（辣根（辣根过氧化物酶）过氧化物酶）标记的亲和素标记的亲和素l经过彻底洗涤后用底物经过彻底洗涤后用底物TMBTMB显色。显色。TMBTMB（四甲基联苯胺是一种脂溶性较强的基团，因此容（四甲基联苯胺是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的易进入细胞与细胞器中的HRPHRP反应）反应）在经过氧化物酶的在经过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的颜色的深浅和样品中的CD4+CD4+呈正相关。用酶标仪在呈正相关。用酶标仪在450 450 nmnm波长下测定吸光度（波长下测定吸光度（ODOD值），计算样品浓度。值），计算样品浓度。CD4+BA-ELISACD4+BA-ELISA检测试剂盒检测试剂盒应应 用用ELISA ELISA 法由于测定灵敏、特异、操作简便、法由于测定灵敏、特异、操作简便、酶标记试剂比较稳定、易于自动化、无反酶标记试剂比较稳定、易于自动化、无反射性污染，且易与其他相关技术偶联，使射性污染，且易与其他相关技术偶联，使其成为目前应用最广泛而且发展最快的一其成为目前应用最广泛而且发展最快的一种免疫测定技术。市场上符合质量要求的种免疫测定技术。市场上符合质量要求的商品试剂盒（提供有包装好的固相载体、商品试剂盒（提供有包装好的固相载体、酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂成酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂成分）和自动或半自动检测仪不断研究发明分）和自动或半自动检测仪不断研究发明问世，极大地促进了问世，极大地促进了ELISAELISA测定技术的普及。测定技术的普及。ELISAELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为根据已经使用的结果，认为ELISAELISA法具有灵敏、法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。ELISAELISA法在生物医学各领域的应用范围法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：日益扩大，可概括四个方面：1 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。2 2、研究抗酶抗体的合成。、研究抗酶抗体的合成。3 3、显现微量的免疫沉淀反应。、显现微量的免疫沉淀反应。4 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。、定量检测体液中抗原或抗体成份。所有血清学试验要注意所有血清学试验要注意l 为了达到定量检测的目的，所用的检测试剂为了达到定量检测的目的，所用的检测试剂中必须至少有一个试剂是可检测的纯品中必须至少有一个试剂是可检测的纯品l 必须有一种分离方法使得结合的标记物与没必须有一种分离方法使得结合的标记物与没有结合、游离的成分分开，这样才能测定特异有结合、游离的成分分开，这样才能测定特异性结合的百分比。性结合的百分比。谢谢大家！谢谢大家！